В естественных условиях лазерной Axotomy на языке C. Элеганс

Резюме

Протокол сократить нейронов в С. Элеганс С лазерным импульсным Micropoint представлена. Мы описываем создание системы иммобилизации червей и разрыва меченых нейронов. Среди преимуществ относительно недорогие системы и возможность разорвать нейронных процессов или удалять клетки В естественных условиях.

Аннотация

Нейроны общаются с другими клетками с помощью аксонов и дендритов, тонкая мембрана расширений, содержащих пре-и пост-синаптические специализации. Если нейрон поврежден-за травмы или болезни, он может регенерировать. Cell-внутренние и внешние факторы влияют на способность нейронов к регенерации и восстановления функции. В последнее время нематоды C. Элеганс стала отличная модель организма для выявления генов и сигнальных путей, которые влияют на регенерацию нейронов ^1-6. Основным способом инициировать регенерацию нейронов в C. Элеганс является лазерная резка-опосредованной или axotomy. Во время axotomy, флуоресцентно меченных нейронов процесс разорвал использованием высоких энергий импульсов. Первоначально нейронные регенерации в C. Элеганс были изучены с помощью усиления фемтосекундных лазерных ^5. Однако последующие исследования регенерации показали, что обычный импульсный лазер может быть использован для точного разорвать нейронов в естественных условиях и вызывать аналогичные регенеративный ответ ^1,3,7.

Мы представляем протокол для выполнения в естественных условиях лазерной axotomy в использовании червя Micropoint импульсного лазера, под ключ системы, которые легко доступны и широко используется для целевых абляция клетки. Мы описываем выравнивания лазера, монтаж червей, резка специфических нейронов, а также оценка последующей регенерации. Система предоставляет возможность сократить большое количество нейронов в нескольких червей в течение одного эксперимента. Таким образом, лазерная axotomy как описывалось выше, эффективной системой для инициирования и анализа процесса регенерации.

протокол

1. Сборка системы

Конкретных компонентов нашей системы, изложены ниже. При правильно собранный, пользователь должен иметь возможность сосредоточиться микроскоп с одной стороны, двигаться на одной сцене с другими (либо с помощью мыши или джойстика), включите лазер с ножной педалью, и имеют четкое представление о на- изображения на экране.

1. Micropoint лазер установлен на эпи-флуоресценции порт соединения микроскопа. Мы используем Nikon 80i, но каких-либо исследований класса вертикальном или перевернутом сфера должна работать. Система Micropoint будет включать в себя пользовательские дихроичных, который должен соответствовать флуорофора, что метки клетки вы хотите вырезать. Резка клетки помечены альтернативных флуорофоров требует дополнительных dichroics. Кроме того, генератор импульсов и ножной педали поставляются с системой Micropoint.
2. 100x, 1,4 Н. А. нефти цель для выполнения операций и оценки регенерации, а также дополнительные задачи, необходимые для размещения образца на слайд. Мы используем план Nikon Apo VC для хирургии, и обнаружили, что 4x полезно для грубой фокусировки и нахождение образца.
3. Моторизованный сцене с помощью джойстика. Сцену с чрезвычайно высокой точности и повторяемости не потребуется, так этапе используется только для ориентации. Мы используем До OptiScan II (см. обсуждение).
4. Камера. Камера должна обеспечивать достаточную частоту кадров, чтобы сосредоточиться и целевой меченых аксонов с 100x цель, в то время визуализации изображения на мониторе компьютера. Мы предпочитаем ослабления освещения свет в течение axotomy процедуры, чтобы избежать возможных вмешивающихся эффектов от фото-отбеливание или повреждение (см. п. 1.7, ниже). Таким образом, камера должна быть достаточно чувствительным, чтобы приспособить этот сниженный уровень света. Мы используем Хамамацу Orca 05G, и обнаружили, что изображения на 16,3 Гц достаточно. Эквивалентный камер может быть заменен.
5. Компьютер, монитор и обработки изображений, которые могут управлять камерой. Кроме того, мы используем для обработки изображений для управления моторизованным сцене с мышью (см. обсуждение).
6. Воздух таблице. Это требование может изменяться в зависимости от местоположения, но так как операция проводится с целью 100x, мы находим виброизоляции необходимым.
7. Свет питания с световод и механизм затвора для освещения флуорофора. Световод будет приложить к Micropoint. Механизм затвора, полезно уменьшить интенсивность освещения независимо от лазера. Мы используем До Lumen 200 или Leica EL6000, и затухают до 80% от полной интенсивности света для axotomy.

