Порядок легких инженерных

Резюме

Мы разработали легких decellularized внеклеточного матрикса и роман биомиметических биореактор, который может быть использован для создания функциональной ткани легкого. По посева клеток в матрице и культивирования в биореакторе, мы генерируем ткани, которая демонстрирует эффективный обмен газов при трансплантации в естественных условиях в течение коротких периодов времени.

Аннотация

Легкие ткани, в том числе рака легких и хронических заболеваний легких, таких как хроническая обструктивная болезнь легких, совокупно составляют около 280 тысяч смертей ежегодно, хроническая обструктивная болезнь легких в настоящее время является четвертой по значимости причиной смерти в США ^1. Вклад в этом смертности является то, что легкие как правило, не ремонт или восстановление за микроскопических, клеточном уровне. Таким образом, легочной ткани, которая повреждена дегенерацией или инфекция, или легочной ткани, которая хирургически удаленных не является функционально заменил в естественных условиях. Чтобы выяснить, является ли легочной ткани могут быть созданы в лабораторных условиях, мы относились легкие от взрослых крыс с помощью процедуры, которая удаляет клеточные компоненты для производства легких бесклеточной внеклеточного матрикса эшафот. Это эшафот сохраняет иерархическую ветвящиеся структуры дыхательных путей и сосудистой сети, а также практически не тронутой базальной мембраны, в состав которого входят коллаген IV, ламинин и фибронектин. Строительные леса установлен в биореакторе, имитирующем важнейшие аспекты физиологии легких, таких как отрицательные вентиляции давления и пульсирующего сосудистой перфузии. По культивирования легочного эпителия и сосудистого эндотелия в биореакторе монтажа лесов, мы способны генерировать легочной ткани, которая фенотипически сопоставимы с нативной ткани легких и, что может принять участие в газообмене на короткие промежутки времени (45-120 минут). Эти результаты обнадеживают, и предполагают, что заселение легких матрица жизнеспособной стратегией для легких регенерации. Эта возможность предоставляет возможность не только работать в направлении увеличения поставок легких тканей для трансплантации, но и для изучения дыхательной клеточной и молекулярной биологии в пробирке в течение более длительного времени и в более точной микроокружения, чем ранее было возможно.

протокол

1. Биореактор Ассамблеи

Подробная цифра (ы) дизайн биореактор и сборки для обеих decellularization и культуры предоставляются на рисунках 1 и 2, соответственно. Все компоненты должны быть стерилизованы перед сборкой из биореактора. Следующие конкретные моменты отмечены:

ПОДКЛЮЧЕНИЕ:

1. Артериальная канюля состоит из Luer-фитингом связано с Y-разветвитель на коротком участке трубы. Луер-Лок разъем подключен к перфузии труб, и сегмент Y, которая не пришита к легочной артерии связан с односторонним клапаном. Односторонний клапан ориентирован так, что жидкость может быть составлен в НКТ (в противоположном направлении, что и перфузии), но во время перфузии органов всех средних впадает в легких.
2. Трахеи канюли также состоит из Луер-Лок разъем связан с Y-разветвитель с трубками. Луер-Лок подключается к дыханию петли между резервуаром трахеи и основной камере. Сегмент Y-коннектор, который не зашивается до трахеи также связано с односторонним клапаном. Односторонний клапан ориентирована таким же образом, как артериальной канюли.

ФУНКЦИИ:

3. Односторонние клапаны в артериальной и трахеи канюли используются для очистки пузырьков воздуха в трубки, позволяя разворота потока в трубопроводе и допускающее поэтому пузырьки воздуха должны быть удалены.
4. "Дыхание цикла" включает в себя две односторонние клапаны, расположен так, что средний следующим другой путь в и из легких. Более подробное описание этой функции приведены в публикации до нашей лаборатории ^2.
5. Сосудистой перфузии осуществляется при помощи валика насоса. Средний это перфузии в легочной артерии с помощью прилагаемого канюли, протекает через легкие сосуды, и из легочной вены прямо в основной биореактор, где средний составляется для перфузии.

