Este trabalho é apoiado em parte pelo NIH / NCATS clínica e translacional Ciência para a Universidade da Flórida TL1 TR000066 e UL1 TR000064, um suplemento diversidade de Pais Grant R01AI056152 do Instituto Nacional de Saúde, um subsídio reagente BD Biosciences, e da Universidade da Flórida.

Todo o uso de animais foi conduzido de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e uso. 1. Preparação de Misturas e Mídia <ol><li> Estéril PBS pH: 7.3 (1 L) 0,23 g de NaH 2 PO 4 1.15 g de Na 2 HPO 4 9,0 g de NaCl Tome-se o volume com água DI. Esterilizar com autoclave. </li><li> Cultura Celular Mídia (100 ml) 89 ml de RPMI 10 ml de 10% FBS 1 ml Antibiótico antimicótica (ABAM) 100 ug de 50 mM de 2-mercaptoetanol (3,5 ug estoque de 2-mercaptoetanol em 96,5 ug PBS) </li><li> FACS Buffer (Fluorescent Ativação celular Classificando) (Para ser usado durante a citometria de fluxo) FBS 2% em PBS estéril </li><li> iTh17 mistura (com base no número de amostras, determinar o volume necessário para todas as misturas e media) 1,5 ug / mL de anti-CD28 20 ng / ml de IL-6 5 ng / mLTGF-β </li></ol> 2. Células serão semeadas em Triplicate sob as condições a seguir <ol><li> Placa ligados anticorpos anti-CD3, anti-CD28 (isto é a mistura de controlo de activação). </li><li> iTH17: placa ligada anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β. </li></ol> 3. Anti-CD3 ligado à placa (10 ug / ml) Recomenda-se que a preparação de placas de anti-CD3 ligado à placa é feita, pelo menos, 4 horas antes da hora de células serão adicionados às placas. <ol><li> Adicionar 30 ul de anti-CD3 para poços (anti-CD3 é diluída em PBS estéril) de um novo 96 poços de microtitulação de fundo U placa de cultura de tecido, e tocar os lados da placa para assegurar uma cobertura uniforme das cavidades. Incubar a 37 ° C, durante 4 horas, e, em seguida, leve à geladeira até a hora de adicionar as mixagens e células para a chapa. </li></ol> 4. Rato Dissection <ol><li> Este protocolo baseia-se na utilização de C57BL / 6 mice, 3-8 meses de idade, e adquirido a partir do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). </li><li> Sacrifício mouse usando asfixia CO 2, e confirmar a morte com deslocamento cervical posterior. </li><li> Esterilizar ratos ferramentas de dissecação e área de incisão com etanol 70% e começar a dissecação. </li><li> Do ponto de vista ventral, agarre a pele que é anterior à abertura da uretra e começar a cortar com uma tesoura a linha média ventral até atingir a área do queixo. Tome precauções para não rasgar ou cortar no forro da parede peritoneal. </li><li> Puxe a pele e fechar para permitir o acesso confortável para os gânglios linfáticos durante a remoção. </li><li> Os gânglios linfáticos e baços recolhidos serão todos removidos com uma pinça, e colocado em uma placa de Petri estéril contendo 5 ml de tampão de corrida autoMACS comprado de Miltenyi Biotec (consulte a Figura 2 e 3 para o linfonodo e diagramas de remoção do baço). <ol><li> Retire os linfonodos axilares que estãoencontrado perto da axila (axila) por trás dos músculos peitorais de cada rato. </li><li> Retire os gânglios linfáticos braquial que estão localizados nos tecidos conjuntivos localizados perto de cada axila. </li><li> Remover os nódulos linfáticos cervicais superficiais encontrados no pescoço de cada rato. </li><li> Remover os nódulos linfáticos inguinais, que estão localizados na região da anca no conjunto dos 3 vasos sanguíneos. </li><li> Para acessar os linfonodos mesentéricos, cortados através do revestimento peritoneal até a linha média ventral. Linfonodos mesentéricos são encontrados no tecido conjuntivo que contém os intestinos juntos. Eles são geralmente encontrados em uma série de 4-8 nós e pode aparecer como um &quot;colar de pérolas&quot;. Certifique-se de retirar toda a cadeia. </li><li> O baço é localizado na região abdominal, atrás do estômago e intestinos. Remova-o puxando e destacando-o do pâncreas. </li></ol></li><li> Moer