Wellcome Trust para a concessão de financiamento de Acesso Livre à Universidade de Oxford. Robert Deacon é um membro do grupo de Oxford OXION, financiado pelo Wellcome Trust conceder WT084655MA.

1. Burrowing 1. Aparelho Projetos recipiente vários foram julgados (por exemplo uma jarra de metal que pode ser facilmente limpo, mas os ratos estavam relutantes em entrar nele). Eventualmente foi descoberto que um comprimento de downpipe de plástico (como ligado ao calhas nas casas) elevou ligeiramente em uma extremidade para evitar deslocamentos acidentais (não-intencional) de pelotas de comida e selado, no outro extremo, foi um eficiente aparelho. Burrows agora são feitas de plástico downpipe, 68 mm de diâmetro, cortado em comprimentos de 20 centímetros de comprimento (Figura 1). Uma extremidade é selada com um bujão de 12 mm de média densidade MDF (MDF). (A proteção respiratória é aconselhável quando se trabalha com mdf). Para limpeza e impermeabilização, um composto adesivo à prova d&#39;água de aroeira pode ser aplicada às superfícies, dentro e fora do mdf, bem como servir de cola-lo para dentro do tubo burrowing. Parafusos de máquina (5 cm de comprimento) são usadas para elevar a outra extremidade of tubo de três centímetros do chão. Dois buracos são perfurados a 1 cm da extremidade aberta do tubo burrowing em um ângulo de 90 ° e os parafusos inseridos e apertados 4. O diâmetro do burrows é provavelmente crítico; Schmid-Holmes et al 19 observaram que os ratos in the wild &quot;toca limpa&quot; principalmente a partir de tocas semelhante em tamanho aos nossos entes artificial.. <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Um rato em um tubo de escavação. 2. Procedimento <ol><li> Habituação Burrowing normalmente é espontânea, mas há um elemento de aprendizagem determinadas. O processo de aprendizagem é reforçada pela facilitação social. Portanto, coloque uma toca cheia durante a noite na gaiola grupo de ratos que são mais tarde a ser testado com um tratamento. Cada escavação é preenchida com 200 g de pellets de alimentos normalmente fornecidos como dieta. (Trata-se de tele tipo comprimido densa de dieta, se uma dieta &quot;expandido&quot; está em uso o burrow manterá menos de 200g). Experimentadores deve levar em consideração fatores ao selecionar um substrato burrowing. Se os ratos estão no racionamento de alimentos (por exemplo, para motivá-los para executar uma tarefa labirinto simultâneos de aprendizagem) não-alimentares substâncias podem ser utilizadas, por exemplo, bolas de argila, como usado para a linha da superfície do solo em vasos de plantas indoor; ervilha cascalho (pedras pequenas ~ 1 cm de diâmetro) e areia. Telha de ervilha e areia, sendo três vezes mais pesado que pellets de alimentos, são substitutos úteis para pelotas do alimento se os ratos estão cavando muito vigorosamente, para evitar um &quot;efeito teto&quot;. </li><li> Baselining Run (preferencialmente dois) de base burrowing testes 48 h para além da mesma maneira como será feito para o teste após o tratamento proposto. O teste é ideal começou por volta das 16:00 se os ratos estão alojados em um 0700-1900 h ciclo claro-escuro. Este é um momento delicadopara testar, pois eles não são normalmente acordados neste momento e burrowing começa mais lentamente do que se fossem assim para a fase escura e, conseqüentemente, muito ativa. Duas horas após o início, um &quot;instantâneo&quot; medição é feita do peso dos alimentos escavados; a toca é esvaziado em um recipiente