Протокол для сбора и окрашивания гемоциты от желтой лихорадки комаров Aedes aegypti</em

Резюме

Упрощенный еще точный метод для сбора и пятна комаров гемоциты описывается. Наш метод сочетает в себе простоту перфузии с точностью высокотехнологичной техники инъекции, чтобы изолировать чистые препараты гемоциты в Aedes комаров. Этот метод облегчает исследованиях, требующих знания типов гемоцитов и их изобилие.

Аннотация

Комары являются переносчиками для целого ряда болезнетворных патогенов, таких как вирус желтой лихорадки, малярии паразиты и филяриатозных червей. Лаборатории проводят расследование против патогенных компонентов иммунной системы в переносчиками болезней видов в надежде получения трансгенных комаров, которые поддаются таких патогенов ^{1, 2.} Врожденной иммунной системы комаров состоит из нескольких линий защиты ^3. Патогенные микроорганизмы, которые удается бежать барьер введенные эпителия картонных комаров кишки ⁴ введите гемолимфы и сталкиваются с циркулирующим гемоциты, важные клеточные компоненты, которые инкапсулируют и поглотит патогенов ^{5, 6.} Ученые не нашли доказательств кроветворной ткани в комаров и текущие данные свидетельствуют о том, что количество гемоцитов зафиксирована на уровне взрослых возникновение и цифры могут на самом деле падение, как комар возрасте от ^7. Умение правильно собрать и идентифицировать гемоциты из медицинской важных насекомых является важным шагом для исследований в клеточный иммунитет. Тем не менее, небольшой размер комаров и ограниченного объема гемолимфы создать проблему для сбора клеток иммунной системы.

Две организованные методы сбора комаров гемоциты включают изгнание из гемолимфы сократить хоботок ^8, и объема перемещения (перфузии), в котором солевой вводится в мембранных necklike области между головой и грудной клетки (например, шейки матки) и перфузии гемолимфы собирается из разорванной открытия в дистальной части брюшной полости ^{9, 10.} Эти методы, однако, ограничиваются низкой восстановления гемоцитов и возможного загрязнения жировыми клетками тела, соответственно ^11. Совсем недавно метода называют высокий инъекции / восстановления обеспечивают быстрое восстановление иммуноцитов с использованием антикоагулянта буферов при одновременном снижении уровня загрязнения масштабов и внутренних тканей ^11. Хотя этот метод позволяет усовершенствованный метод сбора и хранения гемоциты для первичной культуры, оно влечет за собой ряд впрыска и сбора шаги, которые не нужны, если вниз по течению целью является сбор, фиксация и пятно гемоциты для диагностики. Здесь мы демонстрируем наш метод сбора комаров гемолимфы, что сочетает в себе простоту перфузии, используя антикоагулянта буферы вместо физиологического раствора, с точностью высокотехнологичной техники инъекции, чтобы изолировать чистые препараты гемоциты в Aedes комаров.

протокол

1. Подготовка заранее гемоцитов коллекцию

1. Приготовьте раствор гемолимфы разбавителя, который состоит из 60% среднего Шнайдер, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), и 30% цитрат буфер (антикоагулянта, 98 мМ NaOH, 186 мМ NaCl, 1,7 мМ EDTA, 41 мМ лимонной кислоты, рН 4,5) ^11. Сделать 1,0 мл аликвот, которые могут храниться при температуре -20 ° C. Используйте каждую аликвоту только один раз (см. материалы).
2. Подготовка стекла предметные стекла (75 х 25 х 1 мм), забив 1 см в диаметре круг на одном конце использованием стекла травлением инструмент. Кроме того, предметные стекла с двумя предустановленными травления круги могут быть приобретены (например, Fisher Scientific или EMS источников). Один стекло на комаров будет необходимо.
3. Подготовка набор стеклянных игл (см. материалы) потянул в соответствии со следующими рекомендуемые настройки (Саттер инструменты, модель P-87):
   

   Тепло Рампа +5

   Вытяните: 45

   Vel: 75

   Время: 175

   Давление 580

   
   Использование рекомендуемые настройки на этой съемник, строим иглы, что около 500 мм в длину с хвостовиком длиной около 3 мм. Предварительно вытащил иглы также можно приобрести (например, Tritech исследований).

2. Подготовка microinjector заранее гемоцитов коллекцию

1. Вставьте вытащил иглу в держатель иглы microinjector в соответствии с инструкциями производителя. Засыпка microinjector (см. материалы) трубки, шприц и иглу вытащил стекло с минеральным маслом в соответствии с инструкциями производителя.

3. Подготовка самок комаров заранее гемоцитов коллекцию

1. Аспирируйте 15 взрослых самок на мелкие твердые контейнеры клетки, которые могут быть в контакте со льдом. Опустите клетку с комарами во льду достаточно глубоко, так что всю высоту клетке, и все стороны находятся в контакте со льдом. Это будет гарантировать, что все комары будут подвергаться воздействию холода.
   Холодная комаров анестезию в течение приблизительно 8 минут или пока они больше не являются мобильными.
2. Разместите один комар на депрессию слайда. На этом слайде будет служить в качестве места для инъекций.

