Обнаружение микроРНК в опухолях простаты количественного ПЦР в реальном времени (КПЦР)

Резюме

Количественные реального времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) представляет собой быстрый и чувствительный метод для исследования уровня экспрессии различных микроРНК (миРНК) молекул в опухолевых образцах. Используя этот метод выражения сотен различных молекул микроРНК может быть усилен, количественно и проанализированы с той же кДНК шаблона.

Аннотация

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18–24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development¹, apoptosis², and cell cycle regulation³. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes⁴ by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)⁵. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes⁶. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.

Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies⁷. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis⁸.

Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences.

The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

протокол

1. Простата сбора проб

1. Сбор образцов простаты во время простатэктомии. Образец располагается с анатомическим ориентирам. Предстательная железа и семенные пузырьки окрашены следующим образом: правый зеленый сторону, левую сторону синего.
2. Случайные поперечные средней части простаты берется перпендикулярно поверхности ректальные, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C ^9.
3. Накопленные кусочки образцы фотокопий, ориентированный (передний, задний, правый и левый), разделенный на четыре части. Разделы сократить помощью криостата.
4. Разделы окрашивали H & E и рассмотрены патологоанатомом, чтобы определить и разграничить опухоли по сравнению с нормальной области на окрашенных слайды и соответствующие изображения. Отмеченные области используются в качестве ориентира для обозначения районов, из которых, чтобы извлечь опухоль ткани, из которой РНК будет добываться на последующих этапах.

сломать ">

2. Изоляция Всего РНК, в том числе микроРНК, из образцов

1. Место замороженных образцов простаты на сухом льду и со ссылкой на очерченные ксерокопию, вырезать небольшую часть опухоли предстательной железы (от 50 до 100 мг).
2. Однородный ткани опухоли простаты в 1 мл TRIzol реагентов. Величины в следующих шагов основан на использовании 1 мл TRIzol реагентов.

Примечание: Здесь мы использовали TRIzol реагент для извлечения РНК, однако другие наборы, которые изолируют небольшой РНК-содержащих общую РНК также может быть использован.

3. Инкубируйте усредненного образца в течение 5 минут при комнатной температуре.
4. Добавить 0,2 мл хлороформа образцов и энергично встряхивают в течение 15 секунд. Инкубируйте образцы в течение 3 минут при комнатной температуре, а затем центрифуги при 12000 х г в течение 15 минут при 4 ° C.
5. Передача бесцветной верхней водной фазы на свежий трубы, и добавить 0,5 мл изопропилового спирта.Инкубируйте образцы в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифуги при 12000 х г в течение 10 минут при 4 ° C.
6. Тщательно аспирации супернатант, не нарушая гранул содержащих РНК. Вымойте РНК гранул с 1 мл 75% этанола. Vortex образца и повторно осадка центрифугированием в течение 5 минут при 7500 х г при 4 ° C.
7. Тщательно аспирации супернатант и сухие гранулы РНК в течение 5-10 минут, убедившись, что РНК гранул не полностью сухой. Повторно растворяются в нуклеазы воды без соответствующего размера гранул. Измерение концентрации РНК с использованием спектрофотометра NanoDrop 1000 (мера поглощения при 260 нм и 280 нм).
8. Проверка качества и целостности образцов РНК с использованием Agilent биоанализаторе.

3. Обратной транскрипции РНК

1. Обратной транскрипции РНК проводили с использованием miScript обратной транскрипции набора в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen). В комплект входятобратной транскриптазы и поли (А)-полимеразы. Буфер miScript РТ включает в себя Mg ^{2 +,} дНТФ, олиго-дТ грунтовки, и случайных праймеров.
2. Используйте от 10 мкг и 1 мкг РНК для синтеза кДНК. При использовании более 1 мкг РНК, расширения реакции линейно соответствующего объема.
3. Подготовка мастер смесь, которая содержит 5X miScript РТ буфера (4 мкл), miScript обратной транскрипции Mix (1 мкл) и РНКазы без воды принести реакции на конечном объеме 20 мкл. Кроме того, включать шаблоны РНК (до 1 мкг) в мастер-микс.
4. Инкубируйте образцы в течение 60 минут при 37 ° С и сразу же за инкубации в течение 5 минут при 95 ° C. Этот шаг может быть выполнен в машине ПЦР, нагревая блок, или водяной бане. Thermocyclers являются наиболее подходящими и точный метод. Хранить кДНК на льду на короткий срок, и -20 ° C для длительного хранения.

4. Создание калибровочной кривой

1. До экспериментаiment с целевой микроРНК, стандартной кривой создается с помощью кДНК известных концентраций от их пропускные пункты (КП) (рис. 2).
2. Приготовьте серию разведений в 2 раза, в 10 раз, 50 раз, 250 раз, и 1250 раз оригинальной кДНК пример, как известно, оказывают существенное выражение вашего гена.
3. Запуск ПЦР как указано в разделе 5 "ПЦР в реальном времени для обнаружения микроРНК», с поправкой, что кДНК в серийных разведениях не статические 40x разведения.
4. Выполнить анализ с использованием программного обеспечения RelQuant (Roche) для создания своих стандартной кривой.

Примечание: новый стандарт кривой должны быть созданы для каждого гена.