tarado e pesado e os pellets substituído na toca que é colocada de volta na gaiola. Se o mouse está na toca, apenas suavemente derramá-lo eo conteúdo para o recipiente de pesagem e substituir o mouse na gaiola. O peso burrowed menos duas horas é então calculada por subtração a partir do original 200 g. A leitura final é tomada na manhã seguinte. Tempo não é crítico como os ratos terão voltado a dormir (muitas vezes na toca) e não são mais ativamente burrowing. Use as 2 h medição tomadas no segundo julgamento para formar grupos equilibrados para o desempenho de linha de base. Como burrowing aumenta com a prática 17, baselining também ajuda os ratos para alcançar asymp mais estáveldesempenho totic que revela os efeitos do tratamento melhor. </li><li> Ensaio Para testes, após os tratamentos são administrados os ratos são submetidos ao teste burrowing exatamente o mesmo que na fase de linha de base. Se o teste burrowing é para ser usado cronicamente, recomenda-se que pelo menos 48 h separar os testes para evitar um declínio no desempenho devido ao excesso de exposição ao procedimento. </li><li> Nota NÃO substitua o alimento burrowed no chão da gaiola para a toca. Mesmo que o mouse não tem nada de burrowed, execute o procedimento de pesagem como você faria se tivesse ocorrido burrowing; a perturbação causada por peso tende a estimular o comportamento, e os ratos que já enterrou algumas das substrato, muitas vezes, começar cavando com vigor renovado após a pesando processo. </li></ol> 2. Resultados esperados C57 ~ BL / 6 ratos toca normalmente em torno de 70 g nas duas primeiras horas, e perto de 200 gdurante a noite. Hipocampo ratos lesionados, muitas vezes burrow menos de 5 g 11 (Figura 2). Doença de príon inibe burrowing 1,2, assim como a administração de lipopolissacarídeo 20. Buraqueira pode detectar a doença priônica (scrapie) em 10-12 semanas após a injeção de homogenato de cérebro de doentes, enquanto que os sinais clínicos aparecem apenas em 22 semanas 13. (Figura 3). Buraqueira tem se mostrado sensível às diferenças tensão 15 e knock-out de subunidades de íons de potássio canal 10. <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Peso de pelotas de alimento (medianas e intervalos interquartis) burrowed em duas horas pelo controle e hipocampo lesado camundongos. O último burrowed significativamente menos do que os controles (P = 0,0001). <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Peso dapelotas do alimento (meios) burrowed durante a noite por e controle de scrapie camundongos infectados. Buraqueira aumenta (com prática) em ambos os grupos de semana 7-10 pós-injeção, mas a partir de 12 semanas diminui burrowing no grupo scrapie ea diferença entre os grupos torna-se estatisticamente significativa (superior a dois erros padrão da média). 3. Discussão Nós testamos burrowing em outras espécies de roedores - ratos, gerbils, hamsters e ratos egípcios spiny 8. Todos, mas este último poderia ser induzido a quantidades substanciais burrow de substratos terrestres como cascalho ou areia, mas burrowing de pelotas de comida era muito menos, mesmo depois de vasta experiência com os materiais terrestres. A razão para esta diferença de ratos não é conhecido. Após este trabalho tinha sido feito, foi descoberto que os ratos egípcios spiny de fato não fazem tocas na natureza, eles podem ocupar tocas feitas por gerbils, também a superfície de seus ha naturaisBitat muitas vezes é hard rock. Observação recente em Nairóbi mostrou que, dentro do gênero Acomys, mouse Wilson spiny (Acomys wilsoni) e spiny Percival mouse (Acomys percivali), que se enterram no estado selvagem, também burrowed em laboratório. 