Desenvolvemos uma abordagem in vitro para caracterizar a mecânica dos géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo do citoesqueleto celular e, mais geralmente, do citoplasma, que tem demonstrado se comportar como um material ativo poroelástico. Este método fornece informações sobre como a contratilidade da miosina contribui para o surgimento de um fluxo de fluido e como as velocidades da rede e do citosol estão correlacionadas no tempo e no espaço. Esta abordagem simples nos permite extrair as propriedades mecânicas de sistemas em evolução dinâmica sem usar nenhum equipamento ou técnica sofisticada onde ferramentas convencionais como AFIM não podem ser empregadas.
Este método pode fornecer informações sobre a reologia de materiais ativos poroelásticos, independentemente da especificidade do gel ativo e do fluido incorporado. Para começar, coloque de 10 a 12 tampas de vidro número 1.5 em um suporte caseiro de politetrafluoretileno e prepare a solução de Piranha em um copo de 400 mililitros. Prepare a solução no gelo em uma capa química.
Transfira o suporte para o copo recheado de Piranha. Após três horas, transfira o suporte para um copo limpo cheio de água fresca bidestilada para lavar o excesso de piranha das tampas e transfira o copo para um banho de sonicação a 80 hertz e potência total por 10 minutos a 25 graus Celsius. Repita este passo mais duas vezes com água fresca bidestilada.
Para a salinização, transfira o suporte para um copo limpo preenchido com 300 mililitros de metanol puro e, em seguida, para um banho de sonicação por 30 minutos. Em seguida, transfira o suporte para uma solução de silano. Sele o copo com parafilme e mantenha-o na geladeira a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, transfira o suporte para um copo limpo cheio de 300 mililitros de metanol puro por 15 segundos. Seque o fundo do suporte para remover o excesso de metanol e transfira-o para um copo limpo. Em seguida, transfira o copo para o forno para secar as tampas de vidro por cinco minutos a 120 graus Celsius.
Para obter passivação superficial, pegue duas lamínulas para cada experimento e coloque-as em uma placa de Petri revestida com uma camada de parafilme inicialmente limpa com etanol. Incubar cada lamínula com um mililitro de maleimida de metoxipolietilenoglicol em 1X PBS por uma hora a 22 graus Celsius. No final do processo de incubação, incline a placa de Petri para remover e fixar.
Enxágue cada lamínula com cinco mililitros de água bidestilada e seque com um fluxo de gás nitrogênio. Como as lamínulas devem ser mantidas molhadas após a passivação, coloque imediatamente um mililitro de Tris 10 milimolares nas superfícies peguiladas e use as lamínulas com duas horas. Para formar grandes agregados de miosina, diluir a solução estoque de miosina com Tris 10 milimolares para atingir uma concentração final de cloreto de potássio de 25 milimolares.
Manter a solução de miosina diluída durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, transferi-la para o gelo até à utilização. Os motores ficam totalmente ativos por até duas horas. para rastrear o fluxo de solvente através dos poros do gel, preparar esferas fluorescentes passivadas e reduzir a interação entre as esferas e a rede de actomiosina, incubando um microlitro de esferas com cinco G-actina micromolar por 20 minutos.
Remova o excesso de G-actina por centrifugação. Repetir esta etapa com 10 miligramas por mililitro de albumina de soro bovino para bloquear a superfície não revestida restante e usar as esferas em uma diluição final de um a 10.000 nos experimentos. Para preparar a solução de actomiosina, descongele as alíquotas de proteína armazenadas a menos 80 graus Celsius e coloque-as no gelo.
Em seguida, prepare a solução para atingir uma concentração final de Tris 10 milimolares, cinco G-actina micromolares, 280 nanomolares GST Fascin, e 1,67 miosina nanomolar II. Tome uma das lamínulas passivadas de polietilenoglicol. Coloque um espaçador paraforme untado sobre ele e coloque-o no porta-amostras. Adicione 1,1 microlitros da solução de actomiosina à lamínula montada no suporte e coloque a segunda lamínula por cima.
Rosqueie o suporte para selar a amostra. Coloque o porta-amostras no microscópio e inicie a aquisição. Preparar o microscópio com antecedência para reduzir o tempo de aquisição inicial.
Para obter imagens das amostras com microscópio fluorescente invertido, visualize toda a área do gel usando aumentos baixos de objetiva de 2,5X e acompanhe sua contração macroscópica com o tempo. Use um objetivo de 10X para caracterizar a porosidade e estrutura da rede e acompanhar a auto-organização e contração da rede com o tempo. Para a imagem bicolor simultânea, excite a actina a 488 nanômetros e os motores de miosina II a 561 nanômetros e grave as imagens simultaneamente em uma câmera EMCCD usando um aparelho de emissão dupla.
Use o mesmo sistema de imagem para obter imagens simultâneas do gel de actina e dos motores de miosina II fluorescente. Para imagens bicolores simultâneas, excite a actina a 488 nanômetros e 2.300 contas a 561 nanômetros. E grave as imagens simultaneamente em uma câmera EMCCD usando um aparelho de dupla emissão.
Use o mesmo sistema de imagem para obter imagens simultâneas do gel de actina e das esferas fluorescentes. O primeiro dia envolve a demonstração de que a rede de actomiosina se comporta como um material elástico. Uma representação esquemática de uma rede de actomiosina é descrita aqui.
Imagens de microscopia de fluorescência demonstram que os filamentos de actina se nucleam espontaneamente e polimerizam em uma rede isotrópica interconectada que se enrola com o tempo e eventualmente se contrai macroscopicamente. A atração da rede inicia-se na periferia do gel e propaga-se para dentro do volume do gel. O centro do gel é marcado com um C.Os feixes filamentares de actina permanecem retos durante a contração da rede.
A distribuição da relação entre o comprimento do contorno e a distância término-terminal em T316 segundos e T327 segundos é mostrada aqui. O segundo objetivo envolve demonstrar que um fluxo de solvente para fora é gerado pela contratilidade da miosina. A imagem do gel em baixa magnificação em estágios intermediários de contração é mostrada aqui.
Esses círculos marcam as posições de quatro contas. As setas marcam a direção global do movimento do talão. As trajetórias das nove contas selecionadas são retratadas aqui.
A resolução da porosidade da rede e o movimento do solvente através dos poros do gel em estágios avançados de contração são descritos aqui. O terceiro objetivo envolve demonstrar que o relaxamento sob tensão é caracterizado por uma constante efetiva de difusão poroelástica. Imagens de fluorescência de visualização superior de um gel de actomiosina em contração em baixa ampliação desde o tempo de mistura até o estado estacionário são mostradas aqui.
As redes de actomiosinas comportam-se como material ativo poroelástico. Ao tentar esse procedimento, trabalhe de forma rápida e precisa e tenha em mente a importância da preservação da superfície.