4. Гемоцитов коллекцию

1. Установить microinjector занять 12 мкл гемолимфы разбавителя в вытащил стекло иглой и вводят раствор в комара между седьмым и восьмым брюшных сегментов. Около 3 комары могут быть введены с 3-3,5 мкл всего 12 мкл принято. Комаров следует осторожно удерживается на месте с щипцами в то время как инъекции не выполняется. Небольшой объем разбавителя должна оставаться на кончике иглы, чтобы предотвратить нефтепродуктов от инъекции. После инъекции живот должен выглядеть "заполнен" или раздутой.
2. Место инъекции комаров в отдельном чистом контейнере со льдом, чтобы восстановить в течение 5 мин. Инкубации антикоагулянта решение разбавителя внутри комаров поможет выбить гемоциты придерживаясь внутренних тканей. В среднем от 3 до 5 свежих комары могут быть введены в течение каждого периода восстановления 5 мин.
3. Через 5 минут на восстановление, отрезать ноги, крылья и кончик живота (на восьмом сегменте) каждого комара по одному времени с помощью микро-ножниц. Это должно быть сделано в восстановлении чашку помещают на лед. Отрезание ног и крыльев снижает вероятность весы передаются коллекции слайдов. Примечание: не режут ноги и крылья слишком близко к грудной сайтов вложения или вы рискуете другие отверстия для гемолимфы бежать. Гемолимфы должны быть собраны через отверстие создан на кончике живота.
4. Вымойте один стакан травления слайд микроскоп с 70% этанола и высушить его с kimwipe. Первая позиция вводится и выздоровел от комаров скользить по внешнему краю травления круг. Установить microinjector, чтобы забрать 12 мкл разбавителя свежей гемолимфы и ввести этот объем в комара в боковой стороне его среднегруди. Доставить большинство, но не весь объем разбавителя (около 8 - 10 мкл), с тем чтобы предотвратить нефтепродуктов от инъекции. Небольшой объем разбавителя должна оставаться на кончике иглы.
5. Позиция комаров таким образом, чтобы сократить брюшной открытие на краю 1 см круг. После инъекции разбавленной гемолимфы должны быть собраны в пределах отмеченной области. Как только игла удаляется из mesothoracic месте инъекции, возобновить проведение комаров между двумя рукавами пинцетом и слегка сжать живот с теми, щипцы, чтобы направить гемолимфы на протравленных площадь круга.
6. Разрешить разбавленный гемолимфы сушить на слайде в течение приблизительно 10 минут или пока не будет заметно сухая.

5. Гемоцитов фиксации и окрашивания

1. Пятно каждый слайд по отдельности с HEMA3 ⁷ (см. материалы): Dip сLiDE в фиксатор 5 раз в течение 1 секунды каждый раз; Dipslide в решение, которое я 3 раза в течение 1 секунды каждая, и, наконец, окуните в раствор слайд II 3 раза в течение 1 секунды каждое. Промыть задней слайд с водой DI. Перед слайд не должны быть промыты. Пятно сухой перед слайд вне травления круг, содержащий окрашенных тканей.
2. Применение установки среды (например, Шур / Mount или Polymount) вокруг центра травления и место покровное стекло на ней. Надавите слегка на покровное стекло (25 х 25 мм), так что монтаж средой распространяется на всей территории, охваченной покровным стеклом (в том числе травление круг, содержащий окрашенные ткани). Разрешить слайды высохнуть в течение не менее 3 часов или на ночь. Гемоциты должны рассматриваться в течение 2 недель после коллекцию для оптимальной визуализации и обработки изображений.

6. Представитель Результаты

Примерами фиксированных и окрашенных HEMA3 гемоциты собраны из женщин Aedes aegypti взрослых, показаны на рис 1A-C. Рисунок 1А показывает гемоцитов, которые мы определили как prohemocyte основан на свои небольшие размеры, сферическая-сфероидальной формы и высоких ядерных в цитоплазму отношение (550x увеличение) ^11. На рисунке 1б показывает гемоцитов классифицируется как oenocytoid на основе ее сфероидальной формы и высокой цитоплазмы ядерной отношение (550x увеличение). Наконец, на рисунке показана 1С гранулоцитарного типа гемоцитов (550x увеличение). Гранулоцитов более гранулированный характер и имеют тенденцию быть более амебоидных по форме и поведению они придерживаются стеклянных поверхностей. Использование ранее опубликованных критериев гемоцитов ввода и восстановление ^11, наш метод сбора дали такое же количество от общего числа гемоцитов и мы также обнаружили, что гранулоциты составляют большой процент от общего числа гемоциты ¹¹ (рис. 2).

Рисунок 1. Свет изображений микроскопа представитель HEMA3 фиксированных, окрашенных prohemocyte (А), oenocytoid (B), и гранулоцитов (C) от Ae. aegypti взрослой женщины. С = цитоплазму, ядро ​​N = G = гранул.

Рисунок 2. Всего насчитывает ± SE всех гемоциты и гранулоцитов получить у одной самки комара от нашего разведения гемолимфы и метод сбора.

Обсуждение

Гемоцитов метод сбора описанные здесь изменяется от ранее опубликованных методов и позволяет изолировать чистую препараты гемоциты от комаров Aedes с меньшим количеством шагов. Хотя наш особый интерес заключается в характеризующие гемоцитов населения в Aedes комаров, мы считае?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Шнайдера среднего	Sigma-Aldrich	S0146
Фетальной телячьей сыворотки	Sigma-Aldrich	F0643
Hema3 пятно комплект	Рыболов	123-869
Стекло иглы (Боросиликатного с нитью)	Саттер Инструмент	BF100-78-10	1,0 мм и диаметром 0.78mm ID
Иглы съемник	Саттер инструменты	Модель P-87
MicroInjector	Tritech исследований	MINJ-ПД
Иглодержатель	Tritech исследований	MINJ-4