2. Лазерная установка

Подробный протокол на начальном этапе согласования и фокусировки лазерного снабжен лазерной системы Micropoint. Будем считать, что процедура была успешно следуют при первоначальной настройке. Это включает в себя выравнивание лазера с перекрестием в окуляр. Здесь мы предлагаем протокол для регулярного технического обслуживания в фокусе лазера и интенсивности.

Как отмечается в руководстве Micropoint, импульсный азотный лазер способный серьезный ущерб человеческому глазу. Следует проявлять осторожность, чтобы никогда не смотреть прямо на лазерный луч. После установки, барьер фильтр должен безопасно блок излучения через окуляры.

Резка нейроны в организме размером с песчинку может оказаться непростой задачей. Поскольку площадь урон, наносимый лазерным очень мало, важно знать, трехмерное расположение в фокусе лазера с целью выявить и образец точно. Лазерной внимание найти с помощью слайд зеркальные. Во-первых, мы проверяем, что место г лазерного фокуса матчей фокус изображения путем. Далее, расположение ху ущерба внимание отмеченные в перекрестье обработки изображений.

Фокусировка в г-плоскости

1. Нажмите на фильтр нейтральной плотности ND16 (рис. 1а). Мы используем фильтры нейтральной плотности в эпи-освещения пути для ослабления лазерного время фокусировки. Для еще более тонкую фокусировку, толчок в обоих ND16 и ND4 флуоресцентных фильтров.
2. Установить Micropoint лазерного импульса с 1 переключатель обратился к "Выбрать" (рис. 1б), а затем переместите фильтр колесо, чтобы соответствующие долгосрочные пройти барьер фильтра (рис. 1в).
3. Место слайд продублированы на этапе и сосредоточить внимание на отверстия в нем с 4-кратным цель использования проходящем свете.
4. Добавить каплю иммерсионного масла на слайд зеркальные и переориентировать на прокол с 100X цели. Откройте затвор камеры с оптического пути переключения рычага (рис. 1, г), а затвор лазер (рис. 1д). При необходимости уменьшить интенсивность проходящего света так краев отверстий четкие: это поможет при фокусировке точно.
5. Пресс ножной педали. Это должно производить небольшое отверстие в зеркало, если лазер фокусируется.
6. Фокус микроскопом чуть выше плоскости слайд зеркальных и стрелять лазерным снова. Это должно сделать еще меньшедыре, чем первый выстрел, или не оставляют след на всех. Повторите, сосредоточив внимание ниже слайд зеркально.
7. Если отверстие не производится в 2.5, или если большое отверстие производится при фокусировке выше или ниже поверхности зеркала, переориентировать лазер с кольца фокусировки на абляции голову. Убедитесь, что отверстие до сих пор должным образом увязаны с перекрестием в окуляр. При постоянном использовании, г-плоскости фокуса редко нуждается в корректировке.

Сосредоточение в плоскости ху

8. Выполните шаги 2,1 через 2,3 выше и нажмите педаль, чтобы сделать небольшое отверстие в зеркале слайда.
9. Инициировать "Live" режим съемки из "приобретает" Элементы меню. В "мера" панели инструментов выберите "ROI редактора, затем выберите инструмент« двойной крест »и перетащите перекрестье чтобы увязать их с центром новое отверстие. Нажмите кнопку "Сохранить рентабельность", затем "Выход редактора и возобновить Живая режим съемки.
10. Активировать настройки "мышь XY 'в элементах манипулировать этапе с помощью мыши.
11. Вытяните фильтр нейтральной плотности (ы) обратно в исходное положение (ы), набор лазерных импульсов до 10, и удалить слайд зеркально.

Регулировка мощности лазера

12. Мощность лазера должна быть скорректирована на минимальной мощности, необходимой, чтобы сократить нейрона на ваш выбор. Отрегулируйте мощность, перемещая пластину аттенюатора (рис. 1е) при одновременном сокращении жизни червей (см. ниже). Если мощность лазера слишком высока, то это вызовет периферического повреждения или взрыва отверстие в червя. Если мощность лазера слишком низкий, это не будет разрывать нейрона. После того как система была создана, положение аттенюатора редко нуждается в изменении. Если лазер становится слабым, и пластина аттенюатор должен быть перемещен продолжать резки, это может быть признаком того, что краситель краситель клетка должна быть заменена (см. обсуждение).

