In Vitro Пробирной бактериальной адгезии на эпителиальных клетках млекопитающих

Резюме

Этот протокол является простым бактериальной адгезии анализ состоящей в подсчете числа бактериальных колониеобразующих единиц, которые будут соблюдаться на культуре клеток. Анализа является надежной, независимой от адгезина изучены, и многочисленные вариации используются в большинстве лабораторий, работающих на бактериальную патогенез.

Аннотация

Чтобы вызвать инфекции, бактерии должны колонизировать хозяина. Бактериальные возбудители выражения различных молекул или структур, способных содействовать привязанности к клеткам хозяина ^1. Эти адгезины опираться на взаимодействие с клеткой-хозяином поверхностных рецепторов или растворимые белки, выступая в качестве моста между бактериями и хозяином. Адгезия является важнейшим первым шагом до вторжения и / или секрецию токсины, таким образом, он является ключевым событием для изучения в бактериальных патогенез. Кроме того, придерживался бактерии часто вызывают изысканно тонкой настройки клеточных реакций, исследования, которые родили области ² 'сотовой микробиологии. Надежные анализы для бактериальной адгезии на клетках хозяина и их вторжения, следовательно, играют ключевую роль в патогенезе бактериального исследования и уже давно используется во многих лабораториях пионером ^3,4. Эти анализы в настоящее время практикуется большинством лабораторий, работающих на бактериальную патогенез.

Здесь мы описываем стандартном анализе соблюдения иллюстрирующие вклад конкретного адгезина. Мы используем штаммом кишечной палочки 2787 ^5, человека штамма патогенного выражения Автовоз Adhesin Участие в диффузных сцепления (AIDA). В качестве контроля мы используем мутантного штамма отсутствует ген Аида, 2787Δ Аида (Ф. и М. Бертиом Mourez, не опубликовано), а также коммерческие лаборатории штамма Е. палочка, C600 (Новая Англия Биолабс). Бактерии остаются придерживаться клетки обычно используются НЕр-2 человека эпителиальной клеточной линии. Этот анализ был менее подробно описана до ^6.

протокол

1. Предварительное: бактериальные штаммы и эпителиальных клеток.

Манипуляции клеток и бактерий осуществляется асептически, под капотом ламинарного потока.

1. Недавно изолировать Е. штаммов 2787, 2787Δ Аида, и C600 с глицерином акции на лизогении Отвар (LB) агаром (1% триптон, 0,5% натрия хлорида, 0,5% дрожжевого экстракта, 1,5% агара) и растут при температуре 37 ° C. Чтобы свести к минимуму различия в анализе, рекомендуется всегда использовать свежие штаммы покрытием и держать штаммы при 4 ° С на опечатанных чашках Петри только максимум пару недель.
2. Культура НЕр-2 клетки (АТСС CCL-23) в модифицированной Eagle высокий уровень глюкозы в Дульбеко Средняя (DMEM) с добавлением 10% тепла инактивированной телячьей сыворотки (тепловой инактивации осуществляется при 56 ° С в течение 30 мин). Во время процедуры культуры мы также добавить 10 ед / мл пенициллина и 10 мкг / мл стрептомицина.
3. Расти Нер-2 клетки при 37 ° С в камере инкубатора атмосфере, содержащей 5% СО _2. Использование стандартных процедур клеточной культуры для поддержания клеток, которые выращиваются в 75 см ² колбы и субкультивировали каждый раз, когда они достигают слияния. Мы используем наши культуре клеток, пока они не достигают от 30 до 40 места, а затем отменить их.
4. Подготовка анализа, когда НЕр-2 клеток в 75 см ² колбы почти достигают слияния и поэтому готовы к присоединению анализа.

