A eletroporação aumenta temporariamente a permeabilidade da membrana celular por meio de pulsos elétricos de alta tensão. Existem vários tratamentos clínicos de rápido desenvolvimento baseados em eletroporação que visam células musculares e neuronais. Portanto, é crucial investigar como a eletroporação afeta a capacidade dessas células excitáveis de desencadear potenciais de ação.
Experimentos in vitro são muito importantes para entender os efeitos da eletroporação em células excitáveis. No entanto, os miócitos e neurônios primários têm um perfil de expressão de canal iônico muito complexo que torna extremamente desafiador desvendar a interação entre excitação e eletroporação. Desenvolvemos um protocolo para monitorar as mudanças induzidas por eletroporação na geração de potencial de ação usando células HEK de pico tet-on.
Essas células expressam um complemento mínimo de canais de sódio e potássio que as tornam excitáveis. Portanto, esta célula simplificou os experimentos e a análise teórica dos resultados obtidos. Usando nosso protocolo, descobrimos que a eletroporação muito leve já pode afetar drasticamente a aceitabilidade celular.
Esses resultados abrirão caminho para o desenvolvimento de modelos teóricos de eletroporação e aceitabilidade celular, e isso ajudará a comunidade a melhorar as terapias baseadas em eletroporação emergentes no coração, no cérebro e nos músculos esqueléticos. Para começar, pipete um mililitro de PBS em um poço das lâminas da câmara de vidro de cobertura de dois poços. Adicione 10 microlitros de solução estéril de poli-L-lisina de um miligrama por mililitro e misture bem com uma pipeta.
Incube por 1,5 horas em temperatura ambiente sob condições estéreis em uma capela de fluxo laminar e, em seguida, remova o PBS com poli-L-lisina sem qualquer lavagem adicional. Para semear as células, prepare uma diluição de um a 10 de solução estoque de doxiciclina em um meio de cultura em um tubo de 1,5 mililitro. Agora, remova o meio de cultura do frasco T-25.
Tripsinize as células com 2,5 mililitros de solução de tripsina EDTA em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por dois minutos. Adicione 2,5 mililitros de meio de cultura fresco e pipete suavemente as células para separá-las da superfície. Calcule o volume da suspensão celular tripsinizada necessária para estabelecer a cultura.
Subtraia o volume de suspensão celular calculado anteriormente de 1.470 microlitros para calcular o volume do meio de cultura. Para preparar amostras com células S HEK excitáveis, pipetar o volume calculado do meio de cultura e a suspensão de células tripsinizadas em um poço. Adicione 30 microlitros da diluição de doxiciclina.
Misture bem pipetando suavemente antes de colocar as câmaras na incubadora de dióxido de carbono. Para preparar amostras com células NS HEK não excitáveis, pipetar o volume calculado de meio de cultura para um poço e adicionar 90% do volume calculado de suspensão celular para células S HEK sem doxiciclina. Incube as câmaras em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius por dois a três dias antes do experimento.
Antes do experimento, pipetar três microlitros de solução de estoque de corante potenciométrico em um tubo de 1,5 mililitro. Deixe o tubo aberto à temperatura ambiente em uma capela de fluxo laminar por aproximadamente 15 minutos para permitir que o etanol evapore e o corante potenciométrico seque, em seguida, adicione 997 microlitros de meio de cultura a frio a quatro graus Celsius ao tubo para dissolver o corante até uma concentração final de 12 micromolar. Em seguida, remova o meio de cultura do poço.
Adicione um mililitro de solução de corante potenciométrico às células. Refrigere as células a quatro graus Celsius e incube-as por 20 minutos. Em seguida, remova a solução de corante potenciométrico e guarde-a em um tubo para posterior reutilização por até seis experimentos sequenciais em um dia.
Lave suavemente as células três vezes com solução de tirado. Após a última lavagem, pipetar um mililitro de solução de tirado com baixo teor de potássio para o poço. Para começar, prepare as células HEK para eletroporação e, em seguida, configure a sincronização da entrega de pulso com aquisição de imagem usando um sinal TTL do sistema de microscópio que aciona o gerador de pulso.