5. ПЦР в реальном времени для обнаружения микроРНК

1. ПЦР в реальном времени для микро-РНК проводили с использованием miScript SYBR Green PCR Kit и miScript Primer Анализ в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen). Подготовка мастер смесь, содержащая2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Универсальная грунтовка, 10x miScript Анализ Primer и РНКазы без воды. Подготовка мастер микс для 20 мкл реакционного объема.
2. Грунтовка Анализ специфичные для микроРНК интерес. Чтобы восстановить 10x Анализ Primer miScript, центрифуги флакон кратко и добавьте 550 мкл ТЕ буфера, рН 8,0. Vortex флакон кратко перемешать, аликвоты праймеров для меньших объемах, и хранить при температуре -20 ° C. Два праймера требуется. Праймеры для гена-мишени и ссылки ген RNU6B является usedas ссылкой ген.
3. Развести кДНК 40x и хранить дополнительные порции при температуре -20 ° C.
4. кДНК служит в качестве шаблона для ПЦР. Используйте 2 мкл 40x разбавленных кДНК и обойтись в 20 мкл свет циклер капилляров (Roche).
5. Добавить 18 мкл мастер микс каждый капилляр, и центрифуги использованием капиллярной адаптера.
6. Поместите капилляров в капиллярных основе в режиме реального времени циклер, таких как LightCycler 3.5 Real-Time PCR System с 32-капиллярной карусель формате.
7. Запустите программу ПЦР велосипедные следующим образом:
   Для активации HotStarTaq полимераза, которая находится в 2х QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, предварительно инкубировать при температуре 95 ° С в течение 15 минут.
   Вслед за 50 циклов:
   Денатурация, 15 сек, 94 ° C;
   Отжиг, 30 сек, 55 ° C;
   Расширение, 30 сек, 70 ° C.
8. Выберите образец быть калибратор, и установить его нормированное количество цель 1. Сравните относительно выражения микроРНК во всех остальных образцов в калибратор.

Примечание: В рамках исследования, те же калибровки образец должен быть использован для обеспечения согласованности результатов.

6. Анализ данных

1. Усиление кривые для реакции ПЦР изображены графически и численно методом молекулярно LightCycler Biochemicals программное обеспечение версии 3.5 (Roche). Количественная реакции в "Количественное" на вкладке,го экспорта данных в текстовый файл.
2. Импорт данных в RelQuant программного обеспечения для анализа (Roche) для получения количественных результатов. Импорт отдельных файлов для целевой ген, ген ссылки и стандартные данные кривой.
3. Укажите положение калибратор для целевой и ссылки ген. Также укажите позиций образцов. Данные в виде целевой ссылаться на соотношение различных образцов, деленное на цель ссылкой отношение калибратора. Калибровочной кривой ранее созданный для конкретной микроРНК и домашнее хозяйство гена используется как эталон для экстраполяции количественных данных для целей микроРНК неизвестной концентрации.
4. Три повторяет образцы анализируются в группе и средние концентрации и стандартных отклонений от трех экземплярах рассчитывается. Если один из triplicates не согласуется с остальной частью набора, то он будет исключен программы.

7. Представитель Результаты

<с классом = "jove_content"> Пример КПЦР анализ образцов простаты показано на рисунке 3. Результаты показаны численно, так и в графическом виде. Графики, показывающие уровни экспрессии генов ссылки, U6, начинают экспоненциальное около цикл 20, в то время как экспрессия гена-мишени, Мир-98, показали, задерживается примерно на усиление цикла 25. Данные, полученные в этом эксперименте был экспортирован в текстовый файл и анализируются RelQuant программного обеспечения для анализа. Позиции капилляров содержащих калибратор и образцы указываются. 4 показано, как калибратор устанавливается равным 1, и выражение других образцов по сравнению с калибратора.

Рисунок 1. Различные шаги в miScript обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени.

Рисунок 2. Стандартной кривой создается с помощью серии разведений в 2 раза, в 10 раз, 50 раз, 250 раз, и 1250 раз оригинальной кДНК образца.

Рисунок 3. Рош молекулярной LightCycler Biochemicals программное обеспечение показывает всю информацию эксперимента графически, так и в текстовом режиме. Количественные реальном времени ПЦР-амплификации участков указывают на увеличение флуоресценции из разных образцов.

Рисунок 4. Данные были количественно, используя программное обеспечение для анализа RelQuant LightCycler. Как правило, три повторяет образцы анализируются в группе и образцы, которые производят результаты явно не исключены и средней концентрации и стандартных отклонений от трех экземплярах рассчитывается.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Аномальные проявления некоторых микроРНК были последовательно найдены в опухоли простаты по сравнению с нормальной тканью ^10, и некоторые из этих микроРНК были названы как потенциальные новые терапевтические средства против рака простаты ^11. Таким образом, аномальным уров?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
TRIzol реагентов	Invitrogen	15596
miScript обратной транскрипции Kit	Qiagen	218061
miScript Анализы Primer	Qiagen	Эксперимент конкретных
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	218073
LightCycler 3,5 Real-Time PCR System	Roche
Свет Cycler Капилляры	Roche	04929292001
NanoDrop 1000 спектрофотометр	Thermo Scientific	2538
Agilent 2100 биоанализаторе	G2943CA