4. Nidificação 1. Aparelho Este teste é realizado em gaiolas individuais, sendo que os mesmos utilizados para escavação são adequados. Cama normal deve cobrir o chão a uma profundidade de 0,5 cm. (Variação em profundidade, e roupa de cama muito profundo, poderia afetar a construção do ninho). Cada gaiola é fornecido com um &quot;Nestlet&quot;, um quadrado de 5 cm de batting de algodão prensado (Ancare). 2. Procedimento Os ratos são colocados individualmente em gaiolas de nidificação cerca de uma hora antes da fase escura, e os resultados são avaliados na manhã seguinte. Tal como acontece com construção de galerias, e por razões semelhantes, o tempo não é crítico. 3.Pontuação Os ninhos são avaliados em uma escala de 5 pontos (Figuras 4-8), ea quantidade de untorn Nestlet é também pesava 5. <ol><li> O Nestlet é praticamente intocados (&gt; 90% intacta). </li><li> O Nestlet é parcialmente rasgado (50-90% restantes intactos). </li><li> O Nestlet é mais desfiado, mas muitas vezes não há local do ninho identificáveis: &lt;50% do Nestlet permanece intacta, mas &lt;90% está dentro de um quarto da área do piso da gaiola, ou seja, o algodão não é reunido em um ninho, mas espalhados ao redor da gaiola . Nota: o material pode por vezes estar em uma área ninho amplamente definido, mas a definição crítica é que 50-90% foi picado. </li><li> Um ninho de identificação, mas plana:&gt; 90% do Nestlet é rasgado, o material é reunido em um ninho dentro de um quarto da área do piso da gaiola, mas o ninho é plana, com muros mais altos do que a altura do corpo do rato (enrolado em seu lado) com menos de 50% da sua circunferência. </li><li> A n (próximo) perfeitaest:&gt; 90% do Nestlet é rasgado, o ninho é uma cratera, com muros mais altos do que a altura do mouse corpo em mais de 50% da sua circunferência. </li></ol> Onde o critério de não concordar dividir a diferença. Por exemplo, um ninho perfeito com um pedaço unshredded 0,7 g marcaria 4.5. <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura pontuação Ninho 4 1. <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5 pontos. Nest 2 <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6 pontos. Nest 3 <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Nest pontuação 4 <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Scor Ninhoe 5 4. Resultados esperados Os machos e as fêmeas fazem ninhos, como sua finalidade é a termorregulação, além de ser associada com a reprodução. Para camundongos C57BL / 6, a pontuação ninho para homens e mulheres estão no mesmo intervalo, embora não tenhamos feito uma comparação controlada em um único experimento. A maioria dos mouses C57BL / 6 pontuação 4-5 na construção do ninho, mas quando o hipocampo é lesionada a pontuação média seria em torno de 1-2; uma pontuação de 3 dificilmente será ultrapassado (Figura 9). Nidificação também se mostrou sensível à doença de príon em torno de 10-12 semanas 1,2,16. <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig9.jpg" alt="Figura 9" /> Figura 9. Pontuações Nest (medianas e intervalos interquartis) para controle de ratos e camundongos com lesões do hipocampo, dorsal ventral e completa. Somente os ratos lesionados mostram a inibição completa de aninhamento, então os efeitos da dorsal seletiva e Ventr. Dirregiões al aparecem sub-limiar, mas aditivo. 