Одноместный Читайте и парные Конец мРНК-Seq Illumina библиотек из 10 нанограмм Всего РНК

Резюме

Здесь мы опишем способ получения как одиночных и парных читать конца Illumina мРНК-Seq секвенирование библиотеки для экспрессии генов анализ, основанный на T7 усиления линейной РНК. Этот протокол предполагает только 10 нанограмм начала тотальной РНК и генерирует очень последовательным библиотек, представляющим весь транскриптов.

Аннотация

Всего секвенирования транскриптома по мРНК-Seq в настоящее время широко используется для выполнения глобальной экспрессии генов, мутации, аллель-специфическая экспрессия и других генома анализа. мРНК-Seq даже открывает ворота для анализа экспрессии генов не-последовательности геномов. мРНК-Seq обеспечивает высокую чувствительность, широкий динамический диапазон измерений и позволяет чисел стенограмму копию в образце. Генома анализатор Illumina это выполняет последовательность большого числа (> 10 ⁷⁾ относительно короткие последовательности операций чтения (<150 б.п.). "Парные конца" подход, при котором один длинный прочитанных последовательно на обоих концах, позволяет для отслеживания альтернативные переходы сращивания , вставки и удаления, и полезно для де сборку заново транскриптома.

Одной из главных задач, стоящих перед исследователями, является ограниченное количество исходного материала. Например, в экспериментах, где клетки собирают лазерной микро-диссекции, доступны с полной РНК май меры в нанограмм. Подготовка мРНК-Seq библиотеки из таких образцов были описаны ^{1, 2,} но требует значительных ПЦР, которая может вносить систематическую ошибку. Другие РНК-Seq библиотеки строительства процедур с минимальным ПЦР были опубликованы ^{3, 4,} но требуют мкг количества начальный суммарный вес РНК.

Здесь мы опишем протокол для Illumina Genome Analyzer II платформу для мРНК-Seq последовательности для подготовки библиотеки, что позволяет избежать значительных ПЦР-амплификации и требует всего 10 нанограмм от общего числа РНК. Хотя этот протокол был описан ранее и проверены одного конца последовательности ^5, где было показано, для получения направленного библиотек, не внося значительный уклон усиления, то здесь мы проверить его в дальнейшем для использования в качестве парного конце протокола. Мы избирательно усиливать полиаденилированной РНК посланник начальный суммарный вес РНК с использованием T7 основан Eberwine линейный метод амплификации, придумал "Т7LA "(T7 линейного усиления). Усиливается поли-мРНК фрагментированы, обратной транскрипции и адаптер лигировали для получения окончательного библиотеки последовательности. Для обоих одно чтение и парных работает конца, последовательности отображаются на человека транскриптома ⁶ и нормированы так, что данные из нескольких работает, можно сравнить. Мы сообщаем измерения экспрессии генов в единицах стенограммы на миллион (TPM), который является превосходной мерой RPKM при сравнении образцов ^7.

протокол

1. Изолировать общей РНК

1. Добавить 1 мл Trizol в клетки / ткани, и гомогенизации с 18-22 марли иглу, если необходимо.
2. Добавить 200 мкл хлороформа, и спина при 14000 оборотов в минуту в течение 30 минут при 4 ° C.
3. Выньте верхний водный слой, добавить 0,5 мкл линейной акриламид, затем добавить 500 мкл изопропанола. Дайте настояться при комнатной температуре в течение 20 минут.
4. Спиновые при 14000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C, мыть гранул с 70% этанола, и вакуумные сухие.
5. Ресуспендируют в 1 мкл нуклеазы свободной воды и передачи до 200 мкл ПЦР-пробирку.

