Este método de economia de tempo reduz a variabilidade entre rodadas de procedimentos imunohistoquímicos em estudos de neurociência para otimizar a visualização da anatomia e proteínas e tecidos locais. A principal vantagem dessa técnica é que ela reduz o tempo necessário para criosecção e montagem de tecido cerebral, combinando múltiplos cérebros em um único bloco congelado. Embora esta técnica seja otimizada para seções coronais de cérebros de roedores, ela pode ser adaptada a seções sagitas ou transversais ou diferentes tipos de tecidos, como músculo ou fígado.
Após a perfusão transcárquia bem sucedida, pós-fixar os cérebros dos animais em um frasco de 25 mililitros de 4% de paraformaldeído na PBS por 24 horas. Depois disso, use fórceps de ponta sem corte para remover os cérebros do paraformaldeído. Transfira o cérebro para um frasco com aproximadamente 20 mililitros de solução de 30% de sacarose em TBS.
Mantenha os cérebros e a solução até que eles afundem no fundo do frasco. Em seguida, coloque um copo de vidro de 500 mililitros em uma cama de gelo seco em um balde de gelo. Em seguida, despeje 300 a 400 mililitros de isopentane no béquer.
Mantenha a isopentane entre 45 negativos e 50 graus Celsius negativos. Na parte superior do banco, encha um molde descartável de incorporação aproximadamente meio cheio com temperatura de corte ideal ou composto OCT. Use uma agulha para remover quaisquer bolhas de ar do molde.
Use os fórceps de ponta para remover o primeiro cérebro da solução de sacarose. Em seguida, use uma nova lâmina de barbear para remover o cerebelo e lâmpadas olfativas antes de separar os hemisférios. Em seguida, dê ao cérebro um sistema numérico de nomeação.
Use fórceps contundentes, pegue o cérebro para ser colocado na posição dois, e oriente-o com o lado a ser cortado primeiro voltado para cima. Abaixe o cérebro para dentro do OCT e use a pinça para ajustar sua posição até que fique independente. Uma modificação fundamental desta técnica é o espaço em branco na posição um.
Este espaço é designado para permitir fácil identificação da orientação do megacérebro e, portanto, identificar o animal associado a cada cérebro. Depois de todos os cérebros terem sido posicionados no molde, adicione OCT suficiente para cobrir os topos do cérebro, em seguida, use uma agulha para remover quaisquer bolhas de ar. Segure o canto do molde com fórceps garantindo que os fórceps não fiquem parcialmente submersos no OCT.
Em seguida, abaixe o molde para dentro da isopia para que o terço inferior do molde fique submerso. Após 30 segundos, abaixe todo o molde na isopentane e solte-o dos fórceps. Após três minutos, use os fórceps para remover o molde da isopentane.
Enrole imediatamente o molde e seu conteúdo em papel alumínio e rotule-o adequadamente. Transfira o megacérebro para um congelador negativo de 20 graus Celsius por um mínimo de 24 horas. Primeiro, coloque a temperatura do armário criostat para 19 graus Celsius negativo.
Retire o megacérebro do congelador e coloque-o no criostat. Em seguida, coloque um mandril e dois pincéis finos no criostat. Depois disso, rotule os slides com o número de identificação do megacérebro e o número do slide e coloque os slides no aquecedor de slides.
Em seguida, desembrulhe o megacérebro e use uma lâmina de barbear para cortar os cantos do molde. Distribua uma fina camada de OCT no mandril. Em seguida, rapidamente colocar o megacérebro no mandril.
Depois que o OCT estiver completamente congelado, aplique uma camada de dois milímetros de OCT ao redor dos lados do megacérebro e deixe que ele corra pelos lados para o mandril. Use uma lâmina de barbear para remover qualquer excesso de OCT dos lados e parte inferior do mandril. Primeiro, posicione o mandril montado com o megacérebro na cabeça do criostat.
Em seguida, coloque o criostat para a espessura desejada. Corte o OCT e o tecido conforme necessário para chegar à região cerebral desejada para coleta de tecidos. Em seguida, abaixe a placa anti-rolo até que ela repouse no palco e gire a alça criostat para tomar uma única seção.
Retire lentamente a placa anti-rolo, tomando cuidado para que a seção do tecido não seja tocada. Use delicadamente as pincéis para desenrolar a seção de tecido até que esteja plana. Se necessário, segure o oct flat usando as pincéis para evitar o rolamento.
Em seguida, remova o slide do aquecedor de slides e passe o lado da etiqueta de slides para baixo sobre a seção megacérebro e deixe-o grudar no slide. Aplique rapidamente uma gota de PBS na seção tecidual. Usando um pincel fino mergulhado na PBS, escove todas as bolhas na seção tecidual e desdobre o tecido para que ele fique deitado no escorregador.
Por fim, coloque o slide no aquecedor para secar por 45 minutos e armazene o slide a 80 graus Celsius negativo. Neste protocolo, tecidos cerebrais de nove animais foram preparados e criosectionados simultaneamente. Após a crioseção, a coloração de H&E pode ser realizada para avaliar a qualidade da crioproteção.
Resultados representativos da molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada uma ou Iba1 coloração de microglia mostram coloração consistente entre cada cérebro de estudo em um único megacérebro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar constantemente a temperatura enquanto congela o megacérebro para evitar rachaduras ou descongelamento e, em seguida, recongelamento do tecido que leva à integridade anormal do tecido. Não é aconselhável segregar diferentes grupos de tratamento em megacérebros separados, pois isso pode criar variância entre os grupos durante a coloração e reduzir o viés e a subjetividade durante a imagem e análise.
Não se esqueça que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como usar PBE e trabalhar em um capuz devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