3. Остановите червей

1. Приготовить раствор из 3% расплавленной агарозы в M9 (22 мм КН2РО4, 42мм Na2HPO4, 85 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4). Внесите 5 мл расплавленной агарозы в 15 мл трубки сокола. Заполните другая труба с водой. Место труб в модульной нагревательный элемент установлен в 55 ° C. Заполните нагревательный элемент с водой для создания мини-ванны воды для каждой трубки. Примечание: агарозном могут быть подготовлены в большом количестве заранее и повторно расплавленного для последующих экспериментов.
2. Поместите два слоя маркировки ленты на каждом из двух слайдов и чистый слайд между этими слайдами. Внесите капли агарозы использованием пластиковой пипетки лампы до середины чистой слайдов и место другой слайд перпендикулярно к первой, так что в результате агарозном подушка толщиной два куска ленты (рис. 2). Удалите одну из двух слайдов с площадки через 30 секунд. Промыть и хранить пластиковые пипетки в заполненном водой сокола трубки для использования с последующим слайдов.
3. Далее, поместите 3-5 мкл 0,10 мкм или 0,05 мкм бисера полистирола в центре площадки. Добавить 5-10 червей выражения флуоресцентного белка в нейронах интерес. Если нейронов, представляющих интерес, асимметрично распределенные на правую или левую сторону червя, использование платины выбрать, чтобы перевернуть червей, так что правильный лицевой стороной вверх. Черви должны быть помещены на слайдах в течение 10 минут подготовки агарозном колодки.
4. Осторожно установите крышку поскользнуться на червей. После размещения покровным стеклом, не двигайте его относительно агарозном площадку так как это нарушит кутикулы и уничтожать червей. Место подготовлено слайд на предметный столик микроскопа.

4. Вырезать нейронов

1. Прямой свет в окуляр с оптическим рычагом переключения пути. Сосредоточьтесь на червя быть сокращены с 4-кратным цели, месту каплю масла на крышке скольжения, и переключиться на 100X цели. Вернуться оптический путь к камере.
2. Используйте мышь для перемещения нейронов на ваш выбор в центре перекрестия. Пресс педаль стрелять лазером и разорвать нейронов процесса. При необходимости, два набора импульсов может быть использован для разорвать нейрона. Сначала, полезно отслеживать, какие именно нейроны были разорваны в отдельных червей для оценки последующей регенерации. При правильном выполнении лазерной axotomy производит небольшой перерыв в нейрон, не причинив существенного вреда окружающим тканям кожи или других нейронов (см. рисунок 3). В некоторых случаях небольшой шрам может формироваться вокруг места повреждения.
3. Восстановление червей, удаляя покрытие скольжения в прямое движение вверх, стараясь, что черви остаются на площадке агарозы. НЕ слайд покровное прочь. Затем вырезать площадку вокруг черви с иглы нос щипцами и место раздела агарозы на недавно посеяны NGM пластины, содержащей OP50 ^8. Место 10 мкл стерильной M9 на площадку, чтобы освободить червей из бисера и удаления агарозы.

5. Оценка для регенерации нейронов

1. Подготовка площадки агарозы как указано в пункте 2.2.
2. Место червей в 3-5 иму, L полистирола бисером. Применить покровное. Слайды могут быть подготовлены последовательно, или же все черви могут быть подготовлены заранее и слайды хранятся в 10 см культуры блюд, каждое из которых содержит влажной Kimwipe держать влажной агарозы.
3. Используйте 100X цель визуализировать разорвала нейронов. Во многих нейронов, нейронных пень дистальнее места среза останется. Мы используем наличие этого остатка, как признак того, что нейрон действительно разорваны (рис. 4). Наличие этого пень позволяет отличить нейрона, разрезанные и регенерируется от одной, которая была не вырезано. Обратите внимание: и дистальных и проксимальных пни изначально отказаться после того, как разрез.
4. Оценка регенерации. Различных параметров может быть определена. Один простой анализ, является ли пострадавший нейрон сформировал роста конуса (рис. 4а) и повторно, или нет (рис. 4б). Кроме того, длина аксонов можно проследить и сравнить.

6. Представитель результаты

В качестве примера, мы опишем характеристики регенерации γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) моторных нейронов. Эти нейроны, которые находятся в брюшной нервной и расширить процессы окружности к грудной отдел спинного мозга нервы, имеют важное значение для правильного передвижения ^9. ГАМК-нейроны могут быть визуализированы, выразив генетически закодированы флуорофора, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), под контролем UNC -47 или -25 UNC промоутеров (штаммы EG1285 и CZ1200, соответственно, можно получить генетический центр Элеганс C. ).