órgãos sob um capuz estéril com 2 lâminas de microscópio fosco. Coloque gânglios linfáticos ou baço emo lado fosco de uma lâmina de microscópio, e esfregue com o lado fosco do segundo slide até que se desintegrou. Repita até que todos os gânglios linfáticos e baço foram moídos. </li></ol> Nota: Recomenda-se começar com os gânglios linfáticos e terminar com o baço, como o sangue fará com que seja difícil ver os linfonodos restantes no buffer autoMACS. <ol start="9"><li> Para filtrar os órgãos de solo em uma suspensão de células individuais, começam por dobragem ao longo de um pedaço de nylon 40 um material diversas vezes, e colocar na parte superior de um tubo de centrífuga de 15 ml. O material de nylon devem ser cerca de 3 cm x 3 cm </li><li> Use uma seringa de 5 ml e 21 G agulha para aspirar os 5 ml de autoMACS executando órgãos tampão e terrestres. Dispensar lentamente para o material de nylon dobrados. Tome cuidado para evitar a perfuração do material com a agulha. </li></ol> Observação: Uma vez que a suspensão de célula única é feito, a solução deve aparecer como uma solução clara e consistente sem visible pedaços de tecido sólido. Se permanecer sólidos, re-aspirado e dispensar através de um novo pedaço dobrado de nylon colocado em um novo tubo de centrífuga de 15 ml. <ol start="11"><li> Sempre manter as células no gelo quando não estiver em uso. </li></ol> 5. Separação celular <ol><li> Para melhores resultados, obter pelo menos um puro CD4 + 80% da população de células CD25 através autoMACS Separador Pro celular usando o MACS CD4 + CD25 + T regulamentar o isolamento de células kit, mouse. O protocolo para a retenção negativa da população de células T CD4 + CD25 é obtido através de Miltenyi Biotec. </li></ol> 6. Th17 Diferenciação <ol><li> Colete a população CD25 de células CD4 +, após a separação com o autoMACS Pro separador de células. </li><li> Contagem de células diluído numa razão de 1:1000 com azul de tripano utilizando um hemocitómetro. </li><li> Uma vez que a concentração foi determinada a partir de contagens de células, dilui-se a suspensão de células a 1 x 10 6 células / ml em meio de cultura celular. </li><li> Retire placas de 96 poços com placa obrigado anti-CD3 após 4 horas. </li><li> Lavar as cavidades anti-CD3-revestidas com 200 ul de PBS. Repita duas vezes. <ol><li> Para lavar adicionar 200 mL de PBS estéril para poços anti-CD3-revestidos e remover PBS em um recipiente de resíduos. </li></ol></li><li> Adicionar 100 mL da mistura iTh17 ou mix de controle de ativação (ver ponto n º 2) para os poços em triplicado. </li><li> Adicionar 100 uL de células para cada poço em que tanto a mistura Th17 ou a mistura de controlo de activação foi colocada. </li><li> Incubar as células durante pelo menos 72 horas ou até 5 dias (a diferenciação Th17 pode ser obtido após 72 horas ou após 5 dias.) </li><li> Th17 diferenciação pode ser avaliada por coloração de citometria de fluxo e análise intracelular, ELISA, ou qPCR </li></ol> 7. A ativação celular (somente necessário para coloração intracelular) <ol><li> Remover placas de 96 poços de incubação no final de uma das 72 hr ou 5 dias <ol><li> Lembre-se que Th17 differentiation pode ser atingida após quer 72 horas ou 5 dias. </li></ol></li><li> Para cada condição (por exemplo, controlo de activação ou iTh17), transferir as células que são, em triplicado, para um poço de uma placa de cultura de células 24. As células para uma condição já foram reunidas em um poço da placa de 24 poços de cultura, em vez de ser em triplicado na placa de cultura bem fundo em U 96. </li><li> O volume total de cada poço na placa de 24 poços de cultura de células é agora de 600 ul. Aumentar o volume de cada poço a 1 ml com o meio de cultura celular. </li><li> Adicionar PMA (forbol miristato acetato) (50 ng / ml), ionomicina (1 | iM), e BFA (brefeldina A) (10 ug / ml) a cada poço na placa de cultura celular de 24 poços com as concentrações indicadas. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 4 h. </li></ol> 8. A coloração intracelular <ol><li> Células mancha com os marcadores extracelulares e intracelulares desejadas para análise por citometria de fluxo. Para detectar a presença of IL-17, de coloração intracelular é realizado com anticorpos anti-IL-17A. Marcadores de superfície extracelulares recomendados incluem CD4, CD8, e CD25. <ol><li> Use o intracelular de citocinas Coloração Starter Kit-Rato de BD Bioscience para a coloração de IL-17 intracelular. </li><li> Para cada amostra, as células de pelotas, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 200 uL de tampão de SCAF (SFB a 2% em PBS). </li><li> Transferir as células ressuspensas para 96 ​​células por citometria de fluxo de placa. </li><li> Girar para baixo células durante 5 min a 1200 rpm e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão PBS FACS, centrifuga-se durante 5 min a 1200 rpm, e rejeitar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul de tampão de FACS e aplicar 100 ul de anticorpo extracelular (Ab) mistura (mistura Ab extracelular é feita em tampão de SCAF). Incubar por 15 min em temperatura ambiente, coberto com papel alumínio. </li><li> Repita a etapa 8.1.4. </li><li> Repita o passo 8.1.5 2x. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul de BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubcomeu por 20 minutos em temperatura ambiente, coberto com papel alumínio. </li><li> Adicionar 100 ul de 1x tampão BD Perm / Wash, centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm, e rejeitar o sobrenadante. Repetir. </li><li> Adicionar 50 ul de mistura de Ab intracelular. (Mistura intracelular Ab é feita em 1x BD Perm / Wash) Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente, coberto com folha de alumínio. </li><li> Repita o passo 8.1.10. </li><li> Ressuspender as células em 200 mL de BD de coloração Buffer. </li><li> Colocar as células ressuspensas em citometria de fluxo tubos contendo 200 ul de Tampão de Coloração BD (volume final é de 400 uL). </li><li> Armazenar a 4 ° C, até as amostras estão prontas a ser lido. </li></ol></li></ol> 9. Análise por citometria de fluxo <ol><li> População de células vivas Gate. </li><li> Da população de células vivas, portão em CD4 + CD8-população. </li><li> Do CD8-população CD4 +, portão em IL-17A + população. <ol><li> Com base em nossos resultados experimentais anteriores, 100% da população + IL-17A será CD25 +. </li></ol></li></ol> * Contagens de células absolutas totais foram obtidos após reunir as triplicatas das amostras ** Número absoluto de células CD4 + CD25 + IL-17A + foi determinado multiplicando o número total de células por a percentagem portão vivo e a percentagem do total de células que carregam os marcadores específicos de linhagem, CD4, CD25 e IL-17A, tal como determinada por citometria de fluxo. 10. qPCR e ELISA <ol><li> Colocar as células não utilizado para a análise de citometria de fluxo em um tubo Eppendorf de 1,5 ml e centrifugar a 13000 rpm durante 5-10 min. As células presentes no sedimento celular após centrifugação vai ser utilizado para a análise de qPCR. A análise foi realizada utilizando qPCR PTC-200 Peltier termociclador (Biorad). </li><li> Recolher o sobrenadante dos tubos centrifugados para os testes ELISA. IL-17A ELISA foram realizados utilizando par de anticorpos TC11-18h10 (captura, código 555068) e TC11-8H4 biotina (detecção, código 555067) adquirido da BD Biosciences. IL-17A ELISA standards foram obtidos a partir de eBioscience (número de catálogo 14-8171-80). </li><li> Depois de retirar o sobrenadante, ressuspender as células restantes a serem utilizados para qPCR em 175 mL de tampão de lise RNA (usar imediatamente para a extração de RNA, síntese de cDNA, e qPCR, ou armazenar a -80 ° C para uso posterior). <ol><li> Consulte a Tabela II para seqüências de primers para IL-17A e actina (gene casa de manutenção) </li></ol></li></ol>