5. Acumulação 1. Aparelho Uma série de &quot;bases em casa&quot; estão ligados a tubos de malha de arame, selado de forma permanente na extremidade distal onde a pellets alimentos são colocados e, temporariamente, na extremidade proximal por um tampão de madeira. Isto é usado para impedir que os ratos que entram os tubos antes de adaptação para a base de casa tem occurred7. O aparelho (Figura 10) pode ser feita de várias maneiras, desde que os princípios básicos são respeitados. Nosso consiste de uma linha de 8 caixas de madeira, cada um 30 x 13 x 15 cm, com tampas de acrílico transparente. Cada um é fornecido com uma garrafa de água, e tem um buraco na parte de trás em que o tubo de entesouramento é push-equipada. Os tubos são feitos de plástico preto, 10 cm de comprimento, 40 mm de diâmetro, juntou-se a um tubo de malha de arame, 45 cm de comprimento, 4 cm de diâmetro, para formar um comprimento total de 50 cm. A malha é composta de 13 quadrados mm,e é um rolo de casal com as malhas mis-alinhados para fazer os buracos na malha menor e evitar pelotas do alimento cair completamente. Se seis milímetros de malha quadrada está disponível este é um material melhor como um rolo seria suficiente. A extremidade distal do tubo, onde os alimentos são colocados pellets, está fechado. A extremidade proximal é selada com um bujão removível de madeira. <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig10.jpg" alt="Figura 10" /> Figura 10. Mice nos tubos de açambarcamento 2. Procedimento <ol><li> Tipicamente, o entesouramento é muito variável pela primeira vez e alguns ratos não podem acumular em tudo. Entesouramento, como construção de galerias, melhora com a prática. Portanto, onde o design experimental permite, sessões baselining são os melhores dados antes de um tratamento é administrado. Claramente, isto não é prático, se a variável independente é inata, como com um rato (não-condicional) mutante ou ao testar linhagens de camundongos diferentes. </li><li> Um rato é colocado emcada caixa no início do dia a habituar a ele. A caixa é fornecida com um túnel de papelão que foi na gaiola verdadeiro grupo de casa por pelo menos uma noite, também uma generosa porção de cama suja, fazer-se sentir como &quot;casa&quot;. Acesso ao tubo de entesouramento é impedido até a noite com uma rolha de madeira. 100 g pellets de alimentos (uma mistura de pequenos e grandes) é colocada na extremidade distal do tubo de entesouramento (deitando-os em, no outro extremo com o tubo na vertical). Para certificar-se o mouse é levemente com fome antes do início dos testes, a caixa de casa não é fornecido com alimentos. </li><li> Pouco antes do início da fase escura, retire o tampão de madeira para permitir o acesso do rato ao tubo de entesouramento. Na manhã seguinte (novamente, o tempo não é crítico) Recolher e pesar todos os pellets de alimentos que foram acumulados na caixa de base. </li></ol> 6. Resultados esperados Usando C57BL feminino / 6 ratos, o valor médio acumulado seria de cerca de50-70 g. Lesões do hipocampo fortemente suprimir hoarding11, enquanto as lesões córtex pré-frontal tem apenas um efeito fraco 12 (Figura 11). <img src="/files/ftp_upload/2607/2607fig11.jpg" alt="Figura 11" /> Figura 11. Peso de pelotas de alimento acumulado por controle e medial córtex pré-frontal-lesionada camundongos (medianas e faixas interquartil). Embora as medianas diferem consideravelmente, a alta variabilidade nos controles, o resultado está longe de ser estatisticamente significativa (P = 0,3).