2. ДЕНЬ 1: Подготовка посевного и эпителиальные клетки

1. Вымойте НЕр-2 клеток в колбе раз с фосфатом теплой Дульбеко буферного раствора (DPBS: 8 г / л NaCl, 0,2 г / л KCl, 0,2 г / л KH ₂ PO _4, 0,21 г / л Na ₂ HPO _4: 7H ₂ O)
2. Клетки инкубировали с 0,05% трипсина - ЭДТА в течение 5 минут перед добавлением свежей теплой полной среде. После свежую среду добавляют клетки ресуспендировали с помощью пипетки вверх и вниз.
3. Центрифуга клеточной суспензии при 2000 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют гранул в DPBS и центрифуга снова.
4. Ресуспендируют клеток в свежую среду с добавлением 10% сыворотки, но не содержащих антибиотики, в концентрации 2х10 ^{5 клеток} / мл.
5. Семенной один миллилитр суспензии клеток в трех сетах дубликатов скважин (по одной для каждого штамма) в центре 24-луночного планшета и инкубировать пластину на ночь в культуре клеток инкубатора.
   Примечание: Важно, чтобы сыворотка тщательно decomplemented и что антибиотики опущены после этой стадии. Невыполнение этого требования может убить заражение бактериями.
6. Привить одну изолированную колонию каждого штамма бактерий (2787, 2787Δ Аида и C600) в 5 мл LB бульоне (1% триптон, 0,5% натрия хлорида, 0,5% дрожжевого экстракта) и растут в течение ночи при 37 ° С при энергичном встряхивании (180 оборотов в минуту ).

3. ДЕНЬ 2: Заражение клетки

1. Осмотрите НЕр-2 клеток под инвертированным микроскопом чтобы удостовериться, что они по крайней мере 90% сливной и не загрязнены.
2. Промытые клетки с теплой DPBS и, в каждую лунку, добавить 1 мл свежей среды с добавлением 10% сыворотки, но не содержащих антибиотики. Кроме того, добавить свежую среду до трех скважин без клеток. Это будет использовано для определения общего количества бактерий в инокулята для каждого штамма.
3. Измерьте оптическую плотность при 600 нм (ОП _{0,600 нм)} бактериальных культур. Добавить аликвоту каждой бактериальной культуры к одному набору дубликатов скважин содержащих Нер-2 клетки и одной скважины, не содержащие клеток. Как правило, мы используем объема ночной культуры соответствующее 10 ⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ). Это означает множественность заражения (МВД) 5:1 (бактерии: клетки). Хотя мы непосредственно использовать нашу ночь культур, иногда бывает целесообразно центрифуги бактерий и ресуспендирования их в DPBS, чтобы избежать вредного воздействия выделяемых молекул, присутствующих в ночь культур (таких как цитотоксины, например)
   Примечание: МВД может колебаться в пределах 100:1 и 1:10. Высшее МВД приводит к повышению изменчивости и фона и бактерии, как правило, придерживаются пластиковые пластины. Нижняя МВД также дает высокую изменчивость. После того, как МВД будет выбран, крайне важно быть последовательным и держать эту МВД.
4. Инкубируйте инфицированных клеток в культуре клеток инкубаторе в течение 3 часов при 37 ° C с 5% CO _2.
   Примечание: Также можно центрифуги кратко пластины на низкой скорости (например, 1000 мкг в течение 1-2 мин), для того, чтобы привести все бактерии в непосредственном контакте с клетками. Это дополнительные преимущества синхронизации инфекции, а также позволив короткий инкубационный раз (всего за 15-30 мин).
5. Удаление среды из инфицированных клеток и промыть клетки 3 раза теплой DPBS. На данном этапе, приверженцем бактерий обычно можно увидеть со стандартным микроскоп и мы регулярно выполнять эту проверку.
6. Лизировать клетки и отделить придерживался бактеteria, добавьте 100 мкл 1% Тритон Х-100 в каждую лунку содержащих клеток. Другие моющие средства могут быть использованы (например, сапонины, например).
7. Инкубируйте клетки в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем добавить 900 мкл LB среде.
8. Аккуратно гомогенизации суспензий повторными вверх-вниз пипетки. Скважин без клеток, содержащих посевной аналогичным мягко гомогенизации.
   Примечание: Некоторые бактерии могут быть слишком чувствительны к моющим средством, в этом случае мы отделить эпителиальных клеток при инкубации с 0,05% трипсина - ЭДТА в течение 20 мин при 37 ° C. Клетки вместе с наклеенными бактерий также могут быть Царапины от скважин с кончика пипетки.
9. Подготовка серийного 10-кратного разведения суспензии бактерий и придерживался посевной использованием бульона LB и пластины 100 мкл от 3 разведения (как правило, 1:1000, 1:10000 и 1:100000 разведения) на LB агар и инкубируют в течение ночи при 37 ° C .

