Солюбилизации и Био-сопряжения квантовых точек и бактериальные анализы токсичности по кривой роста и плиты графа

Резюме

Наночастицы, таких как полупроводниковые квантовые точки (КТ), могут быть использованы для создания фотоактивируемых агентов антимикробные или анти-рак приложений. Этот метод показывает, как с водой растворить теллурида кадмия (CdTe) КТ, сопряженные им антибиотики, а также выполнять бактериального ингибирования основе кривых роста и пластины кол.

Аннотация

Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanoparticles with size-dependent emission spectra that can be excited by a broad choice of wavelengths. QDs have attracted a lot of interest for imaging, diagnostics, and therapy due to their bright, stable fluorescence^{1,2 3,4,5}. QDs can be conjugated to a variety of bio-active molecules for binding to bacteria and mammalian cells⁶.

QDs are also being widely investigated as cytotoxic agents for targeted killing of bacteria. The emergence of multiply-resistant bacterial strains is rapidly becoming a public health crisis, particularly in the case of Gram negative pathogens ⁷. Because of the well-known antimicrobial effect of certain nanomaterials, especially Ag, there are hundreds of studies examining the toxicity of nanoparticles to bacteria ⁸. Bacterial studies have been performed with other types of semiconductor nanoparticles as well, especially TiO₂ ^9,10-11, but also ZnO¹² and others including CuO ¹³. Some comparisons of bacterial strains have been performed in these studies, usually comparing a Gram negative strain with a Gram positive. With all of these particles, mechanisms of toxicity are attributed to oxidation: either the photogeneration of reactive oxygen species (ROS) by the particles or the direct release of metal ions that can cause oxidative toxicity. Even with these materials, results of different studies vary greatly. In some studies the Gram positive test strain is reportedly more sensitive than the Gram negative ¹⁰; in others it is the opposite ¹⁴. These studies have been well reviewed ¹⁵.

In all nanoparticle studies, particle composition, size, surface chemistry, sample aging/breakdown, and wavelength, power, and duration of light exposure can all dramatically affect the results. In addition, synthesis byproducts and solvents must be considered^{16 17}. High-throughput screening techniques are needed to be able to develop effective new nanomedicine agents.

CdTe QDs have anti-microbial effects alone¹⁸ or in combination with antibiotics. In a previous study, we showed that coupling of antibiotics to CdTe can increase toxicity to bacteria but decrease toxicity to mammalian cells, due to decreased production of reactive oxygen species from the conjugates¹⁹. Although it is unlikely that cadmium-containing compounds will be approved for use in humans, such preparations could be used for disinfection of surfaces or sterilization of water.

In this protocol, we give a straightforward approach to solubilizing CdTe QDs with mercaptopropionic acid (MPA). The QDs are ready to use within an hour. We then demonstrate coupling to an antimicrobial agent.

The second part of the protocol demonstrates a 96-well bacterial inhibition assay using the conjugated and unconjugated QDs. The optical density is read over many hours, permitting the effects of QD addition and light exposure to be evaluated immediately as well as after a recovery period. We also illustrate a colony count for quantifying bacterial survival.

протокол

1. КТ Солюбилизация

Этот метод подходит для CdTe. Подобные методы могут быть использованы и другие типы квантовых точек, таких как InP / ZnS ²⁰ и CdSe / ZnS ^21.

