Обнаружение и изоляция циркулирующих клеток меланомы использованием Фотоакустическая флоуметрии

Резюме

Мы разработали потока цитометр использованием лазерной индуцированной ультразвук для выявления циркулирующих клеток меланомы, как ранний индикатор метастазов.

Аннотация

Циркулирующих опухолевых клеток (ТХМ) те клетки, которые отделены от макроскопических опухоли и распространяются через кровь и лимфатическую системы, чтобы семя вторичные опухоли ^1,2,3. ЦЛХ являются индикаторами метастазов и их обнаружение в образцах крови может быть использован для диагностики рака и контроля ответа пациента на терапию. С ЦЛХ редки, включающий около опухолевых клеток из миллиардов нормальных клеток крови в прогрессирующих больных раком, их обнаружения и подсчета является сложной задачей. Мы используем наличие пигмента в большинстве клеток меланомы генерировать фотоакустической или лазерной индуцированной ультразвуковых волн в пользовательских цитометр потока для выявления циркулирующих клеток меланомы (ОМЦ) ^4,5. Этот процесс влечет за собой разделение всего образца крови с помощью центрифугирования и получения белого слоя клеток крови. При наличии в цельной крови, СМС будет отделять с белых клеток крови из-за одинаковой плотности. Эти клетки ресуспендировали вфосфатным буферным раствором (PBS) и внедрены в расходомера. Вместо того, чтобы непрерывный поток суспензии клеток крови, мы индуцированных двухфазного потока, чтобы захватить эти клетки для дальнейшего изучения. В двухфазных потоков, двух несмешивающихся жидкостей в микрофлюидных системы встречаются в форме перехода и переменного слизняков жидкого ^6,7. PBS приостановлено белых клеток крови и воздуха слизняков форме мкл, которые последовательно облучении лазерным светом. Добавлением поверхностно-активных веществ в жидкую фазу обеспечивает равномерную образование водяной пробки, и пользователь может создавать различные размеры пули путем изменения расхода два этапа. Слизни воздуха и слизняков ФСБ с белой клетки крови не содержат поглотители свет и, следовательно, не производят фотоакустической волн. Тем не менее, слизняки белых кровяных клеток, которые содержат еще одно СМС поглощать лазерное излучение и производить высококачественные акустические волны частоты. Эти слизняков, которые генерируют фотоакустической волны поглощенного и собрали для цитохимических окрашивание на verification в ОМЦ.

протокол

1. Подготовка Анализ крови

1. Нарисуйте примерно 10 мл цельной крови от больного раком IV стадии на две 5 мл vacutainers.
2. Центрифуги трубы в течение десяти минут при 3000 оборотов в минуту (RPM).
3. Кровь будет разделиться на трех различных слоев: нижний слой состоит из эритроцитов, средний слой, называемый также пальто Баффи, содержит лейкоцитов и клеток меланомы, а верхний слой содержит плазму и тромбоциты. Удалить столько плазмы возможно без нарушения слоя кровяного сгустка.
4. Место 250 мкл Histopaque 1077 в двух трубах 1 мл Wintrobe.
5. Использование 9 "Пипетка Пастера, извлекать оставшиеся плазмы, весь слой кровяного сгустка, и даже верхний слой эритроцитов, убедившись, что для сбора <500 мкл.
6. Место решения на вершине Histopaque слой и центрифуги Wintrobe трубы в 15 мл конические пробирки в течение 10 минут при 3000 оборотах в минуту.
7. Кровь сноваотдельный, но на этот раз эритроциты будут разделены Histopaque, что позволяет легко добычи пальто Баффи. Использование 9 "Пипетка Пастера, чтобы получить весь слой кровяного сгустка и поместить его в трубку 2 мл Эппендорф.
8. Приостановить слой кровяного сгустка в 1,5 мл PBS с 2% об. / Tween 20.

