O objetivo deste protocolo é descrever como avaliar a quantidade e a distribuição da deposição de ferro no cérebro de um modelo de camundongo com DA. Neste protocolo, usamos camundongos transgênicos 5xFAD de oito meses de idade como modelo de camundongo AD e os comparamos com camundongos do tipo selvagem da mesma idade. Incluímos detalhes dos procedimentos para preparar o reagente químico, seccionar o cérebro, realizar a coloração Perls / DAB e analisar as imagens resultantes.
Anestesiar o mouse adequadamente e verificar a profundidade da anestesia e analgesia. Exponha seu coração e abra o átrio direito. Injete 20 mililitros de PBS e 4% de PFA do ventrículo esquerdo em sequência.
Observe que tremores de fixação devem ser observados. Decapite o rato e extraia seu cérebro. Em seguida, fixe o cérebro em 4% PFA por 12 a 24 horas.
Mergulhe o cérebro em 15% e 30% de sacarose por 12 a 24 horas. Corte o cérebro sagitalmente do meio e use uma das metades para seccionar. Monte o cérebro no botão, coloque um anel de papel alumínio ao redor do cérebro e adicione OCT nele para incorporar o cérebro.
Defina a espessura das seções e a temperatura do criostato. Em seguida, corte o cérebro. Se as seções dobrarem, use escovas macias para desdobrá-las.
Colete cada seção nos slides com PBS e, em seguida, elimine as bolhas na seção. Selecione uma lâmina com tecido cerebral intacto e coloque-a em uma caixa de coloração de plástico cheia de PBS. Posicione a caixa no agitador rotativo ajustado para uma velocidade lenta por cinco minutos para enxaguar completamente o composto OCT residual.
Prepare 20 mililitros de ferrocianeto de potássio a 2% e volume igual de ácido clorídrico a 2%. Em seguida, misture-os em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Prenda a lâmina no tubo usando uma pinça e incube a mistura em banho-maria pré-aquecido a 60 graus Celsius por 30 minutos.
Lave a lâmina com PBS e limpe o excesso de líquido usando papel de seda. Coloque a lâmina plana na bancada do laboratório e até aplique a solução DAB sobre o tecido usando uma pipeta. Incube por 10 minutos para melhorar a coloração de Perls.
Remova a solução excessiva de DAB e enxágue os lenços lavando três vezes com PBS. Desidratar a secção sequencialmente em soluções alcoólicas graduadas e xileno durante três minutos cada. Cubra as seções com uma goma neutra e uma lamínula.
Em seguida, deixe-os secar em uma capela de exaustão. Ligue o microscópio. Ajuste o brilho da fonte de luz.
Concentre-se na seção do cérebro sob uma objetiva de ampliação de 4X. Mova a platina do microscópio para focar nas áreas com altos sinais de coloração Perls / DAB, especialmente o hipocampo e o córtex cerebral. e capturar imagens.
Abra a imagem objetiva com ampliação de 10 e converta o formato da imagem em escala de cinza de 8 bits. Os valores de cinza da imagem foram convertidos em valores OD e, em seguida, a função de limite foi usada para cobrir as áreas positivas de coloração Perls / DAB. Selecione as seguintes opções de configuração e, o mais importante, selecione limitar ao limite para excluir o ruído de fundo.
Por fim, selecione as medições para obter resultados para análise estatística. Para investigar a distribuição e o acúmulo de ferro em um modelo de camundongo AD, realizamos a coloração Perls / DAB de cortes cerebrais sagitais. Altos sinais de Perls / DAB foram observados no hipocampo e no córtex, especialmente no subículo do hipocampo de camundongos 5xFAD, enquanto os cérebros de camundongos selvagens de dois e oito meses mostraram sinal mais fraco.
Com ampliação de mais de 40, o sinal em camundongos 5xFAD aparece em estruturas semelhantes a placas A-beta, consistentes com estudos anteriores. Esses resultados demonstram a eficácia do Perls / DAB como técnica histoquímica para detecção de ferro. Também mostramos dois casos de falha na coloração.
Cobertura excessiva ou desidratação inadequada resultarão nesses casos. A coloração Perls/DAB fornece um sinal mais forte e melhor contraste de fundo do que a coloração Perls convencional, tornando a detecção de ferro mais sensível e precisa. Além disso, detecta o ferro férrico em complexos de proteínas fracamente ligados.
O ferro fortemente ligado, como na hemoglobina, não reage. Isso reduz muito os sinais indesejados causados pelo ferro nos glóbulos vermelhos e na hemoglobina. No geral, a coloração Perls / DAB é apropriada para experimentos com animais e investigações patológicas que requerem especificidade e sensibilidade medial.
Ele fornece aos pesquisadores um método para visualizar e quantificar o acúmulo de ferro às custas de menos tempo e custo.
