Estamos empenhados em estudar o mecanismo de fusão das membranas intracelulares. Neste protocolo, pretendemos realizar a dinâmica conformacional da proteína de fusão da membrana do retículo endoplasmático atlastin durante seu ciclo de hidrólise de GTP por smFRET. A atastina pode existir como um monômero ou dímero no ciclo de hidrólise do GTP.
Em experimentos de molécula única, é um desafio encontrar estratégias apropriadas de marcação e imobilização de proteínas, e o seguinte apresenta a dinâmica conformacional da alastina ao longo do ciclo de hidrólise do GTP. Comparado com o FRET em massa, o smFRET pode monitorar com precisão as conformações de proteínas em diferentes estados de carga de nucleotídeos, fornecendo assim uma visão direta do comportamento das moléculas moduladoras. Usamos o smFRET para resolver completamente o ciclo de hidrólise de GTP da alastina durante diferentes estratégias de posição.
Acreditamos que nossas descobertas promoverão mais dinâmica conformacional no estudo de proteínas de hidrólise de GTP e fornecerão novas interpretações de processos biológicos raros. Para limpar a superfície da lamínula, use uma pinça para pegar oito lamínulas e coloque-as em um frasco de coloração. Adicione 50 mililitros de acetona para cobrir as lamínulas e coloque o frasco de coloração em um limpador ultrassônico por 30 minutos.
Enxágue as lamínulas três vezes com água bidestilada e lave-as com metanol em um limpador ultrassônico. Em seguida, adicione a solução de piranha ao frasco de coloração e aqueça-o em uma chaleira em banho-maria a 95 graus Celsius por duas horas. Depois de resfriar o frasco à temperatura ambiente, enxágue as lamínulas seis vezes com água bidestilada
Adicione a solução de metóxido de sódio no frasco de coloração e coloque-o no limpador ultrassônico por 15 minutos. Depois de enxaguar as lamínulas com água, adicione água bidestilada ao frasco de coloração e coloque-o no limpador ultrassônico por 15 minutos. Prenda as lamínulas no frasco de coloração e seque-as com nitrogênio.
Transfira as lamínulas secas para outro frasco de coloração e asse o frasco em um forno de secagem a 120 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, resfrie o frasco à temperatura ambiente em um dessecador. Adicione 47,5 mililitros de metanol, 2,5 mililitros de ácido acético e 0,5 mililitros de trietoxissilano a um copo e misture uniformemente.
Transfira a mistura para o frasco de coloração e incube por 10 minutos. Enxágue as lamínulas três vezes com água bidestilada no frasco de coloração e sonice por cinco minutos. Depois de enxaguar as lamínulas com água e secá-las com nitrogênio conforme demonstrado, coloque as lamínulas em uma placa de Petri de 10 centímetros de diâmetro.
Dissolver SVA-mPEG e SVA-mPEG-Biotina na solução com alto teor de sal na proporção de 1:100. Coloque a mistura preparada em uma lamínula e cubra-a com outra lamínula. Incubar as lamínulas com humidade adequada durante duas horas ou durante a noite.
Após a modificação, separe as lamínulas, lave-as com água deionizada e seque com nitrogênio. Coloque cuidadosamente a lamínula modificada em um tubo de 50 mililitros. Depois de purificar o domínio GTPase da proteína semelhante à dinamina atlastina ou ATL expressa em células de E.coli de Rosetta, mude o tampão proteico para o tampão de biotinilação proteica usando um filtro centrífugo de 10 kilodaltons.
Para biotinilação de proteínas, misture 100 microlitros de ATP 100 milimolares, acetato de magnésio 100 milimolares e D-biotina 500 micromolares, 10 microlitros de biotina ligase BirA 100 micromolares e 50 micromolares de proteína até um volume final de um mililitro. Incube a mistura durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova a D-biotina livre usando um filtro centrífugo de corte de peso molecular de 10 quilodaltons.
Incube 20 microlitros de proteína biotinilada com 20 microlitros de estreptavidina 15 micromolar por 20 minutos no gelo. Detecte a eficiência da biotinilação de proteínas usando SDS-PAGE. Dissolver os fluoróforos LD555 e LD655 em dimetilsulfóxido até uma concentração final de cinco milimolares.
Para preparar o tampão de rotulagem, misture 25 HEPES milimolares, cloreto de potássio 150 milimolares e cloreto de magnésio cinco milimolares. Troque o tampão de proteína para o tampão de rotulagem usando um filtro centrífugo de 10 quilodaltons. Para ensaios intramoleculares de smFRET, misture ATL1cito-TK com LD555 e LD655 na proporção de 1:1,2:1,2 para um volume final de 100 microlitros.
Incube a mistura por cinco horas a quatro graus Celsius. Para ensaios intermoleculares de smFRET, incubar ATL1cyto-K com LD555 e ATL1cyto-K biotinilado com LD655 por cinco horas a quatro graus Celsius. Para preparar a câmara de imobilização de proteínas, cole cuidadosamente a lamínula modificada e a lâmina do microscópio com fita dupla face personalizada.
Instale mangueiras e pontas para formar uma câmara microfluídica com seis canais. Para correções de mapeamento, adicione 10 microlitros de partículas de poliestireno a 10% em uma lâmina de microscópio e cubra-a com uma lamínula. Em seguida, sob um microscópio de fluorescência de reflexão interna total, selecione um campo de visão contendo partículas de poliestireno e capture um vídeo em um modo de campo claro.
Use um script personalizado para alinhar a localização central da mesma partícula de poliestireno nos canais doador e aceitador. Salve o arquivo de mapa como um arquivo TXT. Para experimentos intermoleculares de smFRET, misture LD555 marcado com ATL1cito-K com LD655 marcado com ATL1cito-K-biotina em uma proporção de um para um com uma concentração final de um milimolar de GTP-gama-S.
Incube a mistura no gelo por uma hora para dimerizar as proteínas. Misture ATL1cyto-T marcado com LD555 com ATL1cito-K-biotina marcada com LD655 em uma proporção de um para um com um milimolar de GTP-gama-S para experimentos de smFRET intermoleculares ATL1cyto-T e ATL1cyto-K. Incube a mistura no gelo por uma hora para obter proteínas dimerizadas.
Em seguida, para ensaios intramoleculares de smFRET, incube LD555 e LD655 marcados com ATL1cyto-TK com um milimolar de GDP em gelo por uma hora. Para experimentos intermoleculares, incube 10 microgramas por mililitro de estreptavidina por 10 minutos para imobilizar proteínas. Para ensaios intramoleculares, adicione 10 microgramas por mililitro de anticorpo anti-His biotinilado e incube por 10 minutos para imobilizar as proteínas.
Após a incubação, adicione o dímero ATL1 diluído à proteína no canal e deixe-o imobilizar por 10 minutos. Lave o canal duas vezes com um buffer de incubação. Adicionar ácido benzóico e PCD ao canal a uma concentração final de 2,5 milimolares.
Selecione o laser de 532 nanômetros como fonte de luz de excitação. Configure a câmera EMCCD para gravar dados em um intervalo de quadros de 30 milissegundos. Salve os filmes gravados no formato TIFF de 16 bits.
Após a aquisição de dados, extraia faixas FRET dos filmes gravados. Selecione e salve as faixas FRET no formato TXT. Extraia os dados dos arquivos TXT e calcule os valores de FRET usando scripts caseiros no MATLAB.
Ajuste os dados smFRET por GaussAmp no Origin para obter o histograma de distribuição.
