Procedimento para a Engenharia de pulmão

Resumo

Nós desenvolvemos uma matriz extracelular e de pulmão decelularizado biorreator romance biomimético que pode ser usado para gerar tecido pulmonar funcional. Por semeadura de células na matriz e cultura no biorreator, geramos tecido que demonstra a troca gasosa eficaz quando transplantadas in vivo por curtos períodos de tempo.

Resumo

Tecido pulmonar, incluindo câncer de pulmão e doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica, cumulativamente conta para alguns 280.000 mortes anualmente, doença pulmonar obstrutiva crônica é atualmente a quarta causa de morte nos Estados Unidos ^1. Contribuem para esta mortalidade é o fato de que os pulmões não costumam reparar ou regenerar além do nível, microscópicos celular. Portanto, o tecido do pulmão que está danificado pela degeneração ou infecção, ou tecido pulmonar, que é cirurgicamente ressecados não é funcionalmente substituído in vivo. Para explorar se o tecido pulmonar pode ser gerado in vitro, nós tratamos os pulmões de ratos adultos usando um procedimento que remove componentes celulares para produzir uma matriz extracelular do pulmão acelular andaime. Este andaime mantém as estruturas hierárquicas de ramificação das vias aéreas e vasos, bem como uma membrana basal intacta, que compreende colágeno IV, laminina, e fibronectina. O andaime é montado em um biorreator projetado para imitar os aspectos críticos do pulmão da fisiologia, como a ventilação de pressão negativa e perfusão vascular pulsátil. Por epitélio pulmonar e cultura endotélio vascular dentro do biorreator andaime montado, somos capazes de gerar tecido pulmonar que é fenotipicamente comparável ao tecido pulmonar nativa e que é capaz de participar em troca de gás para intervalos de tempo curtos (45-120 minutos). Estes resultados são encorajadores e sugerem que o repovoamento do pulmão matriz é uma estratégia viável para a regeneração de pulmão. Essa possibilidade apresenta uma oportunidade não só para trabalhar para aumentar a oferta de tecido pulmonar para transplante, mas também para o estudo de células respiratórias e biologia molecular in vitro por longos períodos de tempo e em um microambiente mais preciso do que foi previamente possível.

Protocolo

1. Biorreator Assembléia

Figura detalhada (s) do projeto de biorreatores e montagem tanto para decelularização e cultura são fornecidos nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Todos os componentes devem ser esterilizados antes da montagem do biorreator. Os seguintes pontos específicos são observados:

CONEXÕES:

1. A cânula arterial é composto por um encaixe luer-lock ligado a um Y-divisor por um pequeno segmento de tubulação. O conector luer-lock está ligado ao tubo de perfusão, eo segmento do Y que não é suturada com a artéria pulmonar é conectado a uma válvula unidirecional. A válvula unidirecional é orientada de modo fluido que pode ser retirado para a tubulação (na direção oposta, como perfusão), mas durante toda a perfusão dos órgãos médio flui para o pulmão.
2. A cânula traqueal também consiste de um conector luer-lock ligado a um Y-divisor com tubulação. O luer-lock se conecta a um circuito de respiração entre o reservatório de traquéia e da câmara principal. O segmento do conector Y que não é suturado à traquéia também é conectado a uma válvula unidirecional. A válvula unidirecional é orientada da mesma forma como a cânula arterial.

FUNÇÕES:

3. As válvulas de sentido único nas cânulas arterial e traqueais são utilizados para limpar as bolhas de ar na tubulação, permitindo a inversão do fluxo na tubulação e, portanto, permitir bolhas de ar a ser removido.
4. O "loop respiração" inclui duas válvulas de sentido único, posicionado como meio que segue um caminho diferente dentro e fora do pulmão. Uma descrição mais detalhada desta funcionalidade é fornecida em uma publicação prévia do nosso ² laboratório.
5. Perfusão vascular é fornecido utilizando uma bomba de rolete. Medium é perfundido na artéria pulmonar através da cânula em anexo, flui através da vasculatura pulmonar e as veias pulmonares diretamente no biorreator principal, onde meio é elaborado para perfusão.