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	<li>Chen, Z., Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+and+ROR&#947;T:+transcriptional+regulation+of+Treg+and+Th17.">Foxp3 and ROR&#947;T: transcriptional regulation of Treg and Th17.</a> International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).</li><li>Cua, D. 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Não há divulgações a declarar.

Aqui nós descrevemos o protocolo para alcançar diferenciação in vitro de células Th17. O estudo de diferenciação Th17 é importante, tal como a diferenciação de linfócitos T no subconjunto Th17 é crítico para a eliminação eficaz de agentes patogénicos humanos 13. Por outro lado, a produção de IL17 tem sido associada com a progressão da doença auto-imune 13. O método de diferenciação de células Th17 é aplicável a muitas situações de pesquisa, uma vez que pode ser ...

Os linfócitos T CD4 + (células T) desempenham um papel crítico na defesa mediado pelo sistema imunológico contra microrganismos infecciosos. Por outro lado, as células T são também intimamente associados com o aparecimento e progressão de doenças auto-imunes, tais como diabetes do tipo 1, lúpus eritematoso sistémico e artrite reumatóide. Linfócitos T CD4 + são ativados através de uma combinação de receptor de células T (TCR) interações com antígeno cognato / complexo principal de histocompatibilidade II (MHCII) moléculas e as interações receptor CD28 com B7.1/B7.2 ligantes 15. Em adição à disposição de estimulação de TCR e CD28 co-estimulação, as células apresentadoras de antigénio também proporcionar um ambiente de citocinas, que determina o estado de diferenciação do linfócito T, orientando deste modo a resposta de linfócitos T para o antigénio determinada. Interações patógeno Distinct / célula apresentadora de antígeno criar ambientes de citocinas distintas, que distorcer linfócitos T por caminhos distintos focados na eliminação do patógeno iniciar. Infelizmente, T caminhos linfócitos efetoras, originalmente destinadas a erradicar patógenos invasores, podem ser erroneamente dirigida contra auto-tecidos 15. Portanto, uma melhor compreensão do estado de diferenciação de cada subconjunto de células T CD4 + distinta é fundamental para a nossa compreensão de como a modular o equilíbrio entre a eliminação de patógenos e tolerância à auto. Além do tipo Th1, Th2, e T reguladoras vias de diferenciação das células indutiveis, linfócitos T virgens, também pode ser conduzido por baixo da via de citocinas Th17. Considerando que as células Th1 patogénios intracelulares de combate, as células Th2 eliminar agentes patogénicos extracelulares, e células T reguladoras (Tregs) minimizar as respostas inflamatórias 1, 16; Th17 desempenhar um papel importante na eliminação de bactérias extracelulares e fungos. Th17 são geralmente indicados por expressão do factor de transcrição específico da linhagem RORγT e produção de IL-17A, que promove a ativação de macrófagos e neutrófilos 1, 7. Th17 têm sido implicados em várias doenças auto-imunes, e os seus modelos de roedores associados. Por exemplo, tem sido demonstrado que a IL-23 (que é necessária para sustentar o fenótipo Th17), mas não de IL-12, foi o culpado central em encefalite autoimune experimental (EAE), o modelo de roedor para a doença de MS. Foi posteriormente demonstrado que a redução na produção de IL-17, estão correlacionados com a prevenção de EAE 2, 6, 17. Além disso, as células Th17 têm sido associados com outras doenças auto-imunes, incluindo artrite e lúpus eritematoso sistémico (LES), 10, 16. IL-23 p19 deficiente - / - murganhos mostraram ter um número muito baixo de células Th17, e são resistentes ao desenvolvimento não só a EAE, mas também artrite induzida por colagénio, um modelo para a artrite reumatóide 10, 18. Além disso, os ratos tratados com anticorpos neutralizantes de IL-17A a réer o aparecimento de artrite induzida por colágeno também foram encontrados para ter resolução das lesões articulares 18. Deve notar-se que o papel de células Th17 na progressão da doença auto-imune permanece para ser caracterizado como a investigação recente tem mostrado também um papel protector das células Th17 em diabetes do tipo 1 9, 11 e 14 de inflamação intestinal. Estes estudos confirmam a importância da diferenciação Th17 na auto-imunidade. Na diferenciação Th17 in vitro é um método necessário na pesquisa de células T, porque há pelo menos duas perguntas intrigantes que requerem investigação adicional: 1) Como exatamente IL-6 regulam o equilíbrio entre Treg e diferenciação Th17, e 2) Quais são os mecanismos exatos trás de IL-17 induzida por doenças inflamatórias? Nosso método utiliza células CD4 + CD25-de baço e gânglios linfáticos do C57BL / 6 mouse. É importante notar que, embora seja possível, para induzir a diferenciação de células Th17 usando um impuropopulação, a aquisição de, pelo menos, um puro CD4 + 80% população de células CD25-T nega qualquer preocupação de contaminação e garante mais bem-sucedidos resultados de diferenciação Th17. A fim de conseguir a diferenciação Th17 adequada, as células T CD4 + CD25-T são incubados na presença de anti-CD3 e anti-CD28, que fornecem sinais de activação, 1 e 2, respectivamente, e de IL-6, e TGF-β. Embora tenha sido relatado que a IL-23 por si só pode ser usada para conseguir a diferenciação Th17, que foi mais tarde demonstrado que a IL-23 é necessária para a estabilidade da população de células Th17, mas TGF-β IL-6 e são essenciais para a diferenciação de células Th17 3, 18, ​​19. Estudos em ratos demonstraram que o receptor de IL-23 é expresso em células T CD4 + apenas depois de terem sido estimuladas com IL-6 e TGF-β 13, 18. Além disso, as células Th17 irá desenvolver com êxito, na presença de anticorpos IL-23 de bloqueio desde que TGF-β IL-6 e que estão presentes 18, 19. Como tal, este protocolo prov diferenciação Th17ides as condições adequadas para induzir com sucesso diferenciação Th17. O desenvolvimento de uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes Th17 diferenciação e a produção de IL-17 apresentam a oportunidade para o desenvolvimento de melhores terapias destinadas a doenças auto-imunes 13.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Polyestrene Petri Dish</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>0875713A</td>
 <td>60 mm x 15 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>autoMACS Running Buffer</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-091-221</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Premium Microscope Slides, Frosted</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>12-544-3</td>
 <td>3" x 1"1 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>309632</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Corning 15 ml Centrifuge Tubes</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CLS430791</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon 40 microns</td>
 <td>Miami Aquaculture</td>
 <td>Nylon 40/26</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtest tissue culture plate 96 well U bottom </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>35-3077</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Corning Costar 24 well cell culture plates</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CL3524</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Tubes 1.5 ml</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>05-408-129</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553057</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553294</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IL-6 Recombinant Protein</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>14-8061-62</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TGFbeta</td>
 <td>R&amp;D Systems</td>
 <td>240-B-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan blue solution 0.4 %</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>66H2364</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>558107</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>APC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE Conjugated Anti-mouse CD25</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>E01155-516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>560820</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>51-2041AK (559311)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-091-221</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ABAM </td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>30-004-CI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI</td>
 <td>Corning, Cellgro</td>
 <td>10-040-CM</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B 2-MercaptoEthanol</td>
 <td>MP Biomedical</td>
 <td>194834</td>
 <td>Hazardous</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin Calcium Salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>13909-1ML</td>
 <td>Hazardous</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brefeldin A (BFA)</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>159027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ELISA IL-17A Capture mAb </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555068</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ELISA IL-17A Detection mAb </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555067</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ELISA IL-17A Standard</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>14-8171-80</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IL-2 ELISA Kit</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555148</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TMB Substrate Reagent Set </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>autoMACS Pro Cell Separator</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-092-545</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sorvall Legend RT+ Centrifuge</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Napco series 8000 WJ CO2 Incubator</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC-200 Peltier Thermal Cycler</td>
 <td>Biorad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation and th17 differentiation of na&iuml;ve cd4 t lymphocytes