2. Орган Harvest

1. Эвтаназии взрослых (3-6 месяца) Fischer 344 крыс натрия пентобарбитал передозировки, в соответствии с руководящими принципами, изложенными Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации (60 мг / кг, IP). Примечание: решение включает в себя фенобарбиталом гепарина на 100 единиц / мл для антикоагулянтов.
2. Спрей или протрите грудь и живот с 70% этанола.
3. Открытое грудной полости, выставляя сердца и легких, заботясь, чтобы не повредить легкие. Аккуратно сделать небольшое окно, через диафрагму в грудную полость, в результате чего легкие отказаться, а затем разверните этот разрез горизонтально подвергать основы легких. Сделайте два разреза вертикально через ребра, и отказаться от грудной клетки, чтобы разоблачить сердца и легких.
4. Подготовка системы тяжести перфузии, т.е. с помощью шприца с поршнем удалены, 3-полосная кран, и ~ 20 см трубка с 1.5inch, 21-иглы. Поддерживать шприц на ~ 20 см выше животного использовании кольца стенда. Убедитесь, что весь воздух удаляется из перфузии труб.
5. Вырезать правое предсердие стечь кровь, не давая ей вернуться в легкие. Резка левого предсердия, что позволяет легко дренажной крови и перфузат из легких также может быть полезным, но не является необходимым.
6. Введите иглу в основание правого желудочка и открытого крана, чтобы заливать легкие решения гепарина и нитропруссид натрия (50U/ml и 1ug/ml, соответственно) в PBS. Убедитесь, что легочная артерия заполняется перфузии жидкости, а также, что кровь является освобождение из легких. При необходимости, пополнить перфузии шприц с дополнительной жидкости. Обычно только ~ 10 мл не требуется.
7. Продолжить перфузии, пока легкие ясны крови, затем остановить перфузии.
8. Рассекают трахею бесплатно, вверх в шею, насколько это возможно. Обеспечить трахеи отделен от пищевода. Рассеките всех остальных подключений к сердцу, легким и трахеи, и удалить целиком.
9. Использование скальпеля или острыми ножницами, отрезать верхушки сердца, обнажив правый и левый желудочки.
10. Иглу легочного ствола через правый желудочек, а шов на месте. Удалите излишки ткани левого желудочка.
11. Иглу трахеи и шов на месте. Убедитесь, что оба трахеи и легочной артериальной канюли расположены так, что нет торсионное напряжение на трахее, легких или крупных сосудов (рис. 1).
12. Убедитесь, что Есть нет пузырьков воздуха в артериальной канюли, так как пузырьки воздуха в ловушке система может предотвратить постоянный поток через орган. В некоторых случаях, пузырек воздуха может полностью остановить жидкости flow.To достичь этого, место сердца / легкого блока в сосуде PBS. Используйте шприц с иглой вводят небольшое количество PBS в сердце канюли высылать любого пузырей.
13. Промывание дыхательных путей с PBS 4-5 раз, чтобы удалить как можно больше воздуха как можно дальше от легких.
14. После промывания шагы полны, раздувать легкие с PBS, содержащего натрия нитропруссид (SNP) в 1ug/ml. Поместите пробку на трахеи канюли, поэтому решение остается в легких. Разрешить легких для инкубации в течение 30 минут, как же раствор проходит через сосудистую через легочную артерию, чтобы разрешить расширение сосудов.
15. Подключите сердце / легкие биореактор шапка использованием Луер-Лок соединений связано с У-образный канюли, описанный в "биореактор Ассамблеи" выше. (Рис. 1).