2. Colheita de órgãos

1. Euthanize adultos (3-6 meses de idade) ratos Fischer 344 por overdose de sódio pentobarbital, de acordo com diretrizes estabelecidas pela American Veterinary Medical Association (60 IP mg / kg). Nota: a solução pentobarbital inclui heparina de 100 unidades / ml para a anticoagulação.
2. Spray ou limpar o peito e abdômen com álcool 70%.
3. Abrir a cavidade torácica, expondo o coração e os pulmões, tomando cuidado para não danificar os pulmões. Fazer com cuidado uma pequena janela através do diafragma na cavidade torácica, causando os pulmões para retrair e expanda esta incisão horizontal para expor as bases dos pulmões. Faça duas incisões verticalmente através das costelas, e retrair a caixa torácica para expor o coração e os pulmões.
4. Preparar um sistema de perfusão gravidade, ou seja, utilizando uma seringa com êmbolo removido, uma torneira de 3 vias, e ~ 20 centímetros de tubo com um 1.5inch, agulha 21 gauge. Manter a seringa em ~ 20 centímetros acima do animal usando um suporte de anel. Assegurar que todo o ar é retirado o tubo de perfusão.
5. Corte o átrio direito para drenar sangue, impedindo-a de volta para os pulmões. Corte o átrio esquerdo para permitir a drenagem fácil de sangue e perfusato dos pulmões também pode ser útil, mas não é necessário.
6. Inserir a agulha na base do ventrículo direito e abra a torneira para perfundir os pulmões com uma solução de heparina e nitroprussiato de sódio (50U/ml e 1ug/ml, respectivamente) em PBS. Confirmar que a artéria pulmonar se enche com líquido de perfusão, e que o sangue é clearing dos pulmões. Se necessário, encher a seringa com líquido de perfusão adicional. Normalmente apenas 10ml ~ é necessária.
7. Continue perfusão até que os pulmões são claras de sangue, então pare de perfusão.
8. Dissecar o livre traquéia, até no pescoço, tanto quanto possível. Garantir a traquéia é separado do esôfago. Dissecar todas as conexões restantes para o coração, pulmões e traquéia, e remover em bloco.
9. Usando uma tesoura bisturi ou afiada, corte o ápice do coração, expondo os ventrículos direito e esquerdo.
10. Canular o tronco pulmonar através do ventrículo direito, e sutura no local. Remova qualquer excesso de tecido ventricular esquerda.
11. Canular a traquéia e sutura no local. Certifique-se que ambas as cânulas traqueais e pulmonares arterial estão posicionados de tal forma que não há força de torção na traqueia, pulmões ou grandes vasos (Figura 1).
12. Garantir que não há bolhas de ar na cânula arterial, uma vez que as bolhas de ar presas no sistema pode impedir o fluxo constante de através do órgão. Em alguns casos, uma bolha de ar pode parar completamente flow.To fluido conseguir isso, coloque o bloco do coração / pulmão em um frasco contendo PBS. Use uma seringa com agulha para injetar uma pequena quantidade de PBS para a cânula de coração para expulsar as bolhas.
13. Lavagem das vias respiratórias com PBS 4-5 vezes, para remover o ar, tanto quanto possível do pulmão.
14. Após o passo lavagems são completos, inflar o pulmão com PBS contendo nitroprussiato de sódio (SNP) em 1ug/ml. Coloque uma rolha na cânula traqueal, para que a solução permanece no pulmão. Permitir que o pulmão para incubar por até 30 minutos, a mesma solução flui através da vasculatura através da artéria pulmonar, para permitir a vasodilatação.
15. Conectar coração / pulmões para uma tampa de biorreator utilizando as conexões luer-lock ligado ao cânulas em forma de Y, descrito em "Assembléia biorreator" acima. (Figura 1).