2. Подготовка двухцепочечной кДНК

1. Для более 1 мкл РНК добавляют 1 мкл 100 мкМ олиго-дТ-T7 обратный праймер транскрипции (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 '), тепло при 70 ° С (тепловой блок) в течение 5 мин, а оснастку прохладно на льду.
2. Добавить 1 мкл 5x буфера FS, 0,5 мкл DTT, 0,5 мкл смеси дНТФ и 0,5 мкл RnaseOUT (от Надстрочный II комплект).
3. Тепло до 42° С в машине ПЦР в течение 1 минуты, затем добавьте 0,5 мкл Надстрочный II обратной транскриптазы. Выдержите в течение 1 часа при температуре 42 ° C.
4. Тепло при 70 ° С в течение 10 мин, охлаждают до 4 ° C.
5. На лед, добавьте следующие строки в указанной реакции:

• Нуклеазы свободной воды - 22,75 мкл
• 5X вторых буфера нить - 7,5 мкл
• дНТФ смеси - 0,75 мкл
• Кишечная палочка ДНК лигазы - 0,25 мкл
• Кишечная палочка ДНК-полимеразы - 1 мкл
• RnaseH - 0,25 мкл

Выдержите в течение 2 часов при 16 ° С, затем добавляют 1 мкл T4 ДНК-полимеразы, и выдержать в течение дополнительных 10 минут при 16 ° С.

6. Трансфер до 1,5 мл трубки Эппендорф, и добавить 80 мкл воды.
7. Добавить 0,5 мкл линейных акриламида.
8. Добавить 72 мкл 3 М NH4OAc и 480 мкл холодного 100% этанола. Осадка в течение 1 часа при температуре -20 ° C.
9. Спиновые при 14000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 30 минут, промыть 1 мл 70% этанола, центрифуге при 14000 оборотов в минуту в течение 2минут, и вакуумными сохнуть в течение приблизительно 10 минут.

3. Amplify поли-мРНК в пробирке транскрипции

1. Ресуспендируют выше кДНК в 3,5 мкл воды нуклеазы бесплатно.
2. Чтобы выше, добавить 1 мкл дНТФ (всего 4 мкл), 1 мкл 10х буфера реакции и 1 мкл полимеразы Т7 и 0,5 мкл RnaseOUT из комплекта Megascript.
3. Инкубировать при 37 ° С в машине ПЦР в одночасье.
4. Готовы к следующему шагу. Может храниться при температуре -80 ° C.

4. Фрагментация усиливается поли-мРНК

1. Добавить 26 мкл воды выше реакции и 4 мкл 10x реагента фрагментации.
2. Тепло в машине ПЦР при 70 ° С в течение ровно 7 минут.
3. Добавьте 5 мкл буфера фрагментации остановить, поставить образцы на льду.

5. РНК очистки

1. Чтобы выше реакции, добавить 60 мкл воды и 350 мкл буфера RLT от Rneasy комплект MinElute и перемешать с помощью пипетки.
2. Добавить 250 мкл этанола, смешать с помощью пипетки, а пипетки в спину колонке.
3. Спиновые в 8000 RCF в течение 20 секунд.
4. Промыть раз с НПП, спина в течение 20 секунд, мыть второй раз с 80% этанола, спина в течение 2 минут, и сухие колонки с 5 минут спина.
5. Элюции РНК в 10 мкл воды нуклеазы бесплатно.

6. синтеза кДНК

Первый синтез нить для одной библиотеки читать:

1. В ПЦР-пробирку, добавить следующее:

• Фрагментированные Поли-мРНК - 10 мкл
• NotI Случайные Primer nonamer - 1 мкл

Инкубировать при температуре 70 ° С в течение 5 минут в амплификаторе, и быстрое охлаждение на льду. NotI Nonamer Primer (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3 '). 5 'проксимальной последовательности сайта NotI ограничение в то время как до следующей последовательности случайных регион обратном дополнение адаптер последовательность В Illumina из Чип-Seq комплект.

Чтобы выше, добавьте следующие на льду (с Надстрочный III комплект):

• 5X первой цепи буфера -4 мкл
• DVB-T - 2 мкл
• дНТФ смесь ^* - 1,5 мкл

Наденьте амплификаторе в течение 2 минут при 42 ° С, добавить 1 мкл Надстрочный транскриптазы III обратном, и инкубировать при температуре 42 ° С в течение 1 час.

* Вместо дЦТФ, 5-метил дЦТФ была использована в смеси дНТФ.

Первый синтез нити для парных конце библиотеки:

1. В ПЦР-пробирку, добавить следующее:

• Фрагментированные Поли-мРНК - 10 мкл
• Случайные грунтовки гексамера - 1 мкл

Инкубировать при температуре 65 ° С в течение 5 минут в амплификаторе, и быстрое охлаждение на льду.