1. Приготовьте раствор CdTe квантовых точек в толуоле при 15 мкм (оптическая плотность = 2,5 в первом экситонного пика).
2. Передача 200 мкл этой акции в стеклянный флакон. Не используйте пластиковые!
3. Добавить 800 мкл толуол, 1 мл 200 мМ боратного буфера (рН 9) и 2 мкл 11,5 M меркаптопропионовой кислоты (MPA).
4. Закройте флакон и энергично встряхните его в течение 30-60 секунд.
5. Водных и органических растворителей фазы будет отделить спонтанно. Водная фаза станет цвет КТ. Чтобы избежать толуол слой, удалите его и отбросить его. Затем перенесите в водную фазу в чистый флакон.
6. Очисти растворяются КТ промывкой / фильтрации в четыре раза использовании 500 мкл, 10000 молекулярная масса отсечки центрифугу фильтром. Фильтры должны бытьнити при 3000 мкг в течение 13 минут. По крайней мере, последние два моет, промыть желаемого буфера.
7. После последней промывки, приостановить промытый КТ в 50 мМ буфере бората в нужной рН и хранить при 4 ° C. Они будут стабильными в течение 1-2 недель.
8. Измерение поглощения и спектры излучения для оценки концентрации основан на опубликованной формулы ^22.

Представитель результаты: На рисунке 1 показаны изображения КТ CdTe под действием УФ-лампа подсветки, а также спектры излучения до и после растворения воды, показав незначительное изменение с крышкой обмена. Размер значения диаметра сердцевины измеряется с помощью электронного микроскопа.

2. КТ сопряжения с антибиотиком

Эта часть протокола применима к любой отрицательно заряженные воде растворенного наночастиц, в том числе большинство коммерческих КТ, металлические частицы и т.д. ^19.

1. Любая молекула будет работать, что eithэ самостоятельно собирает в отрицательно заряженные растворяются КТ, или что есть реактивная группа, которая может быть сопряжена, например, первичные амины. В этом примере мы используем полимиксина (PMB), которая заряжена положительно и самостоятельно собирает без необходимости сопряжения реагентов. Растворите PMB в H ₂ O при 60 мкМ. (Если выбранный антибиотик не растворяется в H ₂ O, растворяется в ДМСО или этанол в концентрации 0,1-1 мм). Это будет 10-кратным решения (в H ₂ O) или 100x раствора (растворителя).
2. Посчитайте, сколько КТ решение необходимо для бактериальной экспериментов токсичности. Для 96-луночный планшет с 0,3 мл на лунку в quadruplicates, 0,5 мл 200 нМ сопряженных необходимо. Приготовьте два пробирки, содержащие по 100 мкл 1 мкМ квантовых точек в 50 мМ буфере бората.
3. Если связь с первичным амином, подготовить 19 мг / мл (100 ммоль) раствора 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимида гидрохлорид (EDC) в H ₂ O. EDC в решение не является устойчивым, Немедленно использовать и выбросить остальное же.
4. Добавить 50 мкл 10x раствор антибиотика (в H ₂ O) или 5 мкл 100x решения (в растворителе) сопряженной трубы. Для PMB: CdTe сопряжения в молярном соотношении 30:1, добавить 50 мкл 60 мкМ PMB. Добавить H ₂ O или растворителем для КТ только трубки контроля.
5. Если необходимо, добавьте 1 мл раствора EDC акции сопряженных трубку.
6. Вызовите сопряженных объем до 0,5 мл соответствующего буфера (боратный буфер или PBS, не содержащие амины, такие как буфер Трис, как они будут препятствовать EDC).
7. Щит труб от света алюминиевой фольгой, и место на nutator или рокер в течение 1 часа. Если агрегация происходит, повторите сопряжение с более низкими концентрациями антибиотика. Титруйте концентрация вверх, пока частиц не агрегат.
8. Вымойте конъюгатов, проходя через соответствующий фильтр. 10000 молекулярный вес отсечка работает для большинства антибиотиков, но не для белков или антител.
9. В зависимости от молекулы, различные методы могут быть использованы для оценки количества антибиотиков молекул в КТ: поглощение или флуоресцентной спектроскопии, гель-электрофорез, или преобразование Фурье ИК-спектроскопии (ИК).

Представитель результаты. В этом примере PMB сопряжения характеризуется изменениями в КТ спектра излучения. На рисунке 2 показаны спектры CdTe КТ с PMB дополнение.