Na parte inferior da câmara, coloque dois eletrodos de fio de platina-irídio paralelos com um diâmetro de 0,8 milímetros e uma distância de cinco milímetros entre as bordas internas. Fixe a câmara sob o microscópio e conecte os eletrodos ao gerador de pulsos. Usando uma sonda de tensão e corrente, conecte a saída do gerador de pulso a um osciloscópio para permitir a verificação da entrega correta de pulso durante o experimento.
Concentre as células no campo claro e imagine as células localizadas no meio entre os eletrodos. Adquira 80 imagens no modo de lapso de tempo a uma taxa de pelo menos 25 quadros por segundo. Ilumine as células com um comprimento de onda de excitação de 635 nanômetros, defina o tempo de exposição para 10 milissegundos e detecte a emissão em aproximadamente 700 nanômetros.
Após a aquisição, aguarde dois minutos. Ajuste a tensão na interface do gerador de pulsos para 63 volts. Registre um lapso de tempo da mesma maneira a cada dois minutos.
Durante essas aquisições, aplique um único pulso de 100 microssegundos no momento da aquisição da 10ª imagem. Adquira imagens com tensões de pulso de 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 e 200 volts. Estime o campo elétrico ao qual as células estão expostas como a relação tensão-elétrodo-distância aplicada.
Para análise de dados, exporte as gravações de lapso de tempo para o formato TIFF e, em seguida, coloque todas as gravações de lapso de tempo das tensões aplicadas de um experimento individual em uma única pasta. Renomeie cada gravação de lapso de tempo para que o MATLAB possa reconhecer o campo elétrico. Para a aquisição no início do experimento, onde nenhum pulso é aplicado, renomeie-o usando a frase 000Vcm.
Em seguida, abra o aplicativo baixado do GitHub. Clique em Selecionar pasta de dados"para escolher a pasta que contém as gravações de lapso de tempo de um experimento. Para selecionar os pixels, use dois controles deslizantes para determinar o limite baixo para uma imagem nítida das membranas e o limite alto para eliminar detritos da análise.
Agora, clique em Analisar dados. Na aba Análise, aparecerá uma tabela com os parâmetros extraídos. No lado direito da tabela, serão exibidos gráficos de fluorescência relativa ao longo do tempo para cada campo elétrico utilizado.
Selecione os gráficos para um determinado campo elétrico no menu suspenso no lado esquerdo acima da tabela. Examine todos os gráficos e execute a correção manual em caso de detecção de pico falso. selecione Limpar picos AUTO"na parte inferior da guia Análise"para limpar os picos detectados automaticamente.
Clique no gráfico para determinar manualmente um novo ponto de tempo de pico. Se necessário, selecione Executar novamente a detecção de pico AUTO "na parte inferior da guia Análise" para executar a detecção automática de pico novamente. Os parâmetros extraídos agora serão ajustados para o novo pico.
Depois, selecione Exportar dados"no canto inferior direito da guia Análise"para exportar dados para a mesma pasta que um arquivo dotmap, um arquivo de planilha e imagens PNG para cada campo elétrico usado. Pulsos elétricos de 126 volts por centímetro desencadearam múltiplos picos de fluorescência em células excitáveis, como mostrado pelas oscilações distintas na mudança de fluorescência ao longo do tempo. Com o aumento da intensidade do campo elétrico, a resposta mudou e exibiu despolarização sustentada a 400 volts por centímetro.
As células não excitáveis não exibiram picos significativos em resposta às menores intensidades de campo elétrico, indicando nenhuma excitação. Em intensidades de campo elétrico mais altas, as células não excitáveis também exibiram despolarização sustentada, indicando eletroporação. O número máximo de picos em células excitáveis foi observado em 150 volts por centímetro, com tendência decrescente no número de picos à medida que a voltagem aumentava além desse ponto.