3. Decelularização órgão

1. Conecte a tampa (com pulmões ligados) aos aparelhos decelularização (Figura 1). A cânula da artéria pulmonar deve ligar para a linha de perfusão, ea cânula traqueal deve free float. Assegurar que todas as linhas são claras de ar. Como descrito acima, de ar nas linhas podem ser uma fonte de decelularização pobres, impedindo o fluxo de fluido decllularization. Ar preso no sistema pode também persistem no tempo da cultura, quando pode ter um impacto negativo sobre a sobrevivência da célula ^3.
2. Inflar o pulmão com PBS / SNP até os pulmões estão cheios, mas não exageradas. Imediatamente tampa da cânula traqueal, para que o pulmão permanece inflado.
3. Perfundir pulmão com PBS / SNP por pelo menos 15 min a ~ 15 mmHg (20cm H ₂ O de pressão). Depois de 15min ou mais, retire a tampa da cânula traqueal para permitir que o pulmão esvaziar.
4. Continue a perfusão com PBS / SNP por 30min. Se necessário, recarga PBS / SNP para garantir a pressão de perfusão é mantida em 10-15 mmHg.
5. Começar a perfusão com solução decelularização (CHAPS 8mm, 1M NaCl, 25mM EDTA em 1X PBS). Tome cuidado para garantir que todas as linhas são claras de ar. Um sistema de vácuo pode ser útil para fornecer sucção.

Perfundir com solução decelularização até 500ml de solução tem perfundidos através do pulmão. Pressão ideal é <15 mmHg (~ 20 cm H ₂ O). Isso normalmente requer 2,5 horas. Taxas de fluxo são normalmente muito lento (0.2-0.5ml/minute) inicialmente, e aumentar rapidamente durante a segunda hora para cerca de 1ml/minute ou superior. Periodicamente, remover o líquido decelularização usado de biorreator, garantindo bastante líquido continua a apoiar o pulmão e cânula traqueal.

4. Órgão de lavagem e esterilização

1. Transferência de pulmão e biorreator para uma capa de cultura de tecidos. Começar a lavagem com PBS estéril, removendo o frasco de 500ml que continha o líquido decelularização e substituir por um frasco estéril contendo até 1L de PBS estéril. Use sucção a vácuo para garantir linhas são claras de ar.
2. Perfundir PBS através da vasculatura de 15/10 mmHg, da mesma maneira como para decelularização. Periodicamente, remova os resíduos de PBS biorreator e substituir e / ou encher o frasco com PBS fresco, PBS estéril. É aconselhável o uso de técnica estéril.
3. Continuar a enxaguar até pelo menos 2,5 L de PBS estéril têm perfundidos no pulmão.
4. Transferência de pulmão para um novo sistema de biorreator, estéril, contendo PBS fresco. Assegurar que tanto o ciclo inteiro de perfusão e as linhas das vias aéreas todo são preenchidos com fluido. Todas as etapas subseqüentes será usar uma bomba pulsátil para perfundir pulmões na 5ml/min.
5. Esterilizar o cadafalso, quer através de perfusão durante a noite com PBS + 10% FBS + 10% de solução caneta strep ou por 3 horas com 0,1% de ácido peracético em PBS. Este último vai exigir a lavagem do pulmão com 3 mudanças de 250ml PBS durante várias horas para remover o ácido residual. Para cada lavagem, o pulmão deve ser ventilado, bem como perfundidos para garantir que todas as partes do tecido fiquem completamente lavados.
6. Transferência do pulmão para a 37 ° C incubadora e perfundir com PBS que tem 10% de SFB e 10% de penicilina / estreptomicina por ~ 1h ou até que a temperatura é equilibrado, em preparação para o tratamento benzonase.
7. Tratar de pulmão com benzonase para remover DNA remanescente:
   1. Aquecer o tampão benzonase (ver Tabela de Reagentes) a 37 ° C.
   2. Para cada pulmão, encha uma seringa de 10 ml com tampão benzonase apenas e uma seringa de 10 ml com benzonase 90U/ml no buffer.
   3. Parar perfusão do pulmão.
   4. Inflar as vias aéreas com tampão benzonase.
   5. Permitir que o pulmão esvaziar (por ~ 1 minuto). Então, encha o pulmão com a solução benzonase. Durante a inflação com tampão benzonase & benzonase, para tentar evitar qualquer injeção de ar no pulmão.
   6. Permitir que o pulmão se sentar sem perfusão ou ventilação a 37 ° C durante 1 hora após inflável com benzonase.
8. Retomar a perfusão com o PBS + 10% FBS, 10% de penicilina / estreptomicina que já está no biorreator, e continuam durante a noite. No dia seguinte, o pulmão pode ser armazenado a 4 ° C (por até 3 meses) ou preparados para a semeadura de células.
9. Para preparar o andaime para repovoamento celular, substituir o PBS / SBF / benzonase solução com ~ 250ml de meio de cultura. Perfundir por pelo menos uma hora antes de as células são introduzidas, umand substituir com meio de cultura fresco directamente antes de as células semeadura.