2. Строительство потока палаты

1. Получить акрилового цилиндра 20 мм, внешний диаметр, 17 мм внутреннего диаметра и 8 мм в высоту. Просверлите три отверстия 5 мм диаметр через сторону цилиндра под углом 90 градусов друг от друга. Отрежьте три куска трубы полимера (1,6 мм внутреннего диаметра, 5 мм наружный диаметр), и поместить их в просверленные отверстия.
2. Стретч парафильмом в нижней части акриловых кольцо, чтобы сделать водонепроницаемое уплотнение. Парафильмом формы мелкой миске с акриловым ринг и проведет акриламида решение, которое сформирует проточную камеру.
3. Приостановить диаметром 1,6 мм провод через куска трубы, которые через дорогу отдруг с другом, чтобы убедиться, что провод только виден через середину кольца. Заполните третий кусок трубы с 1,6 мм Диаметр проволоки и положение трубки 1 мм от приостановлено провода. Эти провода предотвратить попадание акриламида труб. После акриламида затвердевает, провода будут извлечены, оставив цилиндрическую пути потока и место для размещения оптического волокна сосредоточен на пути потока.
4. Добавьте 5 мл подготовленной акриламида [20 г акриламида (Sigma Aldrich), 0,7 г bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 мл дистиллированной воды] для небольшой стакан. Отмерьте 0,02 г персульфата аммония (Sigma) и добавить его в стакан. Смешать с мешалкой в ​​течение 3 минут. Добавьте 20 мкл tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) в стакан. Быстро влить смесь в акриловых кольцом, заполняя до самого верха. Через несколько секунд, решение будет гель, делающий формы проточную камеру. Осторожно вытащите провода из, убедившись, что не нарушить акриламида гель. Поток камереBER готов к использованию.

3. Фотоакустическая флоуметрии настройки

1. Акустически пару поливинилиденфторида пьезоэлектрического преобразователя акустическая (Panametrics) на проточную камеру с помощью ультразвука гель непосредственно над потоком путь.
2. Использование байонетного Neill-Concelman (BNC) кабель, подключить датчик к входу широкополосного RITEC приемник-640A (ФНЧ: из, фильтр верхних частот: 1 МГц, вложили сопротивление: 50 Ом, усиление: 35 дБ). Подключите выход фильтра для осциллографа (Tektronix TDS 2024B). Для запуска осциллографа, фотодиод (Thorlabs) установлен возле датчика и подключен к осциллографу использованием BNC кабеля.
3. Т-коннектор (мелкие детали) прилагается к одному из плеч проточную камеру. Два шприцевые насосы (Braintree Научно) связаны с другими отраслями разъем. Один шприц содержит воздух, в то время как другой будет содержать суспензию клеток подготовлен в части 1. Установить расход на100 мкл / мин.
4. Извлечение небольших трубок проточную камеру, пока маленький карман воздуха формы и вставить 1 мм диаметр сердцевины оптического волокна с числовой апертурой 0,37 в этом слоте. Заполните карман с водой, чтобы уменьшить сигналов интерфейса и увеличения количества света лазера применяется к потоку пути. В связи с числовой апертуры оптического волокна и небольшое расстояние от потока пути, лазерное облучение будет только одна пуля образца в любой момент времени, гарантируя, что образец непосредственно перед лазерным же образца создания фотоакустической сигналов. Лазерная энергия должна быть примерно 28 мДж / см ² с пятном размером 7 мм ^2.
5. Выключите обе шприцевые насосы далее. При двух несмешивающихся жидкостей достигает Т-образного перекрестка, они будут разделены на однородные слизняки и обтекания датчика.
6. Радиация течет образца с наносекундного импульсного лазера для генерации волн в ФА клеток меланомы. Как меланин broadbи оптических поглотитель, видимые длины волны лазера могут быть использованы.
7. Если появляется сигнал на экране осциллографа, когда пуля находится на вершине датчика, пули содержит меланомы, и должны быть отслежены с помощью системы до падения в коллекции флаконе.