Горы L4 стадии червей, как описано, флип-червей так ГАМК нейроны на своей правой стороны вверх, и место покровное стекло. Вырезать 1-3 из задней спайки в каждом червя, на полпути между спинной и брюшной шнуры. Избегайте резки спайки, которые пересекают или расположенный пучком с другими спайки, так как их трудно забить позже. Восстановление червей, как описано.

От 18 до 24 часов после успешной axotomy, черви оправились от операции и проявляют нормальной двигательной и кладка яиц поведения. Отменить червей, которых мертвыми или больными. Установите на остальные, как описано, и оценить регенерации. Мы обычно целью оценить не менее 30 вырезать нейронов в экспериментальных условиях. В oxIs12 животных, как правило, 60-70% из отрубленных L4 ГАМК нейронов будет инициировали структуры роста конуса, о чем свидетельствует расширение мембраны на кончике и расширение ряда отраслей аксонов, а мигрировали из места среза (рис. 4а). Во многих случаях рост конусы мигрировали воссоединиться с грудной отдел спинного мозга нервы, соседних нейронов спайки, или дистальной культи. Остальные 30% нейронов придется либо инициировал никакого роста, формирования культи проксимального на сайт axotomy, или будут иметь расширенные лишь небольшие филоподий (рис. 4б).

Рисунок 1. УФ импульсного лазера axotomy системы. Конкретные компоненты: (а) ND фильтры (б) импульса селектор (в) фильтр рычаг колеса (г) оптического пути переключения рычаг (е) лазерного затвора и (е) аттенюатор пластины.

Рисунок 2. Подготовка площадки агарозы. Чтобы подготовить площадку агарозы из нужной толщины, два слоя ленты (зеленый) размещаются на двух слайдах. Слайд находится между первыми двумя, и капли агарозы затем добавляется к чистой слайда. Наконец, четвертый слайд помещается перпендикулярно к первым трем, что приводит к площадке, которая толщиной два куска ленты.

Рисунок 3. Представитель ГАМК нейронов axotomies. В типичном эксперименте, ГАМК нейронов спайки порваны в середине наружной стороны червя. Разорвала спайки показан непосредственно перед (слева) и после (справа) axotomy. Все снимки были сделаны с целью 100X нефти.

Рисунок 4. Представитель результаты ГАМК axotomies нейрона. 24 часа после axotomy разорвала аксоны забил для регенерации. Аксон регенерирующий с ростом конуса (стрелка) показана на (), тогда как не-регенерирующий аксон рассматривается как проксимальная культя (стрелка) в (б). Дистальной культи каждого разреза аксон показан на каждой панели (стрелки) и является признаком того, что аксон был разорван.

Обсуждение

Различные лазерные системы были использованы, чтобы сократить нейритов в C. Элеганс, и несколько исследований изучили их работы подробно ^3,7,10,11. Лазерной Micropoint используется в нашей протокол под ключ системы, которая проста в установке и обслуживании, и доступен по низкой цене для исследователей, по сравнению с Ti-Sapphire лазерной системы. По сравнению с Ti-сапфир система, однако, лазерная Micropoint, как ожидается, привести к повреждению большей площади, которые могут быть невыгодными для некоторых приложений. Если Ti-сапфир системы желательно, отличный протокол о создании такой системы доступна ^12.

Текущего протокола могут быть выполнены на различных нейронах C. Элеганс, однако, отметим, что различия в регенеративной способности между различными типами нейронов, как ожидается ^13. Кроме того, различные фоны трансгенных может повлиять регенеративной успеха. Хотя процент регенерации нейронов ГАМК достаточно последовательно между различными трансгенных линий маркера, мы уже отмечали общее небольшое увеличение регенерации в juIs76 ¹⁴ против ¹⁵ oxIs12 червей. Различия между маркерами сенсорным нейронам также были описаны ^2.

Мы предпочитаем, чтобы обездвижить черви с микрошарики, а не в качестве анестетиков бисером приведет к более быстрому и более последовательной иммобилизации ^16. Это также выгодно, как мы можем наблюдать регенерации без каких-либо возможных смешанных эффектов, связанных с наркозом ^17. Альтернативные анестезии без метод иммобилизации является использование микрожидкостных устройств. Использование микрофлюидики для axotomy была подробно описана ^17-22.

Мы считаем, что с последовательным использования, лазерный функции лучше всего, когда Кумарин 440 в красителем ячейки меняется один раз в неделю после процедуры, описанной в руководстве Micropoint. При необходимости ослабления слайдер может использоваться для увеличения мощности, но это может быть признаком старого красителя или лазерной смещение. Кроме того, краситель клетка имеет ограниченный срок службы, и в конечном итоге должны быть восстановлены или заменены (см. Поиск и устранение неисправностей).

