Chromosomics: Определение численного и структурные изменения во всех 24 хромосом человека одновременно, используя Роман OctoChrome Анализ FISH

Резюме

Роман флуоресценции На месте Гибридизации (FISH), который одновременно рассматривается как численные и структурные изменения хромосом, в частности, специфической хромосомной транслокации связанных с лейкемией и лимфомой, из всех 24 хромосом человека на одном устройстве в одной гибридизации, описан.

Аннотация

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei¹. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis². Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene^3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis.

Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application⁷. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)⁸. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)⁹. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously.

OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers^8,10.

протокол

1. Подготовка образцов слайдов

• OctoChrome FISH предназначен для изучения изменений хромосом в метафазе распространяется клеток человека, в том числе, но не ограничиваясь культурно клеток периферической крови, стволовых / прогениторных клеток и клеточных линиях. Образцы должны быть подготовлены следующие стандартные процедуры для уборки метафаз ^3,11-13: за счет использования колцемид лечения арест клеток в метафазе, гипотонической обработки клеток набухать, и Карнуа фиксатор, чтобы исправить клеток в суспензии примерно в 0,5-1 х 10 ⁶ клеток на мл.
• Очистите 8 квадратных слайде (при условии, в OctoChrome Kit, Catalogue #: PMP 803, Cytocell Ltd, Кембридж, Великобритания, 2) путем погружения в чистом этаноле в течение 2 мин.
• Перед образца слайдов, поместите небольшое количество клеток на слайд, чтобы проверить плотность клеток. Если плотность клеток слишком высок (слишком много перекрывающихся ячеек), разбавленные суспензии свежей фиксатором. Если плотность клеток является слишком низкой (слишком мало клеткис на слайде), спином вниз клетки и вновь приостановить меньший объем свежего фиксатора. Внесите 5-10 мкл клеточной суспензии на каждом из 8 районов шаблон слайда в последовательности чередующихся квадратов 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. После первых двух квадратов имеет воздушно-сухой, определить оставшиеся площади в том же порядке. Это позволит предотвратить клетке передается от мешая друг другу.
• Высушенные слайд можно хранить при температуре -20 ° С в атмосфере азота в течение более 5 лет, прежде чем гибридизации.

2. Локализация метафаз использованием автоматизированной системы

• Применение 20 мкл 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (0,2 мкг / мл) в центре каждой половине слайда, а затем накрыть покровным стеклом.
• Выполнять автоматизированное сканирование образцов слайдов локализовать метафазных клеток с использованием программного обеспечения Metafer (метасистемы, Altlussheim, Германия). Это облегчает расположение всех метафаз и будущие переоценки всех клеточных изображений.
• Просмотр результатов сканирования вручную и удалять без метафазы артефактов.