3. Подготовка бактерий в течение 96-и экрана, определения антибиотиков IC ₅₀

Это относится практически к любой штамм бактерий, выращенных в соответствующей среде ^18. Точная продолжительность записи следует продолжать зависит от бактериального роста. В нашем примере мы используем кишечной палочки, выращенные в лизогении бульон (LB) среды.

1. Для того, чтобы выбрать подходящий КТ концентрации сопряжены, важно знатьIC ₅₀ антибиотик быть сопряжены и, если КТ сами по себе токсичны. Это должно быть начато за 2 дня до сопряжения эксперимента. Вечером, семян 10 мл бактериальной питательной среде из свежих колонии, используя правильный стерильные и биологической техники.
2. На следующий день за 1-2 часа до эксперимента, заполнить каждую из скважин ясно дно 96-луночного планшета с почти-максимальное количество питательной среде. Используя многоканальную пипетку, семян в каждую лунку с 1-50 мкл бактериальной культуры (концентрация будет зависеть от того, как быстро конкретный штамм растет и нужно будет калибровать вашей лаборатории).
3. Поместите пластину на ридер и установить его для чтения каждые 10 минут в течение 2 часов при определенной длине волны (обычно 600 нм). Следить за тарелку так, чтобы бактерии не растут слишком плотно слишком быстро.
4. Когда клетки все достижения OD = 0,1-0,15, удалить пластину из ридер и остановить запись.
5. Добавить наркотиков в одиночку и только в КТразличной концентрации, по крайней мере triplicates. Используйте одну сторону пластинки, как "темный" контроль и половина для освещения. Предлагаемая схема приведена на рис 3. Концентрация должна охватить достаточно широкий диапазон включить один концентрации, подавляет бактерии, очень мало, и тот, который убивает их всех.
6. Щит "темной" стороне пластины с алюминиевой фольгой. Вынести другой стороны, чтобы лампа на нужную длину волны. Мы используем пользовательский 96-а, 440-нм лампы из светодиодов 2,4 мВт (рис. 4) и облучают в течение 30-60 мин. Черные пластины с четко днища помочь защитить неэкспонированные бактерий из рассеянного света. Пустая колонка также может быть использована между экспозицией и ООН, подвергшихся воздействию сторон.
7. После того, как освещенность, поставил пластинку в планшетов и запись OD 600 каждые 10 минут на 5-12 часов в зависимости от темпов роста. Держите температура <32 ° C, если возможно, чтобы избежать высыхания культур.
8. Постройте кривые ростав выбранной точке времени по сравнению журнал [концентрации] и определения IC ₅₀ антибиотиков с помощью уравнения Hill:

где Н-коэффициент Хилла, у _макс является самой высокой точкой роста (в идеале на плато), и у _мин является нулевым, и в идеале на плато. Маловероятно, что КТ только покажет гораздо токсичности для клеток в используемых концентрациях, поэтому значение не будет определено.

Представитель результаты. В конце периода записи, ясно скважин показывают полную гибель клеток, и градиент плотности клеток должны появиться по повышению концентрации препарата. Бактерии должны показать S-образный рост кривых (рис. 5), положение максимума плато будут существенно отличаться от штамма к штамму, а также зависит от температуры. Данный момент времени может бытьвыбрана в качестве представителя и значения нанесены против Вход [антибиотик], чтобы дать IC ₅₀ (рис. 5 б). Для оценки токсичности КТ, выживание против Вход [QD] также могут быть построены, но достижение значительных бактериальных убийства с КТ только редко (рис. 5 С).