2. Чтобы выше, добавьте следующие на льду (с Надстрочный firststrand III комплект):

• 5X первый буфер прядь - 4 мкл
• DVB-T - 2 мкл
• дНТФ (откомплект) - 1,5 мкл

Наденьте амплификаторе в течение 1 мин при 45 ° С, добавить 1 мкл Надстрочный транскриптазы III обратном, и инкубировать при 45 ° С в течение 1 часа.

Второй синтез нити (как для библиотек):

3. Чтобы выше, добавьте следующие на льду (с Надстрочный II комплект):

• Вода (РНКазы бесплатно) - 91 мкл
• 5X вторых буфера Strand - 30 мкл
• дНТФ (из комплекта) - 3 мкл
• Кишечная палочка ДНК лигазы - 1 мкл
• Кишечная палочка ДНК-полимеразы - 4 мкл
• Кишечная палочка РНКазы H - 1 мкл

Смешайте трубки обращением, дать краткий спина и инкубировать при 16 ° С в течение 2 часов.

7. Purify кДНК

1. Purify кДНК образца с колоннами Zymo, элюируются в 40 мкл воды для одно чтение и 30 мкл воды для парных конце библиотеки.

8. Конец ремонта

Для одиночных читать библиотеку:

(Используйте Illumina Чип-Seq образец приготовительный комплект)

1. Чтобы выше 40 мкл кДНК, добавьте:

• Т4 ДНК-лигазы буфера 10 мМ ATP - 5 мкл
• дНТФ смеси - 2 мкл
• T4 ДНК-полимеразы - 1 мкл
• Кленова фермента (разбавленный 1:05 водой для 1U / мкл) - 1 мкл
• Т4 PNK - 1 мкл

Инкубируйте в термоциклер в течение 30 минут при 20 ° C.

Для парных конце библиотеки:

(Используйте Illumina парные конце образца приготовительный комплект)

1. Чтобы выше 30 мкл кДНК, добавьте:

• РНКазы ДНКазы свободной воды - 45 мкл
• Т4 ДНК-лигазы буфера 10 мМ ATP - 10 мкл
• 10 мМ дНТФ смеси - 4 мкл
• T4 ДНК-полимеразы - 5 мкл
• Кленова фермента - 1 мкл
• Т4 PNK - 5 мкл

Инкубируйте в термоциклер в течение 30 минут при 20 ° C.

9. кДНК очистки

1. C опираться на кДНК с использованием столбцов Zymo. Элюции в 34 мкл EB для одно чтение и 32 мкл EB для парных конце библиотеки.

10. Добавить '' баз до конца 3 'фрагментов ДНК

Для одиночных читать библиотеку:

1. Подготовка следующей смеси реакции:

• ДНК-пробы - 34 мкл
• Кленова буфера - 5 мкл
• дАТФ - 10 мкл
• Кленова экзо - 1 мкл

Инкубировать 30 минут при 37 ° C.

Для парных конце библиотеки:

1. Подготовка следующей смеси реакции:

• ДНК-пробы - 32 мкл
• Кленова буфера - 5 мкл
• дАТФ - 10 мкл
• Кленова экзо - 3 мкл

Инкубировать 30 минут при 37 ° C.

11. кДНК очистки

1. Очистка кДНК с использованием столбцов zymo. Элюции в 10 мкл EB.

12. Адаптер лигирования

jove_step "> Для одиноких читать библиотеку:

(Используйте Illumina Чип-Seq образец приготовительный комплект)

1. Подготовка следующей смеси реакции:

• ДНК-пробы - 10 мкл
• Адаптер Oligo Mix - 1 мкл
• 2X ДНК лигазы буферные -15 мкл
• ДНК-лигазы - 4 мкл

Инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Адаптеры должны быть на льду талой и разводили 1:20.