3. Орган Decellularization

1. Подключите колпачок (с легкими прилагается) decellularization аппарата (рис. 1). Легочной артерии канюли должны подключаться к перфузии линии, и трахеи канюли должны свободно плавать. Убедитесь, что все линии ясны воздуха. Как описано выше, воздух в линии могут быть источником бедных decellularization, препятствуя потоку decllularization жидкости. Воздух в ловушке система может также сохраняться в культуре времени, когда оно может иметь негативное влияние на выживаемость клеток ^3.
2. Inflate легкого с PBS / SNP, пока легкие полны, но не чрезмерно раздуты. Сразу же шапка трахеи канюли, так что легких остается завышенным.
3. Заливать легкого с PBS / SNP не менее 15 минут при температуре ~ 15 мм рт.ст. (20 см H ₂ O давления). После 15 минут или дольше, удалить пробку из трахеи канюли, чтобы легких сдуваться.
4. Продолжить перфузии с PBS / SNP в течение 30 минут. При необходимости, пополнить PBS / SNP для обеспечения перфузии давление поддерживается на уровне 10-15 мм рт.
5. Начало перфузии с decellularization решение (8 мм CHAPS, 1M NaCl, 25 мМ ЭДТА в 1X PBS). Позаботьтесь, чтобы гарантировать, что все линии ясны воздуха. Вакуумная система может быть полезно обеспечить всасывание.

Заливать с decellularization раствора до 500 мл раствора перфузии через легкие. Оптимальное давление <15 мм рт.ст. (~ 20 см H ₂ O). Как правило, это потребует 2,5 часа. Расход, как правило, очень медленно (0.2-0.5ml/minute) на начальном этапе, и быстро увеличиваться в течение второго часа примерно 1ml/minute или выше. Периодически удалять использоваться decellularization жидкости из биореактора, обеспечивая достаточное количество жидкости остается для поддержки легких и трахеи канюли.

4. Орган промывки и стерилизации

1. Передача легких и биореактор с капюшоном культуры ткани. Начните полоскание стерильной PBS, удаляя 500 мл банки, которые содержали decellularization жидкости и замены с стерильные банки, содержащие до 1 л стерильной PBS. Использование вакуумного всасывания для обеспечения линии ясны воздуха.
2. PBS заливать через сосудистую на 10-15 мм рт.ст., таким же образом, как и для decellularization. Периодически, удаления отходов PBS из биореактора и заменить и / или пополнения счета банка PBS свежей стерильной PBS. Желательно, чтобы использовать стерильную технику.
3. Продолжить промывание глаз по крайней мере до 2,5 л стерильной PBS имеют перфузии легких.
4. Передача легкого новые, стерильные системы биореактор содержащих свежие PBS. Убедитесь, что и весь цикл перфузии и целые строки дыхательных путей заполнены жидкостью. Все последующие шаги будут использовать пульсирующий насос заливать легких при 5ml/min.
5. Стерилизовать эшафот, либо через ночь перфузии с PBS + 10% FBS + 10% перо-стрептококк растворе или в течение 3 часов с 0,1% надуксусной кислоты в PBS. Последний требует промывки легких с 3 изменений 250 мл PBS в течение нескольких часов для удаления остатков кислоты. Для каждого полоскания, легких должны быть вентилируемыми, а также для обеспечения перфузии, что все части ткани промываются тщательно.
6. Передача легких к 37 ° C инкубатора и заливать с PBS, который имеет 10% ЭТС и 10% пенициллина / стрептомицина в течение ~ 1 час или пока температура находится в равновесии, при подготовке к benzonase лечения.
7. Лечить легкого с benzonase, чтобы удалить остатки ДНК:
   1. Теплый benzonase буфера (см. таблицу реагентов) до 37 ° C.
   2. Для каждого легкого, заполнить один шприц с 10 мл benzonase буфер только и один шприц с 10 мл 90U/ml benzonase в буфере.
   3. Стоп перфузии легких.
   4. Inflate дыхательных путей с benzonase буфера.
   5. Разрешить легких сдуваться (в течение ~ 1 минуты). Затем, раздувать легкие с benzonase решение. Во время инфляции с буфером benzonase & benzonase, старайтесь избегать любых инъекционных воздуха в легких.
   6. Разрешить легких сидеть без перфузии или вентиляции при температуре 37 ° С в течение 1 часа после раздувания с benzonase.
8. Резюме перфузии с PBS + 10% FBS, 10% пенициллин / стрептомицин, который уже в биореакторе, и продолжают в течение ночи. На следующий день, легких может быть либо хранить при температуре 4 ° С (на срок до 3 месяцев) или подготовленные для сотовых посева.
9. Для подготовки леса для сотовых репопуляции, замените PBS / ФПС / benzonase решение с ~ 250 мл питательной среды. Заливать, по крайней мере за один час до клетки вводятся,ой заменить свежей питательной среды непосредственно перед посевом клеток.

