Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов

Резюме

Клеточный lymphocytotoxicity (ХМЛ), анализы могут быть использованы для тестирования аутореактивных ответы и изучение механизмов смерти клеток в пробирке. Тем не менее, с использованием живых-клеточной конфокальной микроскопии изображений с флуоресцентными красителями, типа и кинетики гибели клеток, а также путей использованы может быть изучен более детально.

Аннотация

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the radionuclide Chromium 51 (⁵¹Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of ⁵¹Cr from target cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of ⁵¹Cr.

As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8⁺ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with ⁵¹Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of ⁵¹Cr was recorded to calculate specific lysis

Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37°C, with 5% CO₂, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.

Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

протокол

1. Подготовка клетки

1. Культуры клеток-мишеней: Культура мыши бета клеточных линий, NIT-1 и NIT-4, было описано выше ^1,2 в DMEM с добавлением 10% FBS, 0,02% BSA, Номера для незаменимая аминокислота, 15 мм HEPES, 16.5мм Glocose и пенициллина / стрептомицина. Для ⁵¹ Cr маркировки, семенами клеток в плоскодонных 96-луночного планшета для культуры в 5х10 ^{4 клеток} / лунку в 200 мкл культуральной среды. Для микроскопии экспериментов, семенные клетки в 8-а-Так Лаборатории II патрон 5x10 покровного стекла на ⁴ на камеру в 500 мкл культуральной среде, и позволяют выращивать в течение 48 часов до использования в цитотоксичности экспериментов.
2. Управление Т-клеток линии культуры: Используйте Jurkat клеточной линии (АТСС, CD3 ⁺ лимфоцитов человека клеточной линии) в качестве отрицательного контроля. Культуры клеток в Jurkat RPMI1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1,5 г / л бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES и 1,0 мМ пирувата натрия.

2. Сбор и активации эффекторных аутореактивных CD8 ⁺ Т-клеток

NOD.Cg-RAG1 ^tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] и NOD.Cg-RAG1 ^tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] были приобретены у лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME) и разводят в нашей мыши объекта. F1 гибридное потомство от вязки из NOD-AI4a с NOD-AI4b [NOD-AI4a / B] развития диабета в 3-5 недель. Все мыши были размещены в конкретный возбудитель, свободных средств и утверждается животных соответствующие учреждения по уходу и использованию комитета.

1. Эвтаназии 3-4 недельных NOD-AI4a / б мышей использованием CO _2.
2. Сбор селезенки от мышей. Эвтаназии мышей готовы с этанолом брызг и возбуждено по хирургической капотом. Селезенки удаляются и положить в ледяной буфером HBSS немедленно.
3. Сбор клеток селезенки использованием 7 мл стеклянного гомогенизатора. Два-три селезенки каждого ставятся в 5 мл холодной HBSS и гомогенизировали с 7 мл стеклянного гомогенизатора. Гомогенат собирают и центрифугируют при 1200rpm в течение 5 минут при температуре 4 ° С с использованием Sorvall RT7 ⁺ центрифуги. Сотовые гранулы собираются.
4. Удаление эффекта красных клетках крови с использованием гипотоническая обработка раствором. Пеллеты относятся с 5 мл гипотонического раствора / селезенки на льду в течение 5 минут, затем нейтрализуют добавлением равного объема HBSS. Сбор клетки центрифугированием, как описано выше, и ресуспендируют в 50 мл HBSS. Pass приостановлено клетки через клеточные сито и считать использование гемоцитометра с окрашиванием TrypanBlue.
5. Активация клеток. Ресуспендируют клеток 5х10 ⁶ / мл и активации с использованием 3-х дневный культуры с 0,1 мкМ AI4 mimotope (амино YFIENYLEL последовательность кислота) и 25 ед / мл ИЛ-2 в RPMI1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1,5 г / L бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES и 1,0 мМ пирувата натрия.

3. ⁵¹ Cr релиз анализа для изучения CML

1. Этикетка клетки цель: добавить ⁵¹ Cr с клетками-мишенями на 1 мкКи / лунку и культуры в течение 3 часов, и промыть 3 раза культуральной среде.
2. Приостановить эффекторных клеток в RPMI 1640, как указано в шаге 2,5, так что конечный объем в каждую лунку добавляют 200 мкл.
3. После последней промывки меченых клеток-мишеней, добавляют активированный эффекторные клетки к клетке-мишени культур на желаемом эффекторных до цели (E: T) коэффициентов. Мы обычно используем E: T отношений на 0,4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 и 50:1.
4. Добавьте свежие изменение RPMI 1640 среде (см. шаг 2.5) до 6 скважин клеток-мишеней в качестве спонтанного лизиса контроль.
5. Сотрудничество культуры эффекторов и клеток-мишеней в течение 16 часов.
6. Сбор супернатант в 6x50 мм Известь стеклянные трубки
7. Lyse клетки путем добавления 100 мкл 2% SDS и пипетки несколько раз мягко.
8. Сбор Клеточный лизат в другой набор 6x50 мм Известь стеклянные трубки.
9. Вымойте скважин раз с чистой H ₂ O и добавить мыть в трубах Клеточный лизат.
10. Граф супернатанты и клеточных лизатов с помощью гамма-счетчика.
11. Рассчитать конкретных лизис следующим образом:
    