4. Подготовка бактерий в течение 96-и экран с антибиотиками / КТ

1. За день до эксперимента, семян 10 мл культуры с новой колонии в соответствующие богатой среде, используя правильный стерильные и биологической техники. QD-антибиотик сопряженных должны быть готовы в этот день, если это крайне нестабильной.
2. 1-2 часа до начала эксперимента, заполнить каждую из скважин ясно дно 96-луночного планшета с почти-максимальное количество питательной среде. Используя многоканальную пипетку, семян в каждую лунку с 1-50 мкл бактериальной культуры.
3. Поместите пластину на ридер и установить его для чтения каждые 10 минут в течение 2 часов при той же длине волны, как в части 3.
4. Когда клетки все достижения OD = 0,1-0,15, удалить пластину из ридер и остановить запись.
5. Добавить КТ конъюгатов при различных концентрациях по крайней мере в четырех экземплярах. Используйте одну сторону пластинки, как "темный" контроль и половина для освещения. Предлагаемая схема приведена на рис 6. Бактерии только контрольная полоска должна всегда быть включен в случае проблем, связанных с культурой, температура и т.д. влияют на условия роста. Одной полосой наркотиков только и только КТ также должны быть включены, чтобы они соответствовали контроль пластина сделана ранее. Остальные скважины предназначены для конъюгатов для того, чтобы обеспечить хорошую статистику.
6. Щит "темной" стороне пластины с алюминиевой фольгой. Вынести другой стороны, чтобы лампа на нужную длину волны.
7. После того, как освещенность, поставил пластинку в планшетов и запись OD 600 каждые 10 минут на 5-12 часов. Держите температура <32 ° C, по возможности, избежать др.инь культур.

Представитель результаты. Сочетание КТ и антибиотиков может быть менее токсичен, чем антибиотик в одиночку, одинаково токсичны, или более токсичны. Это может быть количественно, используя кривые роста и IC ₅₀ измерений. На рисунке 7 показан пример конъюгатов, одинаково токсичны как антибиотик в одиночку, и пример конъюгатов, которые являются более токсичными.

5. Пластина графа

1. Выберите один или несколько скважин обработанных 96-луночного планшета, который будет использоваться для последовательного разведения и колонии счета.
2. Сделать серийного разведения каждого из выбранных бактериальные образцы с PBS или физиологическим раствором (0,9% NaCl). Трансфер 20 мкл бактериальной решения и развести его с 180 мкл физиологического раствора, изменить кончик пипетки, перемешать и перенести 20 мкл разбавленного бактериальных решение до 180 мкл физиологического раствора. Повторить 6 раз.
3. Возьмите 10 мкл из каждого разведения и пластины на соответствующие твердые пластины СМИ. Все 8 концентрации одного образца могут быть покрыты на 10 см вокруг чашки Петри, хотя прямоугольные блюда предпочтительнее, так как легче выстроить вещи.
4. Дайте высохнуть на скамейке запасных в течение 15 мин. затем инкубировать в соответствующей температуры для бактерий в течение 16 часов.
5. Граф колоний и рассчитать колониеобразующих единиц (КОЕ) в соответствии с (# колоний х коэффициент разбавления) / объем покрытием = КОЕ / мл.

На рисунке 8 показан пример пластины КОЕ.

6. Представитель Результаты

Рисунок 1. CdTe квантовых точек. (A) Восемь препаратов КТ CdTe освещается УФ палочка (365 нм). (B) поглощения и испускания из пяти выбранных размеров до и после растворения воды. Пунктирные линии спектра в толуоле, сплошные линии находятся в воде.

files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Спектральные и гель анализа КТ-PMB конъюгатов. Оранжево-излучающих КТ CdTe были использованы для этого примера влияния на другие типы квантовых точек нужно будет оцениваться для каждого эксперимента. (А) Типичное абсорбции (серая линия) и спектры излучения (черная линия) КТ до сопряжения PMB и излучения (пунктирная линия) после добавления 160 молярных эквивалентов PMB. (Б) отношения между отношением PMB и КТ интенсивности излучения (квадраты) и пик волны месте (треугольники).

Рисунок 3. Предлагаемое расположение пластин для контроля пластин роста. Широкий спектр PMB и КТ концентрации представлена. Одна половина пластинки облучают (выделены синим цветом), и такая же половина защищенном от света месте. Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.