5. Recellularization

Выбор ячейки источник для органа пересев остается на усмотрение отдельных исследователей. Многие источники ячейка может быть использована, в том числе коммерчески доступных населению, свежевыделенных новорожденных или плода легочных клеток, эмбриональные стволовые клетки, или коммерчески доступных источников клетки. Конкретные протоколы изоляции для этих клеточных популяций может быть найден в другом месте ^4,5,6. Здесь мы предоставляем инструкции по семени и эндотелиальных и эпителиальных клеточных популяций.

Эндотелиальная посева:

1. Подготовка приостановление желаемого эндотелиальной клеточной популяции, в подходящей культуральной среде. Фильтры суспензии клеток через 40um сито, чтобы удалить ячейки ячейки сгустки. Типичный эндотелиальных посева в нашей лаборатории будет использовать около 30 миллионов крыс легких микрососудистых эндотелиальных клеток в 60 мл питательной среды.
2. Внесите клеточной суспензии в небольшой водоем временно включены в перфузии петли биореактора (рис. 2). Убедитесь, что трубы из этого водохранилища и весь цикл перфузии ясно пузырьков воздуха.
3. Настаивать клеток в легочной артерии на 3ml/min при помощи валика насоса.
4. После клетка инфузии, продолжают перфузии со средним рециркуляции из основных биореактор на желаемый курс.
5. На ежедневной основе, убедитесь, что перфузии трубки ясно пузырьков воздуха.
6. Средний должны быть заменены на свежую среду регулярно; это часто делается каждые 3-4 дня.

Эпителиальные посева:

1. Подготовка суспензии клеток в эпителиальные желаемого клеточной популяции. В нашей лаборатории, это правило, состоит из примерно 50-100 миллионов новорожденных крыс легочных клеток. Фильтры населения через сито 40um клеток и приостановить в 15 мл культуральной среды в шприц. Заполните дыхательных путей резервуар с 80 мл питательной среды.
2. Место в биореакторе 37 ° C культуре ткани инкубатор, и подключить шприцевой насос для вентиляции. Убедитесь, что все вентиляционные линии ясны воздуха.
   1. Семенной клеток в легких путем введения 15 мл клеточной суспензии в качестве одного болюса в трахеи канюли.
   2. Сразу же начинается один, медленное дыхание использованием шприцевой насос. Это дыхание осуществляется путем изъятия 60 мл воздуха из основных биореакторе на 3ml/minute, таким образом, продолжительностью около 20 минут. Обеспечить воздушные фильтры на главной биореактора являются увенчан прочь сразу после введения суспензии клеток и прежде, чем начать медленное дыхание.
3. Разрешить легкие сидеть статически примерно 18hrs, а затем начинают медленное сосудистой перфузии (около 0,5 мл / мин).

6. Органной культуры

Хотя детали перфузии и вентиляции будет меняться в зависимости от эксперимента, следующие моменты отметил:

