Electroporation은 고전압 전기 펄스를 통해 일시적으로 세포막 투과성을 증가시킵니다. 근육과 신경 세포를 표적으로 하는 전기천공법을 기반으로 빠르게 발전하는 몇 가지 임상 치료법이 있습니다. 따라서 전기천공법이 활동 전위를 유발하는 이러한 흥분성 세포의 능력에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 것이 중요합니다.
체외 실험은 흥분성 세포에 대한 전기천공법의 효과를 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나 일차 근세포와 뉴런은 매우 복잡한 이온 채널 발현 프로파일을 가지고 있어 여기(excitation)와 전기천공(electroporation) 사이의 상호 작용을 분리하는 것이 매우 어렵습니다. 우리는 tet-on 스파이킹 HEK 세포를 사용하여 활동 전위 생성에서 전기천공으로 유도된 변화를 모니터링하는 프로토콜을 개발했습니다.
이 세포는 흥분성을 유발하는 나트륨 채널과 칼륨 채널의 최소 보체를 발현합니다. 따라서 이 셀은 실험과 얻은 결과의 이론적 분석을 단순화했습니다. 우리의 프로토콜을 사용하여 우리는 매우 가벼운 전기천공법이 이미 세포 수용성에 큰 영향을 미칠 수 있음을 발견했습니다.
이러한 결과는 전기천공법과 세포 수용성에 대한 이론적 모델을 개발하기 위한 길을 열 것이며, 이는 커뮤니티가 심장, 뇌 및 골격근에서 빠르게 부상하는 전기천공법 기반 치료법을 개선하는 데 도움이 될 것입니다. 먼저 PBS 1ml를 2웰 커버 유리 챔버 슬라이드의 한 웰에 피펫팅합니다. 10마이크로리터의 멸균 1밀리리터 폴리-L-라이신 용액을 넣고 피펫으로 잘 섞습니다.
층류 후드에서 멸균 상태로 실온에서 1.5시간 동안 배양한 다음 더 이상 세척하지 않고 폴리-L-라이신으로 PBS를 제거합니다. 세포를 시딩하려면 1.5ml 튜브의 배양 배지에 1-10 희석된 독시사이클린 스톡 용액을 준비합니다. 이제 T-25 플라스크에서 배양 배지를 제거합니다.
섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 2분 동안 2.5ml의 트립신 EDTA 용액으로 세포를 트립신화합니다. 2.5ml의 신선한 배양 배지를 추가하고 세포를 부드럽게 피펫팅하여 표면에서 분리합니다. 배양을 확립하는 데 필요한 트립신화된 세포 현탁액의 부피를 계산합니다.
이전에 계산된 세포 현탁액을 1, 470마이크로리터에서 빼서 배양 배지의 부피를 계산합니다. 흥분성 S HEK 세포가 있는 샘플을 준비하려면 계산된 부피의 배양 배지와 트립신화된 세포 현탁액을 하나의 웰에 피펫팅합니다. 독시사이클린 희석액 30마이크로리터를 추가합니다.
챔버를 이산화탄소 인큐베이터에 넣기 직전에 부드러운 피펫으로 잘 섞습니다. non-excitable NS HEK cell로 샘플을 준비하려면 계산된 부피의 배양 배지를 웰에 피펫팅하고 doxycycline이 없는 S HEK 세포에 대해 계산된 세포 현탁액 부피의 90%를 추가합니다. 실험 전 2-3일 동안 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 챔버를 배양합니다.
실험하기 전에 3마이크로리터의 전위차 염료 원료 용액을 1.5ml 튜브에 피펫팅합니다. 열린 튜브를 층류 후드의 실온에서 약 15분 동안 방치하여 에탄올이 증발하고 전위차 염료가 건조될 때까지 한 다음 섭씨 4도의 저온 배양 배지 997마이크로리터를 튜브에 첨가하여 염료를 최종 농도 12마이크로몰까지 용해시킵니다. 다음으로, 웰에서 배양 배지를 제거합니다.
1ml의 전위차 염료 용액을 세포에 추가합니다. 세포를 섭씨 4도에서 냉장 보관하고 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 전위차 염료 용액을 제거하고 튜브에 보관하여 하루에 최대 6번의 순차적 실험에 추가로 재사용할 수 있습니다.
티로드 용액으로 세포를 세 번 부드럽게 씻으십시오. 마지막 세척 후 저칼륨 티로드 용액 1ml를 우물에 피펫으로 넣습니다. 먼저 전기천공을 위해 HEK 셀을 준비한 다음 펄스 발생기를 트리거하는 현미경 시스템의 TTL 신호를 사용하여 이미지 획득과 펄스 전달의 동기화를 구성합니다.