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

<html> Estes testes são extremamente simples de executar, mas os tamanhos de efeito são muito grandes, tornando-os extremamente sensíveis aos tratamentos, as diferenças de tensão, etc Eles estão em conformidade com o &quot;Requinte&quot; aspecto de Russell e Burch 3 Rs &quot;18. Na verdade, o bom desempenho em testes como burrowing parece ser um indicativo de boa saúde geral dos animais. Portanto, este poderia ser um bom teste para avaliação do bem-estar animal. A importância do enriquecimento ambiental para roedores de laboratório é bem reconhecida nos dias de hoje. Fornecimento de material de nidificação é agora uma prática comum em casas de muitos animais, e isso é fácil de fazer. O entusiasmo com que os ratos escavam tocas faz um enriquecimento potencialmente excelente, mas, infelizmente, uma &quot;auto-recarregamento&quot; toca o que seria uma maneira prática de fornecer este ainda não foi desenvolvido. Se encontrar ratos hoarding enriquecendo ainda não foi determinada. _content &quot;&gt; Uma desvantagem é que os dados gerados por esses testes é geralmente não-paramétricas (não gaussianas na distribuição), de modo apropriado as estatísticas não-paramétricas são necessários para analisá-los, por exemplo, o Mann-Whitney U para comparações pairwise, Kruskal- Wallis ANOVA para o grupo multi-dados. Se designs medidas repetidas são usadas, uma vez que não há nenhum teste ANOVA adequada para dados não-paramétricos, os resultados podem ser transformadas, por exemplo, raiz quadrada ou procedimentos de registro para fazê-los obedecer a uma distribuição mais normal . As medições do aparelho podem ser ligeiramente diferentes daqueles especificados no texto (útil para pesquisadores EUA), mas grandes diferenças devem ser evitados. No entanto, em alguns casos, outros experimentadores podem encontrar diferentes construções funcionam melhor do que as descritas aqui. Como para todas as medições de comportamento, os ratos devem ser testadas para ver se seus níveis de atividade são normais, como a inatividade terá, obviamente, uma detrimental efeito sobre as espécies típicas comportamentos. Quando scrapie camundongos infectados foram mostrando burrowing prejudicada e nidificação, seus níveis de atividade foram normais (testado em um aparelho de campo aberto). De fato, um período de hiperatividade ocorre em torno de 2-4 semanas após esses comportamentos típicos da espécie são os primeiros prejudicada 2. O comprometimento forte produzida por lesões do hipocampo na construção de galerias, de nidificação e entesouramento, que são espécies típicas comportamentos, complementa as deficiências no aprendizado espacial e Memória9 que são tão bem estabelecidos os efeitos dessas lesões. Eles parecem ser equivalentes aos prejuízos nas atividades da vida diária tão característico da AD 14. Estes testes típicos da espécie pode muito bem provar ser de grande utilidade na triagem pré-clínicos para tratamentos do mal de Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas 14. Em muitas doenças cérebro humano uma capacidade perda ou redução para realizar véspera normaistarefas ryday é tão importante como outras características da doença, como comprometimento cognitivo. Particularmente, esta perda pode exigir o envolvimento dos cuidadores e da grande fardo socioeconômico este tantas vezes impõe.

assessing burrowing, nest construction, and hoarding in mice

Deterioração da capacidade de realizar &quot;atividades da vida diária&quot; (ADL) é um sinal precoce da doença de Alzheimer (AD). Triagem comportamental pré-clínicos de possíveis tratamentos para AD atualmente em grande parte concentra-se em testes cognitivos, que freqüentemente exige equipamentos caros e muito tempo experimentador. No entanto, a memória episódica humano (o aspecto mais severamente afetados de memória em AD) é diferente para a memória dos roedores, o que parece ser em grande parte não-episódica. Portanto, as formas atuais de triagem para tratamentos novos para a AD AD em roedores são intrinsecamente improváveis ​​de sucesso. Uma nova abordagem à triagem pré-clínicos seria caracterizar a ADL de camundongos. Por sorte, vários testes, tais têm sido recentemente desenvolvidos na Universidade de Oxford, e aqui os três mais sensíveis e bem caracterizadas são apresentados. Burrowing foi desenvolvido em Oxford 13. Ela evoluiu a partir de uma necessidade de desenvolver um paradigma hoarding mouse. Mais publicarparadigmas hoarding ed roedores necessária uma fonte de alimento distante para ser ligada à gaiola por uma passagem de ligação. Isso implicaria a modificação da gaiola, bem como fazer um mouse à prova de passagem de conexão e fonte de alimento. Por isso, foi considerado se seria possível colocar a fonte de alimento dentro da gaiola. Verificou-se que se um contêiner foi colocado no chão, foi esvaziado na manhã seguinte., As pelotas de alimentos foram, no entanto, simplesmente depositado em uma pilha na entrada de contentores, ao invés de colocados em um lugar discreto fora do container, como seria de esperar se os ratos eram verdadeiramente acumular-los. Inspeção cuidadosa mostrou que os ratos estavam realizando escavação (&quot;burrowing&quot;) movimentos, não carregando a pellets em suas bocas para um lugar escolhido como fariam se realmente hoarding-los 6. Pelotas do alimento não é um substrato essencial para a construção de galerias; ratos irá tubos vazios cheios de areia, cascalho, mesmo roupa de cama sujas de sua própria gaiola. Maismais, eles vão esvaziar um tubo cheio mesmo se um vazio é colocado próximo a ele 8. Vários protocolos de nidificação existem na literatura. O Oxford apresentar um simplifica o procedimento e tem um sistema de pontuação bem definidos para a qualidade do ninho 5. Um paradigma hoarding foi desenvolvido mais tarde em que os ratos, ao invés de acumulação de volta para a jaula casa real, foram adaptados a viver na &quot;base&quot; de um aparelho de entesouramento. Esta base de casa foi conectado a um tubo feito de malha de arame, a extremidade distal do que continha a fonte de alimento. Este arranjo provou rendimento bom comportamento de manada, enquanto os ratos foram adaptados a viver na &quot;base&quot; durante o dia e só autorizados a entrar no tubo de acumulação à noite.