Th17 são um subconjunto distinto das células T que foram encontrados para produzir interleucina-17 (IL-17), e diferem em função das outras subpopulações de células T, incluindo Th1, Th2, e células T reguladoras. Th17 surgiram como um culpado central em respostas imunitárias inflamatórias associadas com superzelosos muitas doenças auto-imunes. Neste método purificamos linfócitos T dos baço e linfonodos de camundongos C57BL / 6, e estimular as células T CD4 + purificadas sob controle e ambientes Th17 indutores. O meio de indução de Th17 inclui estimulação na presença de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, IL-6, e do TGF-β. Após incubação durante pelo menos 72 horas e até cinco dias a 37 ° C, as células são subsequentemente analisados ​​para a capacidade de produzir IL-17 por meio de citometria de fluxo, qPCR, e ELISA. Th17 diferenciadas células CD4 + CD25-T pode ser utilizado para elucidar o papel que as células Th17 jogar no aparecimento e progressão de auto-imunidade e de acolhimentofense. Além disso, Th17 diferenciação de CD4 + CD25-linfócitos de modelos nocaute / doença murino distintas podem contribuir para a nossa compreensão da plasticidade destino celular.

Este protocolo de diferenciação Th17 começa com a remoção do baço e axilar, braquial, mesentérica, do colo do útero, e os nódulos linfáticos inguinais. Uma representação dos locais de cada um pode ser encontrado nas Figuras 2 e 3. As Figuras 1 e 5, tanto fornecer uma representação visual dos métodos descritos neste protocolo. Este protocolo Th17 centra-se na diferenciação da população de linfócitos CD4 + CD25-T. É import...

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Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

34.2K visualizações.  The University of Florida.  Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro. 

Vídeo: Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Imunologia e Infecção

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Células T, γδ um Extrathymic αβT de células progenitoras

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct functional subsets based on the cytokines they secreted: for example, IFN-&#947; for CD4 T helper 1 cells, IL-4 and IL-13 for CD4 T helper 2 cells, IL-21 for CD4 T follicular helper cells, and IL-17 for CD4 T helper 17 cells. Analysis of hepatitis B virus (HBV)-specific CD4 T cells based on cytokine secretion after HBV-derived peptides stimulation could provide information not only about the magnitude of HBV-specific CD4 T-cell response but also about the functional subsets of HBV-specific CD4 T cells. Novel approaches, such as transcriptomics and metabolomics analysis, could provide more detailed functional information about HBV-specific CD4 T cells. These approaches usually require isolation of viable HBV-specific CD4 T cells based on peptide-major histocompatibility complex-II multimers, while currently the information about HBV-specific CD4 T-cell epitopes is limited. Based on an HBV-derived peptide matrix, a method has been developed to evaluate HBV-specific CD4 T-cell responses and identify HBV-specific CD4 T-cell epitopes simultaneously using peripheral blood mononuclear cells samples from chronic HBV infection patients.

Based on a hepatitis B virus (HBV)-derived peptide matrix, HBV-specific CD4 T-cell responses could be evaluated in parallel with identification of HBV-specific CD4 T-cell epitopes.

Análise das respostas e identificação de epítopos de células T T específicas do HBV com base em uma matriz de peptídeos

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...