Это может быть трудно маневрировать целевой аксонов под перекрестье, которые отмечают лазерным фокусом, особенно если животное не полностью парализована. Мы считаем, что руководство этапе не является оптимальным для этой цели, хотя это, безусловно, полезная. Джойстика контролируемой моторизованных этапе является более точным, и мы находим, что при использовании программного обеспечения, поддерживающего изображение перетаскиванием с помощью мыши, чтобы переместить моторизованных этапе, тем лучше. Nikon элементов обеспечивает эту возможность и описывается в данном протоколе, но бесплатный пакет микроменеджер, а также другого программного обеспечения обработки изображений, могут иметь схожую функциональность. Другой способ тонкой таргетинг для перемещения лазерного фокуса, а не животное. Гальванометра пучка рулевой механизм доступен как дополнение к Micropoint лазера, если такой подход является предпочтительным.

Кроме того его применение к изучению нейронных регенерации, лазер может быть использован для удалять другие типы клеток, такие как кожа, мышцы, или специализированные клетки, или нарушить конкретных нейронных синапсов ^23-27. Более того, пути, которые регулируют дегенерацию нейронов, которая сопровождает травмы или болезни может быть исследован с этой системой. Таким образом, использование импульсных лазеров будет продолжаться, чтобы пролить свет на генетические факторы и клеточные биологические изменения, которые способствуют регенерации нейронов и других соответствующих процессов.

Устранение неполадок:

Описанные здесь некоторые общие проблемы и связанные с ними решения.

1. Лазерная резка не должным образом. Это, вероятно, потому что либо лазер не в фокусе (см. раздел 2), или красителя в краситель клетка должна быть заменена (см. Micropoint руководства). Кроме того, краситель ячейки, возможно, должны быть заменены или восстановлены.
2. Черви переходят на агарозном площадку. Как правило, это признак того, что площадка агарозном слишком влажная. Мы считаем, что колодки необходимо будет оставить в течение приблизительно 30 секунд до червей помещают на них, чтобы обойти эту проблему. Вы можете также попробовать использовать меньшего размера (0,05 мкм) микрошарики.
3. Восстановление червей трудно и неэффективно. Это может быть вызвано неправильным удалением покровное или сухой площадке агарозы. Если подушка слишком сухая, можно заметить, что аксоны развивать бисером внешний вид. В некоторых случаях это происходит потому, что черви не были размещены на площадке достаточно скоро после ее изготовления. Кроме того, старые запасы раствора агарозы может быть выше, чем 3%-ной концентрации после многократного плавления.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
0,05 мкм бисер полистирола	Polysciences, Inc	08691
0,10 мкм бисер полистирола	Polysciences, Inc	00876
Агарозном GPG / LE	Американская Биоаналитическая	00972	Ультра чистый
Сокол 14 мл Полистирол с круглым дном трубы	BD Biosciences	352057	17 х 100 мм стиль, nonpyrogenic
Thermo Scientific Обычная precleaned слайды микроскопом	Эри ОАО Научно-	420-004T	3 "х 1" х 1 мм
Покровные стекла	VWR	48366 205	18 мм х 18 мм Количество 1 1 / 2
KIMTECH науки Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
BD Falcon 100 х 15 мм Стиль чашки Петри	BD Biosciences	351029
Лента пустой 3/4w х 500L	TimeMed	T-512
Погружение нефти	Nikon		Тип А, й = 1,515
EG1285 или CZ1200	C. Элеганс генетический центр	http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/
OptiScan II	ДО Научно
NIS-Elements Ar или Br	Nikon
Micropoint абляция лазерная система	Фотонные Научные
Соединения микроскопом	Nikon	Затмение 80i
Hamamatsu камеры	Hamamatsu Photonics	Модель C8484-05G01
Dell Precision T3400 ПК с процессором Intel Core 2 Duo	Лощина
Windows XP Professional		Microsoft	Версия 2002, Series Pack 3
Двойной сухие ванны инкубатор	Fisher Scientific		Аналоговый контроль
4X Plan Fluor цель	Nikon
100X Plan Apo VC нефти цель	Nikon
Дюмон # 5 / 45 пинцетов	Дюмон	11251-35	Dumoxel стандартные советы, можно также использовать # 7
Препаровальная лупа	Nikon	SMZ800	С NI-150 Высокая интенсивность Просветителя