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Assessing Burrowing, Nest Construction, and Hoarding in Mice

Construção de galerias, de nidificação e açambarcamento são espécies típicas atividades que os ratos prontamente executar em laboratório. Este artigo descreve como podem ser simplesmente mais barato avaliados. Estes protocolos são extremamente sensíveis à tensão mouse, lesões cerebrais e doenças. Além disso, eles constituem &quot;enriquecimento ambiental&quot; para os ratos, e encarnar o &quot;refinamento&quot; aspecto do &quot;3 Rs&quot; 18.

Avaliar buraqueira, Construção Nest, e Hoarding em Ratos

Deterioration in the ability to perform "Activities of daily living" (ADL) is an early sign of Alzheimer's disease (AD). Preclinical behavioural screening ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.8K visualizações.  University of Oxford. Construção de galerias, de nidificação e açambarcamento são espécies típicas atividades que os ratos prontamente executar em laboratório. Este artigo descreve como podem ser simplesmente mais barato avaliados. Estes protocolos são extremamente sensíveis à tensão mouse, lesões cerebrais e doenças. Além disso, eles constituem "enriquecimento ambiental" para os ratos, e encarnar o "refinamento" aspecto do "3 Rs" 18.

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T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-maze Alternância forçado e Tarefas esquerda-direita para a Avaliação da Discriminação de Trabalho e Memória de Referência em Ratos

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Neurociência

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Avaliando Neurogênese Primária em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões Usando Imunomarcação

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

Avaliando a aprendizagem espacial e memória em pequenas Squamata Répteis

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.

Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Assessing Pupil-linked Changes in Locus Coeruleus-mediated Arousal Elicited by Trigeminal Stimulation

Current scientific literature provides evidence that trigeminal sensorimotor activity associated with chewing may affect arousal, attention, and cognitive performance. These effects may be due to widespread connections of the trigeminal system to the ascending reticular activating system (ARAS), to which noradrenergic neurons of the locus coeruleus (LC) belongs. LC neurons contain projections to the whole brain, and it is known that their discharge co-varies with pupil size. LC activation is necessary for eliciting task-related mydriasis. If chewing effects on cognitive performance are mediated by the LC, it is reasonable to expect that changes in cognitive performance are correlated to changes in task-related mydriasis. Two novel protocols are presented here to verify this hypothesis and document that chewing effects are not attributable to aspecific motor activation. In both protocols, performance and pupil size changes observed during specific tasks are recorded before, soon after, and half an hour following a 2 min period of either: a) no activity, b) rhythmic, bilateral handgrip, c) bilateral chewing of soft pellet, and d) bilateral chewing of hard pellet. The first protocol measures level of performance in spotting target numbers displayed within numeric matrices. Since pupil size recordings are recorded by an appropriate pupillometer that impedes vision to ensure constant illumination levels, task-related mydriasis is evaluated during a haptic task. Results from this protocol reveal that 1) chewing-induced changes in performance and task-related mydriasis are correlated and 2) neither performance nor mydriasis are enhanced by handgrip. In the second protocol, use of a wearable pupillometer allows measurement of pupil size changes and performance during the same task, thus allowing even stronger evidence to be obtained regarding LC involvement in the trigeminal effects on cognitive activity. Both protocols have been run in the historical office of Prof. Giuseppe Moruzzi, the discoverer of ARAS, at the University of Pisa.