Для парных конце библиотеки:

(Используйте Illumina парные конце образца приготовительный комплект)

1. Подготовка следующей смеси реакции:

• ДНК-пробы - 10 мкл
• PE адаптер Oligo Mix - 10 мкл
• 2X ДНК лигазы буфера - 25 мкл
• ДНК-лигазы - 5 мкл

Инкубировать 15 минут при 20 ° C. Адаптеры должны быть на льду талой и разводили 1:20.

13. Лигирование реакции очистки

1. Очистка реакции лигирования использовании гудвижение колонны. Элюции в 44 мкл воды для одной библиотеке и читать 6 мкл EB последовала еще одна элюирования в 5 мкл EB для парных конце библиотеки.

Выполните пищеварения NotI, только за одну библиотеку читать

• кДНК - 44 мкл
• NEB буфер 3 - 5 мкл
• BSA - 0,5 мкл
• NotI - 1 мкл

Выдержите в течение 2 часов в течение ночи при 37 ° С, и очистить реакции с помощью zymo колонке. Элюции с 6 мкл буфера EB последовал второй элюирования с 5 мкл EB.

14. Размер выбора / Гель очистки

Выполните следующие использованием 2% SYBR Безопасный E-гель от Invitrogen.

1. Запуск программы 0-PreRun 2 минуты.
2. Нагрузка 1 КБ плюс лестница из Invitrogen разбавленной 1:4, и нагрузка 10 мкл.
3. Нагрузка всех образцов ДНК, а также заполнить пустые полосы по 10 мкл воды.
4. Запустите программу 1-Эгель 2% Run 28 минут.
5. Размер выберите 200-300 б.п. гель SLICе с свежим лезвием бритвы.

15. Элюции ДНК из геля

1. Взвесьте геля и добавить 3 объема буфера QG до 1 объема геля (используйте гель Добыча комплект от Qiagen)
2. Инкубировать при температуре 50 ° С в течение 10 минут или до геля растворяется.
3. Добавить 1 объем ispropanol, и соединение обращением или пипетки.
4. Добавить в колонке, спина течение 1 минуты при максимальной скорости, и отказаться проточных.
5. Добавить 500 мкл буфера QG к колонке, спина течение 1 минуты при максимальной скорости, и отказаться проходить через.
6. Добавить 750 мкл буфера PE к колонке, спина течение 1 минуты при максимальной скорости, и отказаться проходить через.
7. Центрифуга в течение 1 минуты при максимальной скорости.
8. Элюции в 36 мкл EB для одно чтение и 23 мкл EB для парных конце библиотеки.

16. ПЦР

Для одиночных читать библиотеку:

(Используйте Illumina Чип-Seq образец приготовительный комплект)

1. Подготовка followinг ПЦР реакционную смесь:

• ДНК - 36 мкл
• 5X буфера Phusion - 10 мкл
• дНТФ смеси - 1,5 мкл
• ПЦР праймер 1,1 - 1 мкл
• ПЦР праймер 2,1 - 1 мкл
• Phusion полимераза - 0,5 мкл

Используйте следующие ПЦР протокола:

• 30 секунд при 98 ° C
• 10 циклов:
  • 10 секунд при 98 ° C
  • 30 секунд при 65 ° C
  • 30 секунд при 72 ° C
• 5 минут при 72 ° C
• Держите при температуре 4 ° C

^* Впервые комплект используется, развести PCR праймеры 1:2 с буфером EB.

Для парных конце библиотеки:

(Используйте Illumina парные конце образца приготовительный комплект)

1. Подготовка следующей реакции ПЦР:

• ДНК - 23 мкл
• Phusion ДНК-полимераза - 25 мкл
• ПЦР праймер PE 1.1 - 1 мкл
• ПЦР праймер PE 2.1 -1 мкл

Amplify, используя следующий ПЦР протокола:

1. 30 секунд при 98 ° C
2. 10 циклов:
   • 10 секунд при 98 ° C
   • 30 секунд при 65 ° C
   • 30 секунд при 72 ° C
3. 5 минут при 72 ° C
4. Держите при температуре 4 ° C

^* Впервые комплект используется, развести PCR праймеры 1:2 с буфером EB.