챔버 바닥에 직경이 0.8mm이고 내부 가장자리 사이에 5mm 거리를 둔 두 개의 평행한 백금-이리듐 와이어 전극을 놓습니다. 챔버를 현미경 아래에 고정한 다음 전극을 펄스 발생기에 연결합니다. 전압 및 전류 프로브를 사용하여 펄스 발생기의 출력을 오실로스코프에 연결하여 실험 중에 올바른 펄스 전달을 확인할 수 있습니다.
세포를 명시장에 초점을 맞추고 전극 사이의 중간에 위치한 세포를 이미지화합니다. 타임랩스 모드에서 초당 최소 25프레임의 속도로 80개의 이미지를 획득합니다. 635나노미터의 여기 파장으로 셀을 비추고, 노출 시간을 10밀리초로 설정하고, 약 700나노미터에서 방출을 감지합니다.
획득 후 2분 동안 기다립니다. 펄스 발생기 인터페이스의 전압을 63볼트로 조정합니다. 2분마다 같은 방식으로 타임랩스를 녹화합니다.
이러한 획득 중에는 10번째 이미지를 획득할 때 단일 100마이크로초 펄스를 적용합니다. 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 및 200V의 펄스 전압으로 이미지를 획득할 수 있습니다. 셀이 노출되는 전기장을 적용된 전압 대 전극 거리 비율로 추정합니다.
데이터 분석을 위해 타임랩스 기록을 TIFF 형식으로 내보낸 다음 개별 실험에서 적용된 전압의 모든 타임랩스 기록을 단일 폴더에 배치합니다. MATLAB이 전기장을 인식할 수 있도록 각 타임랩스 기록의 이름을 바꿉니다. 펄스가 적용되지 않는 실험 시작 시 획득의 경우 000Vcm이라는 문구를 사용하여 이름을 바꿉니다.
그런 다음 GitHub에서 다운로드한 애플리케이션을 엽니다. "데이터 폴더 선택"을 클릭하여 한 실험의 타임랩스 기록이 포함된 폴더를 선택합니다. 픽셀을 선택하려면 두 개의 슬라이더를 사용하여 멤브레인의 선명한 이미지를 위한 낮은 임계값과 분석에서 파편을 제거하기 위한 높은 임계값을 결정합니다.
이제 데이터 분석을 클릭합니다. 분석" 탭에 추출된 매개변수가 있는 테이블이 나타납니다. 표의 오른쪽에는 사용된 각 전기장에 대한 시간 경과에 따른 상대 형광 그래프가 표시됩니다.
테이블 위의 왼쪽에 있는 드롭다운 메뉴에서 지정된 전기장에 대한 그래프를 선택합니다. 모든 그래프를 검사하고 잘못된 피크 검출이 발생한 경우 수동 보정을 수행합니다. 분석" 탭 하단의 "Clear AUTO peaks"를 선택하여 자동으로 감지된 피크를 지웁니다.
그래프를 클릭하여 새 피크 시간 지점을 수동으로 확인합니다. 필요한 경우 분석" 탭 하단의 "자동 피크 감지 재실행"을 선택하여 자동 피크 감지를 다시 수행합니다. 추출된 매개변수는 이제 새로운 피크로 조정됩니다.
그런 다음 분석" 탭의 오른쪽 하단에 있는 "데이터 내보내기"를 선택하여 사용된 각 전기장에 대해 도트맵 파일, 스프레드시트 파일 및 PNG 이미지와 동일한 폴더로 데이터를 내보냅니다. 센티미터당 126볼트의 전기 펄스는 시간이 지남에 따라 형광 변화의 뚜렷한 진동으로 알 수 있듯이 여기성 세포에서 여러 형광 피크를 트리거했습니다. 전기장 강도가 증가함에 따라 반응이 변화하고 센티미터당 400볼트에서 지속적인 탈분극을 보였습니다.
Non-excitable cell은 가장 낮은 전기장 강도에 대한 반응으로 유의미한 피크를 나타내지 않았으며, 이는 excitation이 없음을 나타냅니다. 더 높은 전기장 강도에서, non-excitable cell은 또한 지속적인 탈분극을 보였으며, 이는 electroporation을 나타냅니다. 여기성 셀의 최대 피크 수는 센티미터당 150볼트에서 관찰되었으며, 전압이 이 지점을 넘어 증가함에 따라 피크 수가 감소하는 추세를 보였습니다.