4. Иммуноцитохимическая

1. Возьмите захватили слизняков, чтобы цитоспина 4 Центрифуга (Thermo Scientific), с тем чтобы исправить их в стеклах. Место стеклах в Cytofunnels (Шандон EZ Одноместный Cytofunnel с Брауном фильтра карты Thermo Scientific) и загружать их в цитоспина 4 центрифуги. Положите 100 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) в PBS в каждую воронку, а затем центрифуги в 600 оборотов в минуту в течение 3 минут, чтобы помочь захватили клетки придерживаться стеклах.
2. После центрифугирования, добавить ячейки образцов Cytofunnels а затем центрифуги в 600 оборотов в минуту в течение 3 минут. Затем спрей слайды с этанолом основан фиксатором.
3. Вымойте слайдов в PBS в течение 10 минут два раза.
Для блокирования неспецифического связывания, инкубировать каждого слайда с смеси 10 мкл сыворотки козьего (Sigma) и 90 мкл PBS в течение 1 часа при комнатной температуре.
4. После инкубации, переливать слайды и инкубировать с первичным решением антител в течение 1 часа во влажной камере при комнатной температуре. Каждый слайд должен содержать 1% MART-1 антителами, поднятых в кролика, 1% CD-45 антител, поднятые в мыши, 10% сыворотки козьего, и 89% PBS.
5. После инкубации, мыть слайдов в PBS в течение 10 минут три раза.
6. Слайды затем инкубируют в средней решение антитела, которые флуорофор связан с антителами. Смесь, содержащая 0,05% козий анти-антител кролика, 0,05% козьего анти-мышиного антитела, 0,1% сыворотки козьего, и 99% PBS. Слайды инкубируют в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре.
7. После инкубации переливать слайды мыться в PBS в течение 5 минут три раза.
8. Для окрашивания ядра, инкубировать клетки с 0,1 мкг / мл DAPI (Invitrogen) для1 минута. Затем перелить слайды и мыться в PBS.
9. Горы покровное по ячейке образца с помощью 20 мкл на основе синтетических смол монтажа СМИ на слайд. Печать покровное прозрачным лаком ногтей, чтобы сохранить слайд. Теперь слайды готовы для включения в образ с флуоресцентным микроскопом.

5. Представитель Результаты:

Рисунок 1. Фотоакустической сигналов от лейкоцитов и клеток меланомы показаны здесь. Белые кровяные клетки, не имея присущей пигментацию, не производят фотоакустической волн и проявляется в виде плоской линии электронного шума (слева). Пигментных клеток меланомы производит надежные фотоакустической волны (справа).

Рисунок 2. Иммуноцитохимического После окрашивания, культивируемых клеток меланомы показать DAPI сигналов в блу.е. в то время как MART1 подсвечивается зеленым цветом.

Рисунок 3. Наложение изображений для DAPI и MART1, как показано на рисунке 2, CD45 как показатель лейкоцитов, эта цифра показывает, клетки меланомы среди нескольких белых кровяных клеток.

Обсуждение

Обнаружение ЦЛХ еще наукоемких поле с очень мало клинического применения в связи с трудной проблемой выделения редких опухолевых клеток. Многие другие методы, для которого определяется СТС обнаружения, в том числе RT-PCR, микрофлюидных захвата клетки, иммуномагнитный захвата, а также другие методы ^8-12. Тем не менее, ФА обнаружение показывает ОМЦ обещание, как это метки, свободное и обеспечивает быстрое и точное средство для захвата маленький, легкий поглощающих частиц.

Протокол, описанный изолировать белых кровяных клеток имеет высокую эффективность, но низкое число красных кровяных клеток существует в образце. Эти румяна загрязняющих клетки также поглощают лазерное излучение, но в значительно снизился уровень. Для обеспечения красные кровяные клетки не вмешиваются в наши системы обнаружения меланомы, пять нормальных анализов пациента были введены через систему, и ни один дал сигнал, указывая, что красные кровяные клетки присутствуют при достаточно низких концентрацияхможно пренебречь.

Серия концентрации исследования были проведены с использованием культуры клеток меланомы и фотоакустической поток в системе оказалось чувствительным до 1 кл / мкл (неопубликованные данные). Эти исследования при переходе и в ближайшее время включают испытания на образцах раковых больных.

Это фотоакустической техника также оценивается для использования в непигментированной ТХМ, таких как рак молочной железы и рака предстательной железы путем присоединения экзогенных хромофоров. Мы провели предварительные работы с использованием наночастиц золота на рак cells13. Эти испытания показали, что наночастицы могут предоставить необходимые оптического поглощения для получения ФА волн. Остальные технические задачей является приложить таких частиц к раковым клеткам выборочно.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
DMEM	Invitrogen	ABCD1234