17. Библиотека очистки

1. Очистка библиотеки с помощью zymo столбцов. Элюции в 12 мкл EB

18. Количественного библиотеки

1. Количественного библиотеки с помощью кубита. Он готов для секвенирования. Использование последовательности праймеров от Illumina одного комплекта читать генерации кластеров V4 или выше для одной библиотеки и читать Illumina парные конце генерации кластеров комплект V4 или выше для парных конце библиотеки.

19. Анализ данных

Bowtie ⁶ был использован для мА. П. читает набор RefSeq генов (NCBI Сборка 36,1). Одного конца читает (30 нуклеотидов) и пара конце читает (42 нуклеотидов) были нанесены на карту позволяет до 10 матчей гена множество, и позволяет до двух несоответствия в чтение. Стенограммы на миллион (TPM) значения были получены для измерения экспрессии генов использованием RSEM ⁷ (РНК-Seq ожиданием максимизации).

20. Представитель Результаты: Мы сделали T7LA библиотеках как одиночного, так и парные читать конца длится с 1 мкг, 100 мкг, 10 мкг, 1 мкг и 100 мкг, начиная общую РНК (рис. 1). Для оценки нашего протокола, мы сделали одно чтение и парных конце библиотек без T7 РНК усиление, начиная с 10 мкг общей РНК Эти управляющие библиотеки, называется "MinAmp", обладают минимальным усилением. Только усиление они проходят в 10 циклов ПЦР в конце протокола, чтобы перевязывать Illumina секвенирования адаптеры, шаг, общих для всех библиотек. Все РНК использовали были изолированы от H14эмбриональных стволовых клеток человека ^8.

Сначала мы оценивали число генов, выявленных различными библиотеками (табл. 1 и дополнительного табл. 1). Для обоих одно чтение и парных библиотеки конца, 10 нг T7LA библиотеки определены почти столько же генов, как 10 библиотек MinAmp мкг, с TPM в 10 и более. В случае одной читать библиотек, 10 нг T7LA библиотеке определили 100% от 8500 генов, определенные 10 мкг неусиленных библиотеки. Для парных библиотеки конца, 10 нг T7LA библиотеке определили 86% генов, выявленных 10 мкг неусиленных библиотека (7961 из 9267 генов). Библиотеки из менее 10 нг не смогли определить, как много генов. Например, в одном протоколе читать, 1 нг библиотеки выявлены только ~ 50% генов, определенные библиотеки MinAmp 10 мкг, что заставило нас ограничить низкое количество общей РНК для использования с протоколом T7LA до 10 нг. Кроме того, картирование генов домашнего хозяйства, GAPDH (рис. 2) показывает, что все T7LA библиотеки сделали, по крайней мере 10ng начала РНК определили все экзонов, в том числе крайних 5 'экзонов. Сравнение 10 нг T7LA одно чтение и парных конце библиотеки с библиотеками MinAmp показывает высокую степень сходства (корреляции Спирмена, R = 0,90 и 0,95 соответственно, 3а, б). Мы также сравнили две односпальные читать и парных конце библиотек из 10 нг общей РНК и у них было очень высоким коэффициентом корреляции (R = 0,92), демонстрируя, что оба типа библиотек с использованием протокола T7LA производят очень похожи подпись экспрессии генов ( 3, в.). Таким образом, метод T7LA способна производить секвенирование библиотек, которые являются надежным и всеобъемлющим, как MinAmp библиотек, но с 1000 раз меньше исходного материала.

Рисунок 1 Схема парных и одиночных конца прочитать протокол библиотеки подготовки.

jove_content ">
Рисунок 2 картина генома браузер домашнего хозяйства ген, GAPDH, для всех одно чтение и парных библиотеки конца. Шкалы слева для одной библиотеки читать указывает 350 общего читает. Шкалы в центре для парных библиотек конце 5000 указывается общая говорится в сообщении. Горизонтальная ось представляет геном последовательность GAPDH.

Рисунок 3 Соотношение гена выражения между различными библиотеками (Спирмена). A. С одной читать 10 нг T7LA и 10 мкг MinAmp библиотеки показывает, что обе эти библиотеки имеют очень похожий рисунок экспрессии генов (R = 0,90) B. Между парными конца 10 нг T7LA и 10 мкг MinAmp библиотеки показывает их сходство профилей экспрессии генов (R = 0,95). C. Соотношение гена бывшихвыражений от 10 нг парные конца и 10 нг одной читать библиотек показывают высокую степень сходства между этими библиотеками подготовленных методом T7LA (R = 0,92).