5. Recellularization

A escolha da fonte de células para reseeding órgão é deixada para os investigadores individuais. Muitas fontes de células podem ser utilizadas, incluindo as populações disponíveis comercialmente, recém-isoladas neonatal ou fetal células pulmonares, células-tronco embrionárias, ou fontes de células disponíveis comercialmente. Protocolos de isolamento específico para estas populações de células pode ser encontrada em outros lugares ^4,5,6. Aqui, nós fornecemos instruções sobre como semente de ambas as populações de células endoteliais e epiteliais.

Semeadura endotelial:

1. Prepare uma suspensão de população de células endoteliais desejado, em meio de cultura apropriado. Suspensão de células do filtro através de um filtro para remover células 40um aglomerados de células. A semeadura típico endotelial em nosso laboratório poderia utilizar cerca de 30 milhões de pulmão de ratos células endoteliais microvasculares em 60ml de meio de cultura.
2. Dispense suspensão de células em um pequeno reservatório temporariamente incorporadas ao circuito de perfusão do biorreator (Figura 2). Garantir que a tubulação a partir deste reservatório e do laço de perfusão inteiro é claro de bolhas de ar.
3. Infundir células na artéria pulmonar em 3ml/min usando uma bomba de rolete.
4. Após a infusão de células, continue perfusão com meio recirculado do biorreator principal na taxa desejada.
5. Em uma base diária, garantir que o tubo de perfusão é claro de bolhas de ar.
6. Médio deve ser substituído por meio fresco regularmente, o que muitas vezes é feito a cada 3-4 dias.

Semeadura epiteliais:

1. Prepare uma suspensão de células da população de células epiteliais desejado. Em nosso laboratório, isso normalmente é composto por cerca de 5-10 células de rato neonatal pulmonar. Filtrar a população através de peneira de células 40um e suspender em 15ml de meio de cultura em uma seringa. Encher o reservatório das vias aéreas com 80ml de meio de cultura.
2. Coloque o biorreator de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora, e ligar a bomba de seringa para ventilação. Assegurar que todas as linhas de ventilação são claras de ar.
   1. Semente das células para o pulmão através da injeção de 15ml de suspensão celular como um bolus único na cânula traqueal.
   2. Começar imediatamente uma respiração única e lenta usando a bomba de seringa. Esta respiração é administrado pela retirada de 60ml de ar do biorreator principal no 3ml/minute, portanto, com duração de aproximadamente 20 minutos. Garantir os filtros de ar no biorreator principais são tampados imediatamente após a injeção da suspensão celular e antes de começar a respiração lenta.
3. Permitir que os pulmões para sentar-se estaticamente por cerca de 18hrs, e então começar a perfusão vascular lento (aproximadamente 0,5 ml / min).

6. Cultura de órgãos

Embora os detalhes da perfusão e ventilação varia de acordo com desenho experimental, os seguintes pontos são observados:

