Este estudo fornece um protocolo padrão para estudar a diferenciação de células Th17, um subconjunto de células T auxiliares que desempenham um papel fundamental nas respostas imunes. Por meio da transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, os cientistas podem estudar a função particular dos genes na regulação da diferenciação Th17. Este estudo emprega a tecnologia CRISPR-Cas9 para edição precisa de genes e utilizou a transdução retroviral para direcionar com eficiência genes específicos em células T primárias.
A citometria de fluxo é usada para avaliar a eficiência da transdução e monitorar a diferenciação celular. As polarizações Th17 in vitro são conduzidas para estimular a diferenciação de células T CT4+. Nossa pesquisa visa preencher as lacunas na compreensão de como genes específicos regulam a diferenciação Th17.
Estamos usando o CRISPR-Cas9 junto com a transdução retroviral, que oferece uma alternativa mais rápida e econômica aos modelos tradicionais de camundongos knockout. Nosso protocolo não apenas detalha a transdução retroviral de células T CD4, mas também fornece um guia abrangente sobre nosso treinamento de sequências de sgRNA e construção de plasmídeos, que é negligenciado em outros protocolos. Este artigo descreve cada etapa do processo experimental, garantindo que outros pesquisadores possam replicar facilmente a metodologia.
Para começar, use a ferramenta CRISPick para projetar o RNA guia único para nocaute ROR Gamma T. Defina o genoma de referência para Mouse GRCM 38 e especifique a sequência PAM como NGG, com base no sistema de guia CRISPRko. Digite o nome do gene alvo na caixa de pesquisa na coluna Pesquisa rápida de genes.
Verifique se o sistema exibe o ID do gene correto e o nome completo do gene alvo para garantir uma seleção precisa. Escolha um único RNA guia direcionado na sequência RORC com base na alta classificação combinada e na ordem de seleção para minimizar correspondências fora do alvo e aumentar a eficácia no alvo. Selecione a sequência de RNA guia único não direcionada nas bibliotecas Mouse Gecko V2.
Amplificar o RORC de guia único e as sequências codificadoras não-alvo de guia único usando DNA polimerase em uma PCR com primers projetados para as regiões de RNA de guia único e sequência vetorial. Clone as sequências amplificadas no vetor PMXU 6MCS, colocando-as entre o promotor U6 e o andaime de RNA guia no quadro com a proteína fluorescente mCherry. Em seguida, configure um programa de PCR para construção de vetores.
Um dia antes da transfecção, semeie aproximadamente oito vezes 10 elevado à potência de seis células Plat-E em um prato de 10 centímetros contendo DMEM suplementado com 10% de FBS, penicilina e estreptomicina. Incube as células a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono até que as células atinjam 80% de confluência. Uma hora antes da transfecção, substitua o meio de cultura celular por oito mililitros de meio sérico reduzido quente sem vermelho de fenol, contendo 5% de FBS, mas sem penicilina ou estreptomicina.
Prepare a mistura de transfecção 1 e misture 2. Gota a gota, adicione Mix 2 a Mix 1 e misture delicadamente. Incube a mistura por 15 a 20 minutos a 20 a 25 graus Celsius.
Enquanto gira suavemente a placa, adicione a mistura de transfecção gota a gota às células Plat-E. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por seis a doze horas. Após a incubação, substitua o meio por 10 mililitros de meio de cultura de células frescas e continue incubando a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas.
Avalie a eficiência da transfecção em células Plat-E detectando a marca do vetor retroviral usando microscopia de fluorescência. Em seguida, centrifugue o sobrenadante de cultura contendo vírus a 1.500 G por 10 minutos para remover fragmentos de células. Alíquota do sobrenadante contendo vírus em frascos de um mililitro.
Para começar, cubra cada poço de uma placa de cultura de células de 24 poços com dois microgramas por mililitro de Anti CD3 Epsilon e quatro microgramas por mililitro de Anti CD28 em 500 microlitros de PBS. Embrulhe a placa em Parafilme e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de colher o baço de camundongo, triture-o em tampão FACS usando vidro fosco esterilizado para homogeneizar o tecido em uma suspensão de célula única.
Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 micrómetros para um tubo de 50 mililitros. Gire a suspensão de células esplênicas a 800G por cinco minutos e ressuspenda o pellet em dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, adicione o buffer FACS para atingir um volume total de 15 mililitros. Após centrifugação, ressuspender os esplenócitos em tampão FACS e filtrá-los através de um filtro de células de 40 micrômetros. Ajuste o volume final para um mililitro com tampão FACS e isole as células T CD4 + usando kits de reagentes comerciais, seguindo as instruções do fabricante.
Rotule as células T CD4 + com uma mistura de anticorpos fluorescentes. Depois de lavar as células coradas com tampão FACS, isole as células T CD4 + virgens usando um classificador de células de fluxo. Agora, depois de remover o sobrenadante de estimulação ligado à placa, enxágue cada poço de uma placa de 24 poços duas vezes com 500 microlitros de PBS.
Plaquear uma vez 10 elevado a seis células T CD4 + virgens em um mililitro de meio de cultura de linfócitos em cada poço e incubar por 18 a 24 horas. No dia seguinte, colete as células ativadas em tubos de 1,5 mililitro e centrifugue a 800G por cinco minutos. Ressuspenda o pellet celular em um mililitro da mistura de infecção e adicione um mililitro da mistura nos poços de uma placa de 48 poços.
Envolva a placa com Parafilm e centrifugue a 800G por 90 minutos a 32 graus Celsius, com aceleração e desaceleração definidas em três. Após centrifugação, remova o Parafilme e incube as células por quatro horas. Para preparar células apresentadoras de antígenos, ou APC, ressuspenda os esplenócitos em um mililitro de meio de cultura de linfócitos contendo 50 microgramas por mililitro de mitomicina em um tubo de 15 mililitros.
Incube esplenócitos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, adicione PBS à marca de 15 mililitros e centrifugue a 800G por cinco minutos. Ressuspenda os esplenócitos em um mililitro de meio de cultura de linfócitos e conte o número de células em uma máquina de contador de células.
Após a infecção retroviral, centrifugue as células T CD4 + transduzidas em tubos de 1,5 mililitro e ressuspenda as células infectadas em 600 microlitros de PBS. Coloque 0,5 vezes 10 elevado a seis células T CD4 + transduzidas em um mililitro de meio de cultura de linfócitos com 1,5 vezes 10 elevado à potência de seis células APC em um poço de uma placa de cultura de células de 24 poços. Suplemento com dois microgramas por mililitro de Anti CD3 Epsilon, dois microgramas por mililitro de Anti CD28 e um coquetel de diferenciação Th17.
Cultive as células por dois dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após dois dias, centrifugue a suspensão celular em tubos de 1,5 mililitro e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio de cultura de linfócitos contendo três nanogramas por mililitro de TGF Beta e 30 nanogramas por mililitro de interleucina 6. Transfira as células para os poços de uma placa de 24 poços por dois dias.
Trate as células diferenciadas com 50 nanogramas por mililitro de PMA, 500 nanogramas por mililitro de ionomicina e cinco microgramas por mililitro de brefelden A em 500 microlitros de meio de cultura de linfócitos em um novo poço de uma placa de 24 poços. Incube as células a 37 graus Celsius por quatro horas. Colete as células tratadas em tubos de 1,5 mililitro contendo um mililitro de tampão FACS.
Após a centrifugação, corar as células com PBS contendo uma mistura de anticorpos fluorescentes a quatro graus Celsius por 30 minutos. Lave as células coradas com 300 microlitros de PBS antes de fixá-las com 300 microlitros de formaldeído tamponado com fosfato a 2% a quatro graus Celsius por 60 minutos. Após lavar as células com PBS, ressuspendê-las em 600 microlitros de tampão de permeabilização e centrifugar a 800G por cinco minutos.
Corar as células com anticorpo anti-interleucina 17A em 100 microlitros de tampão de permeabilização por 60 minutos à temperatura ambiente. A eficiência da infecção retroviral, conforme indicado por células positivas para mCherry, foi de aproximadamente 40% A eficiência de diferenciação de Th17 foi significativamente reduzida em células tratadas com RNA guia único direcionado ao gene ROR Gamma T. Os níveis de expressão de RORC e interleucina 17A foram substancialmente diminuídos em células tratadas com RNA guia único RORC.