Рисунок 4 Определение эмбриональных стволовых клеток человека конкретных genes5 со всего одно чтение и парных библиотеки конца.

Библиотека	Типа ¯	Сырье Кластеры	Кластеры% прохождение фильтра	% Приведение к геному	Оценить% Погрешность	Гены определены
MinAmp 10ug	Одноместный читать	225 602 + / - 4952	65,48 + / - 2,58	47,61 + / - 0,53	0,62 + / - 0,06	8500
1ug T7LA	Одноместный читать	144 818 + / - 6513	82,21 + / - 6,45	48,09 + / - 0,27	0,42 + / - 0,03	8757
100ng T7LA	Одноместный читать	27 385 + / - 1818	81,33 + / - 11.75	44,46 + / - 4,53	0,49 + / - 0,10	8709
10ng T7LA	Одноместный читать	11 184 + / - 985	60,70 + / - 3,70	14,96 + / - 1,15	0.99 + / - 0,30	8589
1ng T7LA	Одноместный читать	12 695 + / - 1365	53,27 + / - 16,76	4,08 + / - 0,79	2,25 + / - 1,56	4720
100pg T7LA	Одноместный читать	10 390 + / - 1398	72,99 + / - 2,90	1,48 + / - 0,20	1,51 + / - 0,39	1121
MinAmp 10ug	Парные Конец R1	95 786 + / - 12937	90,77 + / - 2,79	58,50 + / - 0,95	0,94 + / - 0,38	9267
	Парные Конец R2	95 786 + / - 12937	90,77 + / - 2,79	58,13 + / - 1,13	0.99 + / - 0.37
1ug T7LA	Парные Конец R1	297 669 + / - 10196	91,35 + / - 0,36	46,89 + / - 0,14	0,47 + / - 0,01	7334
	Парные Конец R2	297 669 + / - 10196	91,35 + / - 0,36	45,52 + / - 0,12	0,51 + / - 0,01
100ng T7LA	Парные Конец R1	205 602 + / - 9932	90,53 + / - 0,76	63,44 + / - 1,00	0,48 + / - 0,02	8011
	Парные Конец R2	205 602 + / - 9932	90,53 + / - 0,76	61,80 + / - 8,09	0,60+ / - 0,36
10ng T7LA	Парные Конец R1	214 622 + / - 11155	89,98 + / - 1,13	56,32 + / - 1,94	0,80 + / - 0,26	7961
	Парные Конец R2	214 622 + / - 11155	89,98 + / - 1,13	46,41 + / - 18,39	2,48 + / - 2,68	;
1ng T7LA	Парные Конец R1	144 951 + / - 19841	90,54 + / - 1,19	3,91 + / - 0,16	8,71 + / - 0,86	8124
	Парные Конец R2	144 951 + / - 19841	90,54 + / - 1,19	3,27 + / - 1,21	9,11 + / - 3,52
100pg T7LA	Парные Конец R1	187 600 + / - 11759	89,52 + / - 1,11	1,78 + / - 0,05	13,42 + / - 0,50	6623
	Парные Конец R2	187 600 + / - 11759	89,52 + / - 1,11	1,99 + / - 0,23	15,29 + / - 0,96

° R1 и R2 прямой и обратной последовательностей теги
* ≥ 10 TPM

Таблица 1. Информация о номера кластеров, гены определены, уровень ошибок, процент выравнивания одной читать и парных библиотеки конца.

Дополнительная Таблица 1. Список всех генов и их значения TPM для всех образцов, один читал и парных конца.