To verify whether trigeminal effects on cognitive performance involve locus coeruleus activity, two protocols are presented that aim to evaluate possible correlations between the performance and task-related pupil size changes induced by chewing. These protocols may be applied to conditions in which locus coeruleus contribution is suspected.

Avaliação de alterações ligadas aos alunos na excitação mediada por Locus Coeruleus provocada pela estimulação trigeminal

Current scientific literature provides evidence that trigeminal sensorimotor activity associated with chewing may affect arousal, attention, and cognitive ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

Medição quantitativa de proteínas sintetizadas intrathecally em camundongos

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. Development of these tools is crucial for understanding complex behaviors and cognition and for advancing clinical applications. However, it remains a challenge to densely record from cell populations stably and continuously over long time periods. Many popular electrodes, such as tetrodes and silicon arrays, feature large cross-diameters that produce damage upon insertion and elicit chronic reactive tissue responses associated with neuronal death, hindering the recording of stable, continuous neural activity. In addition, most wire bundles exhibit broad spacing between channels, precluding simultaneous recording from a large number of cells clustered in a small area. The carbon fiber microelectrode arrays described in this protocol offer an accessible solution to these concerns. The study provides a detailed method for fabricating carbon fiber microelectrode arrays that can be used for both acute and chronic recordings in vivo. The physical properties of these electrodes make them ideal for stable and continuous long-term recordings at high cell densities, enabling the researcher to make robust, unambiguous recordings from single units across months.

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

This protocol describes a procedure for constructing carbon fiber microelectrode arrays for chronic and acute in vivo electrophysiological recordings in mouse (Mus musculus) and ferret (Mustela putorius furo) from multiple brain regions. Each step, following the purchase of raw carbon fibers to microelectrode array implantation, is described in detail, with emphasis on microelectrode array construction.

Construção e Implementação de Matrizes de Microeletrodos de Fibra de Carbono para Gravações In Vivo Crônicas e Agudas

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...

Implante Micro-Drive para Registro da Atividade Neural Diária em Camundongos Juvenis

A Lightweight Drive Implant for Chronic Tetrode Recordings in Juvenile Mice

In vivo electrophysiology provides unparalleled insight into the sub-second-level circuit dynamics of the intact brain and represents a method of particular importance for studying mouse models of human neuropsychiatric disorders. However, such methods often require large cranial implants, which cannot be used in mice at early developmental time points. As such, virtually no studies of in vivo physiology have been performed in freely behaving infant or juvenile mice, despite the fact that a better understanding of neurological development in this critical window would likely provide unique insights into age-dependent developmental disorders such as autism or schizophrenia. Here, a micro-drive design, surgical implantation procedure, and post-surgery recovery strategy are described that allow for chronic field and single-unit recordings from multiple brain regions simultaneously in mice as they age from postnatal day 20 (p20) to postnatal day 60 (p60) and beyond, a time window roughly corresponding to the human ages of 2 years old through to adulthood. The number of recording electrodes and final recording sites can be easily modified and expanded, thus allowing flexible experimental control of the in vivo monitoring of behavior- or disease-relevant brain regions across development.

Autor em destaque: um implante de acionamento leve para gravações crônicas de Tetrode em camundongos juvenis  

Here, we describe a micro-drive design, surgical implantation procedure, and post-surgery recovery strategy that allow for chronic field and single-unit recordings from multiple brain regions simultaneously in juvenile and adolescent mice across a critical developmental window from postnatal day 20 (p20) to postnatal day 60 (p60) and beyond.