3. Гибридизация

1. Подготовка слайд образца и устройство OctoChrome
• Опустите образец слайда в буфер 2x SSC при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы смыть DAPI.
• Высушить образца слайдов с помощью ряда этанола мойки (2 минуты в 70%, 85% и 100% этилового спирта), дать высохнуть и поместить на 37 ° С плиты на 5 минут.
• Поместите гибридизации Chromoprobe Multiprobe палаты (при условии, в OctoChrome Kit) при 37 ° С на водяной бане и дать, чтобы уравновесить до 37 ° C (+ / - 1 ° C).
• Смешать гибридизации решение (если в OctoChrome Kit) повторными пипетирования и предварительно теплой 25 мкл в OctoChrome устройства до 37 ° C.
• Предварительно каждый теплый OctoChrome устройства (при условии, в OctoChrome Kit, см. рисунок 2) до 37 ° C, поместив стороны устройства этикеткой вверх на плите. Не прикасайтесь тОн тиснением поверхности OctoChrome устройства, поскольку они содержат зондов.
2. Позиционирование образца слайдов на OctoChrome устройство (рис. 2)
• Добавить 2 мкл предварительно нагретой гибридизации решение каждой из восьми областей на предварительно нагретой OctoChrome устройство, пока оно остается при 37 ° C.
• Аккуратно перевернуть шаблон скользят по OctoChrome устройства, такие, что число 1, который в настоящее время с ног на голову, находится в верхней правой рукой область устройства OctoChrome. Чтобы найти площадь 1, свою позицию по устройству был отмечен в Orange.
• Убедитесь, что шаблон слайда тщательно согласованы с соответствующими области на OctoChrome устройства. Осторожно опустите скользят по OctoChrome устройство так, чтобы капли гибридизации решение вступить в контакт с горкой. Применить нежный, даже давление для того, чтобы гибридизация решение распространяется на краю каждой из областей подняли на OctoChrome устройства.
• Подниматьслайд / OctoChrome, тщательно проведения замороженный конец стекло, и инвертировать, чтобы слайд под OctoChrome устройства. Убедитесь, что устройство не мазка через шаблон слайда, так как это может привести к перекрестного загрязнения проб.
• Место на 37 ° C (+ / - 1 ° С) плиты на 10 минут.
3. Денатурация
• Передача устройства образца слайдов / OctoChrome к плите с особой тщательностью, чтобы держать его уровня. Убедитесь, что образец слайдов равномерно контакты плиту.
• Денатурировать на плите при температуре 75 ° C (+ / - 1 ° C) в течение 5 минут.
4. Гибридизация
• Место слайд образца / OctoChrome устройства в гибридизации палаты Multiprobe Chromoprobe.
• Замените крышку и плавать камеры в 37 ° C (+ / - 1 ° C) водяной бане (не - перемешивания) в течение ночи. Пожалуйста, обратите внимание: НЕ уплотнения крышки на камеру гибридизации; НЕ запечатать крышкой на водяной бане, не гибридизуются винкубатора. Эти меры имеют важное значение для контроля влажности.
5. После гибридизации мойки
• Приготовление раствора мытья
  Решение 1: Подготовка Коплин / Hellendahl сосуд 0.4x SSC. Равновесие до 72 ° C (+ / - 1 ° C) на водяной бане и регулирования рН до 7,0.
  Решение 2: Подготовка Коплин / Hellendahl сосуд 2x SSC и 0,05% Tween 20. Дать постоять при комнатной температуре.
• Удалить OctoChrome устройство тщательно от слайдов и поместить слайд в раствор 1 на 2 минуты.
• Поместите в слайде Решение 2 в течение 30 секунд.

4. Монтаж и визуализации результатов

• Применение 20 мкл DAPI в центре каждой половине слайда и применить покровным.
• Инкубировать в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре перед просмотром с помощью флуоресцентной микроскопии.

5. Представитель Результаты

ФигуRe 3A показывает нормальную клетку метафазе на площади 2. (1) - (3): хромосомы 8, 21 и 12 были окрашены в красный цвет, зеленый и синий, и визуализируются через Texas Red, FITC, и DEAC фильтр, соответственно, (4): визуализация с помощью DAPI / FITC / Texas Red тройной фильтр. В целом, хромосомах окрашена синим цветом, не ясно, через тройной фильтр и должны рассматриваться в соответствии с конкретными фильтр DEAC.

Рисунок 3Б показывает, представитель аномальных клеток с лейкемией конкретной хромосомной транслокации и анеуплоидии. (1): т (8, 21), распространенных хромосомных транслокаций в острой миелоидной лейкемией (2): трисомии 21, три копии хромосомы 21, общей анеуплоидии при лейкозах.

Рисунок 1. Расположение хромосом комбинации на OctoChrome устройства и ожидаемые результаты хромосомных живописи.

Рисунок 2. Позиционирования образца слайдов на OctoChrome устройства.

Рисунок 3. Представитель результатыполучены из OctoChrome FISH (площадь 2).

3А. Нормальной клетки с хромосомами 8, 12, 21 окрашены в площади 2.

Рисунок 3B. Представитель аномальных клеток с лейкемией конкретной хромосомной транслокации и анеуплоидия на площади 2.

Обсуждение

Этот роман OctoChrome-FISH анализ позволяет одновременно изучить все 24 хромосом человека в одной гибридизации на одном слайде. Расположение хромосом комбинации на 8 квадратов был разработан, чтобы облегчить идентификацию неслучайных хромосомных перестроек в наиболее распространенных лейк?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (опционально)
OctoChrome Kit	Cytocell Ltd, Кембридж, Великобритания	PMP 803
фитогемагглютинин (PHA)	Invitrogen корпорации	10576-015
Колцемид	Invitrogen корпорации	15212-012
Карнуа фиксатором			Метанол: ледяной уксусной кислоты = 3: 1
Флуоресценции мильcroscope			Оснащен фильтры для просмотра DAPI, Texas Red, FITC, и кумарин спектра индивидуально и DAPI / FITC / Texas Red тройной фильтр для просмотра различных цветов одновременно
Metafer программного обеспечения	Метасистемы, Altlussheim, Германия		Содействовать, чтобы найти все метафаз и пересмотреть нарушения