Обсуждение

Действующие протоколы для изготовления парных библиотеки конца требует от 1 до ⁹ мкг до 2,5 мкг ^10, начиная от общего количество РНК. Здесь мы представляем наш линейного усиления T7 основе (T7LA) для подготовки как одиночного, так и парные читать конца Illumina секвенирование библиотек и показать, что этот метод позволяет получать библиотек на уровне 10 нг общей РНК, производя данных, сравнимую с минимально усиливается (MinAmp) библиотеки из 1000 раз больше исходного материала (10 мкг общей РНК). 10 нг библиотеки не только выявить подобный общее число генов, но также производят экспрессии генов подписи, которые подобны (рис. 3а, б). Более того, и одно чтение и парных конце библиотек, полученных методом T7LA очень похожи друг на друга (рис. 3в), что позволяет исследователям сравнить данные, полученные из библиотеки либо протокол. Поскольку эти библиотеки были изготовлены из человеческих эмбриональных стволовых клеток, РНК, мы искалив течение 30 стволовых клеток, специфических генов среди библиотек и обнаружили, что почти все эти гены (93-100%) идентифицируются библиотек из не менее 10 нг начала тотальной РНК (рис. 4), таким образом, проверка нашего протокола. Мы считаем, что наш протокол будет очень полезной для исследователей, особенно в обстоятельствах, таких как поток отсортированных клеток или лазерной микро-расчлененный ткани, где исходным материалом является предельным. В таких условиях наш протокол позволит поколение данных генной экспрессии сопоставимо с библиотеками из гораздо большего количества, начиная со времени нашего протокола производит профили экспрессии сопоставимы по крайней мере, 3 порядков, начиная РНК.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Компания	Kit / Реагенты	Каталог #	Специальные Комментарии
Амбион	Фрагментация реагента	AM8740
Амбион	Liner Акриламид	AM9520
Амбион	MEGAscript T7 Kit	AM1334
Амбион	Номера DEPC лечение нуклеазы свободной воды	AM9932
Fermentas	дНТФ набор	R0181
Fermentas	метилированные дНТФ	R0431	Для Одноместный Прочитано образец приготовительный только
Illumina	TruSeq SR генерации кластеров комплект v5	GD-203-5001	Для Одноместный Прочитано образец приготовительный только
Illumina	TruSeq Seq Kit v5 36 циклов	FC-104-5001
Illumina	Чип Пример Seq Prep Kit	IP-102-1001	Для Одноместный Прочитано образец приготовительный только. Может быть заменен NEB образец ДНК Mix приготовительный Мастер Set 1 Cat # E6040S
Illumina	TruSeq PE генерации кластеров комплект v5	ПЭ-203-5001	Для парных приготовительный образца конца только
Illumina	Парные Конец примера Prep Kit	ПЭ-102-1001	Для парных приготовительный образца конца только
Invitrogen	1 КБ плюс лестница	10787-018
Invitrogen	Кишечная палочка РНКазы Н	18021-014
Invitrogen	РНКазы Out	10777-019
Invitrogen	Второй буфер прядь 5x	10812-014
Invitrogen	Кишечная палочка ДНК-полимеразы	18010-017
Invitrogen	E-гель SYBR безопасной 2%	G521802
Invitrogen	Надстрочный яII (с 5-кратным FS буфера и 0,1 М ДТТ)	18080-085
Invitrogen	Trizol	12183555
Invitrogen	РНК quibit анализа комплект	Q32852
Invitrogen	дц HS кубит анализа комплект	Q32851
Invitrogen	Кишечная палочка ДНК-лигазы	18052-019
Invitrogen	T4 ДНК-полимеразы	18005-025
Invitrogen	Ultra Pure ДНКазы РНКазы воды	10977-015
Invitrogen	Надстрочный II двухцепочечной кДНК комплект синтеза	11917-020
Invitrogen	Случайные Primer (Invitrogen)	48190-011	Для парных приготовительный образца конца только
IDT	Not1Nonamer B грунтовки	N / A	Для Одноместный Прочитано образцовНапример приготовительный только
IDT	Oligo дТ T7	N / A
NEB	Not1 пищеварения комплект	R0189S	Для Одноместный Прочитано образец приготовительный только
Qiagen	Rneasy Minelute комплект	74204
Qiagen	RNEasy Mini Kit (50)	74104
Qiagen	Комплект Гель очистки	28604
Qiagen	ДНКазы набор	79254
Qiagen	Rneasy MinElute комплект	74204
Zymo исследований	ДНК чистой и концентратора (250X)	D4014