4. ДЕНЬ 3: КОЕ подсчета и представления данных.

1. Граф колонии на пластинах и подсчитать количество КОЕ придерживался бактерий и посевного материала путем усреднения каждой серии разведений. Только между пластинами с 10-300 колоний следует.

5. Представитель результаты:

В следующей таблице приведены типичные результаты подсчета КОЕ придерживался бактерий и прививочный материал от 3 эксперименты в разные дни:

Результаты могут быть представлены непосредственно в качестве придерживался КОЕ, как показано на Рисунке 1A. С посевной размеры могут варьироваться от штаммов из-за различий в темпах роста или пипетки ошибки, часто бывает целесообразно, чтобы сообщить о результатах в процентах от придерживался бактерий. Процент придерживался бактерии могут быть рассчитаны путем деления числа КОЕ придерживался бактерий на число КОЕ в посевной, как показано на Рисунке 1B. Выполняя повторных измерений ANOVA и Бонферрони пост-тестов, чтобы сравнить все столбцы рис 1B, мы видим, что Существуют значительные различия (р <0,05) между 2787 и 2787Δ Аида, а также между 2787 и C600, но никакого существенного различия между 2787Δ Аида и C600.

Рисунок 1. Представление результатов в виде КОЕ придерживался бактерий () или процент придерживался бактерий (Б)

Процент приверженности наблюдается часто сильно зависит от экспериментальной установки (и, в меньшей степени, от экспериментатора). Особенно важными являются МВД и число моет, так что процент не следует буквально толковать.

Бактерий в посевной иногда может расти гораздо быстрее, чем бактерии в присутствии клеток, перекос размер посевной по сравнению с реальным общее число бактерий в скважинах с клетками. Чтобы смягчить эту проблему, рекомендуется либо: (я) используют колодцы с ячейками для определения посевного: НЕр-2 клетки высевают в дополнительных хорошо и инфицированных. В конце теста, вместо того, чтобы отбросить супернатант и мытье, 100 мкл 10% Triton X-100 добавлен к колодцу. Лизировать клетки и лизат содержащая придерживался и не придерживался бактерий осторожно перемешать путем повторяющихся вверх-вниз пипетирования;. ИЛИ (II) собирают супернатанты инфицированных клеток в конце анализа, а также из супернатантов DPBS моет и определить число КОЕ в эти объединенные супернатанты. Это даст число КОЕ не-придерживался бактерий. Процент придерживался бактерии могут быть затем рассчитывается путем деления числа КОЕ придерживался бактерий путем добавления число КОЕ в придерживалась и не придерживается бактерий.

Чтобы проиллюстрировать надежность анализа, мы можем сравнить это с протоколом анализа осуществляется с S4074, клей патогенный штамм свиного из Actinobacillus pleuropneumoniae ^7, инкубировали с клетками из недавно созданного трахеи клеточной линии поросенок, НПТР ^8. Помимо различий в средствах массовой информации, необходимых для роста бактерий и клеток, с той лишь разницей, что бактерии используются для инфекции с экспоненциально растущей культурой, а не от стационарной фазы ночной культуры. С А. pleuropneumoniae это тоже очень важно уважать МВД 10:1 и не более 3 часов инфекции, в противном случае выделение токсинов будет вызывать гибель клеток и исказить результаты. Кроме того, этот штамм A. pleuropneumoniae легко придерживаться пластик, поэтому важно использовать сливной клеток и проверить визуально, что клетки не шелушение прочь.

Обсуждение

Этот протокол описывает стандартные бактериального анализа соблюдения, которые могут быть модифицированы для изучения инвазии (например, с использованием гентамицина защиты анализа ^3). Подсчет колониеобразующих единиц позволяет количественного определения, по сравнению с под?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент	Компания	Номер в каталоге
Высокая глюкоза DMEM	GIBCO-Invitrogen	12430-054
DDPBS	GIBCO-Invitrogen	14190-144
Бычьего сывороточного роста	Hyclone	SH3054
Пенициллин / стрептомицин	GIBCO-Invitrogen	15140-148
24 луночных	Гранулирование	3337
Тритон Х-100	Fisher Scientific	BP151-100