1. В эндотелиальных культуры, перфузии обычно выполняется на 1-3 мл / мин при помощи валика насоса. В эпителиальных культуры, вентиляции обычно предоставляется на непрерывной скоростью 1 дыхания в минуту при помощи шприца насоса. Вывод 5-10мл воздуха из основных биореактор, как правило, требуется для осуществления вентиляции легких при нормальном дыхательный объем. Из-за необходимости поддерживать биореактор герметичном во время вентиляции, вентиляция должна быть приостановлена ​​ежедневно и воздуха в основной камере должны быть обменены. Весь воздух в системе воздуха в помещении, что составляет примерно 21% кислорода парциальное давление. 5-10мл вывода воздуха из биореактора (который индуцирует 5-10мл вдохновение жидкости легких) основан на размер легких и сколько долей в настоящее время культурный (долей могут быть связаны с для анализа, в то время как оставшихся долей продолжится в культуре). Количество воздуха отозвана шприцевой насос выбран для аппроксимации "дыхательный объем" из культурного легких.
2. Средний должен быть изменен примерно раз в 3-4 дней, в течение культуре.
3. Во время совместного культуры и эпителия и эндотелия, эксперименты в нашей лаборатории обычно впервые семян эпителия в течение 4-8 дней, в течение которых инженерии тканей проветривается. Эндотелия затем посеяны через перфузии, после чего ткань и перфузии и вентиляции.

7. Представитель Результаты:

Decellularization

Когда протокол выполняется правильно, только что извлеченные легкие должны держать воздух без утечки. Раздувание их с воздуха при погружении в жидкость может проверить это - там не должно быть пузырьков воздуха указывает утечек. Последующие decellularization должны позволить ~ 500 мл decellularization жидкости течь через легкие в течение 2,5 - 3 часов при 37 ° С, и PBS в конечном счете должны иметь возможность проходить через легкие на уровне около 10 мл / мин (под ~ 15 мм рт гидростатического давления) в конце промывки. После обработки 0,1% надуксусной кислоты и benzonase, легкие можно хранить при 4 ° С в течение 3 месяцев, и до сих пор остаются пригодные для recellularization.

Окончательный decellularized внеклеточного матрикса должна быть полностью лишена клеточных материалов, а также сохранить брутто, микроскопические и ультраструктурные характеристики родной легких. Недостаточное decellularization или промывка может привести к остатку ДНК "прилипания" к эшафоту, которые могут быть визуализированы с стандартным гематоксилином и эозином пятна (см. Рисунок 3 для сравнения).

Репопуляции бесклеточной матрицы и культуре легочной ткани

Если ячейки свежевыделенных от 7 дней старый новорожденных крысят, как описано в онлайн приложения, сопровождающие работу Петерсен и его коллеги ^4, можно ожидать, клетка выход 120-150 миллионов клеток в помете 10 щенков (чуть более 10 миллионов клеток на новорожденных).

Оптимальные условия для посева клеток и последующее культуры легкого в биореакторе должны дать хорошо распределенных клеток в течение всех 5 долях легких, и должны обеспечить охват около 70% от внеклеточного матрикса эшафоте (рис. 3). Культурный клеточной популяции будет положительным для ключевых дыхательных маркеры клеток, таких как про-секреторной белка-C (SPC), Клара клетка секреторного белка (CCSP) и аквапорин-5 (AQP), в порядке их относительной численности (рис. 4).

Рисунок 1. Канюли позиции и decellularization биореактор

Рисунок 2. Биореактора, используемой для заполнения и культуры инженерных легочной ткани

Рисунок 3. Гистология родной, decellularized и заселен легких

Рисунок 4. Иммунофлуоресценции окрашивания для ключевых маркеров легких

Обсуждение

Наиболее важных аспектов системы, представленные здесь включают поддержание стерильности, и тщательный мониторинг давления применяется для сосудистого русла на протяжении всего процесса подготовки и посева леса и культивирование легкого заселен. Стерильность наилучшим образом обеспечивается в автоклаве всех материалов перед использованием, а также за счет установки легких в замкнутой системе, вскоре после эксплантов и избежать последующего нарушения этого барьера. После матрицы decellularized тщательно промыть и переданы стерильный биореактор для культуры, крышка силикона и других уплотнений и соединения не должны быть нарушены или удалены. Чтобы держать давление под контролем, поток управляется тяжести предпочтительнее когда это возможно. Когда насос, необходимых для рециркуляции жидкости, начинающихся после промывки PBS и продолжая в течение культуру, мы рекомендуем прямого измерения давления перед жидкость поступает в легочную артерию с датчиком давления. Величина приложенного давления не должна превышать 15 мм рт.