1. Durante a cultura endotelial, a perfusão é tipicamente realizada em 1-3 ml / min usando uma bomba de rolete. Durante a cultura epitelial, a ventilação é geralmente fornecida a uma taxa contínua de uma respiração por minuto usando uma bomba de seringa. Retirada de 5 10ml de ar do biorreator principal é normalmente necessário para efetuar a ventilação pulmonar em um volume normal de maré. Devido à necessidade de manter o hermético biorreator durante a ventilação, a ventilação deve ser pausada diária e do ar na câmara principal deve ser trocada. Todo o ar no sistema é ar ambiente, que é aproximadamente 21% de oxigênio por pressão parcial. A retirada 5 10ml de ar do biorreator (que induz uma inspiração 5-10ml de fluido pelo pulmão) é baseado no tamanho do pulmão e quantos lobos estão sendo cultivados (lobos pode ser amarrado para análise, enquanto o lobos restantes continuam na cultura). A quantidade de ar retirado pela bomba de seringa é escolhido para aproximar o "volume corrente" do pulmão cultivadas.
2. Médio deve ser alterado aproximadamente a cada 3-4 dias durante a cultura.
3. Durante a co-cultura do epitélio e endotélio, as experiências em nossa semente de laboratório primeiro tipicamente o epitélio por 4-8 dias, durante os quais o da engenharia de tecidos é ventilado. O endotélio é então semeado através de perfusão, após o qual o tecido é tanto perfundidos e ventilado.

7. Resultados representativos:

Decelularização

Quando o protocolo é realizado corretamente, os pulmões recém-extraídos deve segurar o ar, sem vazamento. Inflando-os com ar ao mesmo tempo submerso em líquido pode verificar isso - não deve haver quaisquer bolhas, indicando vazamento de ar. A decelularização subseqüentes devem permitir ~ 500ml de líquido decelularização a fluir através dos pulmões ao longo de 2,5 - 3 horas a 37 ° C, e PBS deve finalmente ser capaz de fluir através dos pulmões em cerca de 10 ml / min (em ~ 15 mm Hg de pressão hidrostática) no final da lavagem. Após o tratamento com 0,1% de ácido peracético e benzonase, os pulmões podem ser armazenados a 4 ° C por até 3 meses, e ainda permanecem adequados para recellularization.

A matriz extracelular decelularizado finais devem ser completamente desprovido de materiais celulares, e manter as características brutas, microscópicos e ultra-estruturais de pulmão nativo. Decelularização insuficiente ou de lavagem podem resultar em remanescente DNA "degola" para o cadafalso, que podem ser visualizados com um padrão hematoxilina e eosina (veja a Figura 3 para comparação).

Repovoamento da matriz acelular e cultura de tecido pulmonar

Se as células são recém isoladas de sete dias de idade os filhotes de rato neonatal, conforme descrito no suplemento on-line que acompanha o trabalho de Petersen e colaboradores ^4, pode-se esperar um rendimento de células de 120-150 milhões de células por ninhada de 10 filhotes (pouco mais de 10 milhões células por recém-nascido).

Condições ideais para a semeadura de células e cultura subseqüente do pulmão no biorreator deve render bem distribuídos em todas as células cinco lobos do pulmão, e deve fornecer uma cobertura de aproximadamente 70% da matriz extracelular andaime (Figura 3). A população de células cultivadas será positivo para os principais marcadores de células respiratórias, como a secretora pró-proteína C (SPC), proteína secretora Clara celular (CCSP), e aquaporina-5 (AQP), em ordem de abundância relativa (Figura 4).

Figura 1. Posições Cânulas e biorreator decelularização

Figura 2. Biorreator utilizado para plantio e cultura de tecido pulmonar de engenharia

Figura 3. Histologia de natal, decelularizado e repovoada pulmão

Figura 4. Coloração de imunofluorescência para os marcadores de pulmão chave

Discussão

Os aspectos mais críticos do sistema aqui apresentado incluem a manutenção da esterilidade, e acompanhar de perto as pressões aplicadas ao leito vascular em todo o processo de preparação e semeando o andaime e cultura do pulmão repovoada. Esterilidade é melhor mantida em autoclave todo o material antes do uso, e pela montagem do pulmão em um sistema fechado logo após explante e evitar violação posterior desta barreira. Após a matriz decelularizado foi cuidadosamente lavado e transferido para um biorreator estéril para a cultura, a tampa de silicone e outras vedações e conexões não deve ser perturbado ou removidos. Para manter sob controle as pressões, o fluxo impulsionado pela força da gravidade é preferível sempre que possível. Quando uma bomba é necessária para a recirculação do líquido, com início após lavagem com PBS e continuando durante a cultura, recomendamos medir diretamente a pressão um pouco antes o fluido entra na artéria pulmonar, com um transdutor de pressão. A magnitude da pressão aplicada não deve exceder 15 mm Hg.