4. Окрашивание клеток для живого изображения ячейки

Среди наиболее часто используемых митохондриального мембранного потенциала красители, TMRM экспонатов мере митохондриальной токсичности. ³ Таким образом, мы выбираем TMRM для этих исследований жить изображений клеток.

1. Подготовка 40 мМ фондовом TMRM раствора в ДМСО и хранить при температуре -20 ° C. Сделать [25 нм] свежие рабочего раствора в фенол красный без DMEM со всеми дополнениями для NIT-1 клеточная культура ^1.
2. Пятно целевой NIT-1 клеток с TMRM 25 нм в течение 30 мин при 37 ° C.
3. Замените СМИ со свежей средой, содержащей 5 нМ TMRM для поддержания равновесного распределения красителя ^4.
4. Граф активированный эффекторные Т-клетки AI4 использованием гемоцитометр.
5. Пятно активированный эффекторных AI4 Т-клеток с 1 мкл / мл для Picogreen5 минут при комнатной температуре и мыть с фенолом красным без питательной среды в 3 раза.

5. Оценка Т-лимфоцитов-опосредованных бета гибели клеток с использованием живого изображения ячейки

1. Горы покровного стекла патрон с окрашенных клеток NIT на сцене Zeiss LSM 510 конфокальной микроскопии. Удалить вкладку с dremmel и газовой стерилизации стеклянных патрон с оксидом etheline. Этап оснащен жить-клеточной изображений камера, которая с контролем температуры на 37 ° С и 5% CO ₂ с влагой.
2. Добавить активируется и окрашенных Т-клеток, назначенных камер при разных E: T отношений.
3. Добавлен же количество окрашенных клеток Jurkat с контролем камер.

6. Получение изображения в реальном времени клетка

Микроскоп снабжен моторизованным этапе, что позволило нам неоднократно получать изображения в разных местах, от одного или разных камер автоматически за время хода эксперимента.

1. Использование 63x объектив нефти, получать изображения с интервалом в каждые 3 минуты в общей сложности 300 кадров в месте.
2. Обнаружение TMRM окрашивания использованием длины волны возбуждения 543 нм и набор фильтров для излучения 565-619 нм
3. Обнаружение Picogreen окрашивания использованием возбуждении 488 нм и набор фильтров для излучения 500-630 нм. Видео было создано с помощью Zeiss LSM программного обеспечения.

7. Конвертация видео для публикации

1. Использование программного обеспечения Zeiss LSM, создавать несжатый файл фильма в формате AVI.
2. Для преобразования видео в формат опубликованы, импорта видео в пакет программного обеспечения Фиджи ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ц / ) распределения, используя Bioformats плагин из локусов ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
3. Регулировка яркости и контрастности, чтобы сбалансировать зеленый и красный сигналы и частота кадров была установлена ​​на 2 кадр / сек, используя меню анимации вариантов.
4. Crop видео до 512 х 512 пикселей и экспорта, как несжатый файл AVI.
5. Откройте этот файл AVI в Программное обеспечение QuickTime 7 (Apple Computer, Купертино, Калифорния), а также сжатие и экспорта в открытый формат файлов видео H264/MPEG-4 при 1200 кбит / сек.

8. Представитель Результаты:

1. Представитель результате анализа ₅₁ Cr ХМЛ. На рисунке 1 показана представитель результате анализа ХМЛ, где процент конкретных лизис (Y ось) увеличивается по мере создания эффектов: Целевые отношения (оси Х) возрастает. Целевые клетки островков первичной изолированной от иммунодефицитных NOD RAG1-/ -. Мышей и помечен ⁵¹ Cr. Спленоциты от NOD.AI4α / β трансгенных мышей изолированы и активированные как описано в шаге 2 выше. Цели и эффекторы были совместно культивировали в течение 16 часов. Процент конкретных лизис рассчитывается как описано в шаге 3,11 выше.
2. Два представителя (положительные и отрицательные) результаты Т клеточного бета-клеток митохондриального мембранного потенциала диссипации представлены. Клетки окрашивали и реакции регистрируются как описано в пунктах 4, 5 и 6 выше, видео-файлы создаются как в шаге 7. Видео 1: клетка мыши бета линии NIT-1 была запятнана митохондриального мембранного потенциала красителя TMRM (красный). Активированный, аутореактивных CD8 ⁺ Т-клеток AI4 (Витраж зеленый с Picogreen) были инициаторами культивировали с этим NIT-1 клетки на E: T отношением 50:1. NIT-1 митохондриального мембранного потенциала рассеивается постепенно в течение 400 минут длительности, но только в кластеры, которые взаимодействуют с AI4 Т-клеток. Видео 2: В качестве контрольного эксперимента, NIT-1 клетки окрашивали TMRM и совместно с культурно Picogreen окрашенных клеток Jurkat на E: T отношением 50:1. Jurkat клетки человеческого Т-клеточной линии, МНС неверными. NIT-1 клеток поддерживается митохондриального мембранного потенциала на всем протяжении от 400 минут со-инкубационный период. Jurkat клетки не взаимодействует с NIT-1 кластеров и, следовательно, не вызывают убийства.

Рисунок 1 представитель результате ХМЛ, используя в качестве клеток-мишеней первичных островков изолированы от иммунодефицитных NOD.Rag1-/ -. Мышей и спленоцитов от NOD.AI4α / β трансгенных мышей. Цели и эффекторы были совместно культивировали в течение 16 часов. Процент конкретных лизис возрастает по мере создания эффектов: увеличение целевой отношение.

Видео 1. Мышь бета-клеточной линии NIT-1 была запятнана митохондриального мембранного потенциала красителя TMRM (красный). Активированный аутореактивных CD8 ⁺ Т-клеток AI4 (Витраж зеленый с Picogreen) были инициаторами культивировали с этим NIT-1 клетки на E: T отношением 50:1. NIT-1 митохондриального мембранного потенциала диссипацииТед постепенно в течение 400 минут длительности, но только в кластеры, которые взаимодействуют с зелеными AI4 Т-клеток. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео .

Видео 2. NIT-1 клетки окрашивали же, как описано в Video 1 и со-культивировали с Picogreen окрашенных человека Jurkat клеточной линии T. NIT-1 клетки в состоянии поддерживать митохондриальный мембранный потенциал продуманы продолжительностью 400 минут. Jurkat клетки не взаимодействует с NIT-1 кластеров и, следовательно, не вызывают убийства. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео .

Обсуждение

Цитотоксических Т-клеток опосредованной смерти бета-клеток является основным патофизиологии T1D ^5. CML анализов использованием ⁵¹ Cr релизе позволяют исследовать степень эффекторных-целевой отклик ^6. Тем не менее, детальный процесс и пути Т клеточного гибели клеток бета-п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Cr-51	Перкин Элмер	NEZ030500IMC
PBS	Cellgro	21-040-60
Tetramethyl родамина метиловый эфир (TMRM)	Invitrogen	T668
Picogreen	Invitrogen	P7581
AI4 mimotope	mimotopes.com	аминокислотной последовательности: YFIENYLEL
Ил-2	R & D	485-MI
DMEM	Invitrogen	11885
FBS	Hyclone	SH30071.03
Бычьего сывороточного альбумина	Сигма	A8412
HEPES	Cellgro	25-060-Cl
MEM Номера для незаменимых аминокислот	GIBCO	11140
Пенициллин / стрептомицин	Близнецы	400-109
Фенол красный без DMEM	Сигма	D5303
СО2 инкубатор	Thermo Fisher	HeraCell 150i	Хранится стерильный для культуры клеток
Биологические кабинета безопасности	Thermo Fisher	Forma 1440
Одноразовые труб культуры, 6x50 мм Известь стекла	Рыболов	14-958-
Радиоактивность	Перкин Элмер	Мастер 1470 Автоматическая радиоактивность
Конфокальной микроскопии	Zeiss	LSM 510 Мета конфокальной	С моторизованных этапе и жить камере ячейки
Пипетка (1 мл, 200 мкл, 20 мкл, 10 мкл, 2μl)	Эппендорф
Трубы (янтарный)	Рыболов	50819772
Центрифуга	Sorvall Легенда RT +	75004377
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
Вертикальный микроскоп	Zeiss	Axioskop40
NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Мыши	Лаборатории Джексона	004347
NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Мыши	Лаборатории Джексона	004348
NOD-AI4α / β F1 мышей	N / A	N / A	Выведен в объект животного UF