Рисунок 4. Пользовательские 96-светодиодные лампы для равномерного облучения пластины, показывающий появление время от времени. Типичный ручной УФ-лампы также могут быть использованы, но не покроет всей пластинки равномерно.

Рисунок 5. Пример результатов для контроля пластин роста. (А) представитель бактериальной кривых роста с различной концентрацией препарата, от 0 до завершения гибели клеток. Открытые символы PMB только с концентрацией данного; твердой символы CdTe-PMB без облучения, а наполовину заполненной символы CdTe-PMB с облучением. Облучение не влияло на PMB только образцы, так что эти кривые были опущены для ясности. Все PMB-CdTe сопряженные 30:1 PMB: КТ отношений. (B) Участки значений кривой роста на 200 мин против Вход [PMB] и соответствует формуле. (1). В продолжениеРОЛ эффектов света, кривой осуществляется с помощью антибиотиков только 30 минут освещенности. (C) Бактериальный выживания на 200 минут по сравнению с КТ концентрации, используя CdTe квантовых точек. Некоторые токсичности наблюдается с освещенности, но слишком мало, чтобы определить значение IC _50. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 6. Предлагаемая схема для сопряженных пластинка теста. Сине-подчеркнул половина пластины должны подвергаться воздействию света, а unhighlighted половина защищены. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 7. Пример результатов для сопряженных пластинка теста. Кривая роста стоимости на 200 мин были плotted и подходит к уравнению. (1). (А)-CdTe PMB конъюгатов шоу увеличилась токсичность по PMB в одиночку. (B) наночастиц золота Au-PMB конъюгаты не проявляют токсичность увеличился на PMB в одиночку.

Рисунок 8. Пример пластины КОЕ. Е. палочки посеяны в 96-луночного планшета обрабатывали QD-PMB с или без облучения в течение 30 мин. Затем инкубировали при 32 ° C в течение 4 часов. Серийные разведения каждого бактериальных образцов были сделаны с физиологическим раствором, и 10 мкл 100 X 10 X ⁷ разведения высевали на агар пластин. Пластины инкубировали при 37 ° C и колонии были подсчитаны после 16 часов. Пластина показывает разведения по рядам, как указано, столбцы: (A) 0,06 мкм PMB + 2 нм CdTe, (Б) 0,12 мкм PMB + 4 нМ CdTe (C) 0,2 мкМ PMB + 6,7 нМ CdTe, (D) 0,06 мкм PMB + 2 нм CdTe облучении (E) 0,12 мкм PMB + 4 нМ CdTe облучении (F) 0.2 мкм PMB + 6,7 нМ CdTe облучениянеоблученных.

Обсуждение

Наночастицы представляют собой перспективный подход к созданию новых антимикробных агентов. Анализ роста кривой способ контроля бактериальной клеточной плотности, что отличает активно растущих клетках подавляется рост клеток. В сочетании с пластиной считает, она позволяет провести...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (опционально)
Боратный буфер компонента # 1	Рыбак	Борная кислота-74-1
Боратный буфер компонента # 2	Sigma-Aldrich	Тетрабората натрия B9876
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	Различные MWCO доступно
Стеклянные флаконы	Рыбак	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
Полимиксин	Sigma-Aldrich	P1004
Бактериальные гро роста среднего (LB) Компонент № 1	Рыбак	NaCl S271
Бактериальные среднего роста (LB) Компонент № 2	BD	Триптон 211705
Бактериальные среднего роста (LB) компонента # 3	BD	Дрожжевой экстракт 211929
Лампа для освещенности	Обычай
Clear-дно 96-луночных	Рыбак	07-200-567 или 07-200-730
Флуоресцентный спектрометр	Molecular Devices
Читатель поглощения пластины	Molecular Devices
BactoAgar для твердых сред	Bioshop	AGR001.1
Чашки Петри вокруг	Рыбак	08-75-12
Чашки Петри прямоугольные	Рыбак	08-757-11A