Recellularized легких можно культивировать в течение различных периодов времени, обычно от 4 дней до 3 недель. Сосудистой перфузии обычно достигается на 1-3 мл / мин в течение эндотелиальных культуры, в то время как вентиляция, как правило, применяется в размере 1 вдох / мин в течение эпителиального культуры. Во время комбинированной периоды культуры, одновременное вентиляции и перфузии является целесообразным. Вентиляция может быть выполнена либо с жидкой среде или по воздуху.

В течение последних нескольких десятилетий, несколько групп осуществляют важную работу тканевой инженерии показывает возможности дифференциации эпителия легких в пробирке и тиражирования несколько аспектов легких микроанатомии ^{7,8,9, 10.} Однако до недавнего времени, ^4,5 ни одна из этих попытках инженер легочной ткани привела к имплантируемых орган, который смог сохранить разделение между кровью и дыхательных путей отсеков и которые могли бы участвовать в газообмене. Поэтому, хотя методы, описанные только первый шаг в направлении долгосрочной целью получения функциональной ткани легких, эта работа является обнадеживающим шагом к возможности увеличения количества легочной ткани для пересадки. Более того, эта работа развивает работу Отт и соавт. И Уйгун и коллеги ^11,12, демонстрируя эффективность decellularized внеклеточного матрикса, как строительные леса для тканевой инженерии сложных трехмерных структур и поддержки роста и выживания различных типов клеток . Эта работа также значимых для его вклад в арсенал дыхательных клеточной и молекулярной биологии. Предоставляя уникальные, трехмерные среды, которые могут создавать соответствующие условия для механических раздражителей, и что не разделяет сопутствующие опасности быстрого де-дифференциации, что можно столкнуться при культивировании грызунов эпителия в лаборатории с более традиционными методами ^13, ученые могут использовать нашей системе, чтобы получить новое понимание того, клетка-клетка и клетка-матрица взаимодействий, которые играют важную роль в дифференциации клеток и функции. Это знание может быть особенно сильной, если использовать в качестве рычага для руководства судьбе различных популяций стволовых клеток, как группа Cortiella это продемонстрировал в первых исследованиях ^14.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Эвтаназия
Гепарин	Sigma-Aldrich	H4784
Натрия нитропруссид	Fluka	71778
Euthasol эвтаназии решение	Virbac AH	710101	390 мг / мл пентобарбитал маточного раствора натрия следует разбавить соответствующим образом для IP администрации
Решение Decell
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
NaCl	Американская Биоаналитическая	AB01915
ЭДТА	Сигма	E5134
NaOH	JT Baker	3722-01
1X PBS	Гибко	14190
Биореактор Компоненты
480 мл банки	Коул Пармер	EW-3460560
Силиконовая пробка, размер 14	Коул Пармер	EW-06298-26
Y-коннекторы	Коул Пармер	ED-30614-08	Используется для артериальной и трахеи канюли
Силиконовые трубки	Masterflex	96420-14, 16	L / S 14, 16
Датчики давления	Эдвардс Lifesciences	PX-212
Обратный клапан	Коул Пармер	EW-98553-20	Обратный клапан
4-х кранов	Эдвардс Lifesciences	594WSC
Шприц фильтр	Коул Пармер	2915-08	PTFE, 0,2 мкм
Decell и промывки аппаратов (дополнение к биореактор)
500 и 1000 мл бутылки стеклянные	Гранулирование	1395-500;-1L	Используется для decell и полоскания под действием силы тяжести
Лечение Benzonase
Пенициллин / стрептомицин	Гибко	15140122
FBS	Hyclone	SH30071.03
Трис-HCl	Американская Биоаналитическая	AB14043	1М, рН 8,0
MgCl 2	JT Baker	2444-01
BSA	Сигма	A9647
Benzonase нуклеазы	Сигма	E1014	Эндонуклеаза используется для удаления остатков ДНК из матрицы