Recellularized pulmões podem ser cultivadas por períodos variáveis ​​de tempo, normalmente variando de 4 dias para até 3 semanas. Perfusão vascular é normalmente realizado em 1-3 ml / min durante a cultura endotelial, enquanto a ventilação é normalmente aplicado a uma taxa de 1 respiração / min durante a cultura epitelial. Durante os períodos da cultura combinado, ventilação e perfusão simultânea é apropriado. Ventilação pode ser feita com qualquer meio líquido ou ar.

Ao longo da últimas décadas, diversos grupos têm feito um trabalho de engenharia de tecidos importantes mostrando a viabilidade de diferenciação epitélio pulmonar in vitro e de reproduzir vários aspectos do pulmão microanatomia ^{7,8,9, 10.} No entanto, até recentemente, nenhum ^4,5 dessas tentativas de engenheiro de tecido pulmonar resultou em um órgão implantáveis ​​que foi capaz de manter a separação entre o sangue e os compartimentos das vias aéreas e que poderiam participar em troca de gás. Portanto, embora os métodos descritos são apenas um primeiro passo em direção à meta de longo prazo de geração de tecido pulmonar funcional, este trabalho é um passo encorajador para a possibilidade de aumentar a quantidade de tecido pulmonar disponíveis para transplante. Além disso, este trabalho elabora trabalho realizado por Ott et al. Uygun e ^11,12 e colegas, demonstrando a eficácia de uma matriz extracelular decelularizado como um andaime para engenharia de tecidos tridimensionais complexas estruturas e apoiar o crescimento ea sobrevivência de vários tipos de células . Este trabalho também é significativo por sua contribuição ao arsenal de células respiratórias e biólogos moleculares. Ao fornecer um único, ambiente tridimensional que pode também dar o devido estímulo mecânico, e que não compartilha o perigo de atendimento rápido de diferenciação que se pode encontrar ao epitélio cultura de roedores em laboratório com métodos mais tradicionais ^13, os cientistas poderiam usar nosso sistema de ganhar uma nova visão sobre célula-célula e célula-matriz interações que desempenham um papel na diferenciação celular e função. Este conhecimento pode ser particularmente poderosa, se usado como alavanca para orientar o destino de populações de células-tronco diferentes, como grupo Cortiella tem demonstrado em estudos iniciais ^14.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Eutanásia
Heparina	Sigma-Aldrich	H4784
Nitroprussiato de sódio	Fluka	71778
Euthasol solução eutanásia	Virbac AH	710101	390 mg / ml solução estoque pentobarbital sódica devem ser diluídos de forma adequada para a administração IP
Decell Solution
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
NaCl	Americana Bioanalytical	AB01915
EDTA	Sigma	E5134
NaOH	JT Baker	3722-01
1X PBS	Gibco	14190
Componentes biorreator
480 ml jar	Cole Parmer	EW-3460560
Rolha de silicone, tamanho 14	Cole Parmer	EW-06298-26
Y-conectores	Cole Parmer	ED-30614-08	Usado para cânulas arterial e traqueal
Tubo de silicone	Masterflex	96420-14, 16	L / S 14, 16
Transdutores de pressão	Edwards Lifesciences	PX-212
Válvula de retenção	Cole Parmer	EW-98553-20	Válvula unidirecional
4-way torneiras	Edwards Lifesciences	594WSC
Seringa de filtro	Cole Parmer	2915-08	PTFE, 0,2 Hm
Decell e apparati lavagem (adições ao biorreator)
500 e 1000 ml de vidro de garrafas	Corning	1395-500;-1L	Usado para decell e lavagem pela gravidade
Tratamento Benzonase
Penicilina / estreptomicina	Gibco	15140122
FBS	Hyclone	SH30071.03
Tris-HCl	Americana Bioanalytical	AB14043	1M, pH 8,0
MgCl 2	JT Baker	2444-01
BSA	Sigma	A9647
Benzonase Nuclease	Sigma	E1014	Endonuclease usado para remover restos de DNA a partir da matriz