성장 곡선 및 플레이트 카운트하여 양자 점 및 세균성 독성 Assays의 Solubilization 및 바이오 활용

요약

이러한 반도체 양자 점 (QDs)와 같은 Nanoparticles은 안티 미생물이나 안티 암 어플 리케이션을위한 photoactivatable 요원을 만드는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 방법 보여줍 물 solubilize 항생제로 활용하다, 그리고 성장 곡선 및 플레이트 카운트를 기반으로 세균 억제 분석을 수행, 카드뮴 텔라이드에 (CdTe) QDs합니다.

초록

양자 점 (QDs)은 파장의 폭넓은 선택에 의해 흥분하게 크기에 의존 방출 스펙트럼과 형광 반도체 nanoparticles입니다. QDs는 이미징, 진단 및 그들의 밝고 안정된 형광 ^{1,2 3,4,5으로} 인해 치료에 대해 많은 관심을 받고있다. QDs는 박테리아와 포유 동물 세포를 ^6으로 바인딩을위한 생체 활성 분자의 다양한 복합 될 수 있습니다.

QDs도 널리 박테리아 타겟으로 살인에 대한 세포 독성 대리인으로 조사되고있다. 번식 방지 박테리아 변종의 출현은 급속히 특히 그람 음성 병원균 ^7의 경우, 공중 보건의 위기가되고있다. 때문에 특히 특정 nanomaterials, AG의 잘 알려진 항균 효과, 세균 ⁸ nanoparticles의 독성을 조사 연구 수백가 없습니다. 박테리아 연구 espec뿐만 반도체 nanoparticles 다른 유형으로 수행되었습니다ially _티오이 ^{9,10-11뿐만} 아니라, ZnO ¹² CuO ^13를 포함하여 다른 사람. 박테리아 변종의 일부 비교는 주로 그람 양성과 그람 부정적인 변형을 비교,이 연구에서 수행되었습니다. 입자 또는 산화 독성을 일으킬 수 금속 이온의 직접적인 릴리스에 의한 반응성 산소 종의 photogeneration (ROS) 중 이러한 입자 모두 함께 독성의 메커니즘은 산화에 기인한다. 비록 이러한 자료와 함께, 다른 연구 결과는 크게 다릅니다. 일부 연구에서 그람 양성 시험 변형율은 그람 음성 ^{10 개} 보도에 더 민감, 다른 사람에 그것은 반대로 ^14입니다. 이러한 연구가 잘 ¹⁵ 검토되었습니다.

모든 nanoparticle 연구에서는 입자 성분, 크기, 표면 화학, 샘플 노화 / 고장과 파장, 전력, 가벼운 노출의 기간은 모두 극적으로 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, synthesi에게 있음님의 부산물 및 용제는 ^{16 17로} 간주되어야합니다. 하이 스루풋 스크리닝 기술은 효과적인 새로운 nanomedicine 에이전트를 개발 할 수있는 능력이 필요합니다.

CdTe의 QDs는 안티 미생물의 효과가 혼자 ¹⁸ 항생제와 함께 있습니다. 이전 연구에서 우리는 CdTe 위해 항생제의 커플링 것은 ¹⁹ conjugates에서 반응성 산소 종의 감소 생산으로 인해, 박테리아에 독성을 증가하지만, 포유 동물 세포에 독성을 줄일 수있는 것으로 나타났다. 그것이 카드뮴 함유 화합물은 인체에 사용하기 위해 승인되지 않을 수도 있지만, 그러한 준비가 표면이나 물이 살균의 살균에 사용될 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 mercaptopropionic 산성 (MPA)와 CdTe QDs을 solubilizing에 직접적인 접근 방식을 제공합니다. QDs는 시간 내에 사용할 수 있습니다. 그러면 항균 대리인에게 커플링 보여줍니다.

프로토콜의 두 번째 부분복합 및 unconjugated QDs를 사용하여 96 - 웰 세균 억제 분석을 보여줍니다. 광학 밀도 QD 이외 및 복구 기간이 지나면뿐만 아니라 즉시 평가될 수 있도록 빛의 노출 효과를 허용, 많은 시간 동안 읽을 수 있습니다. 또한 세균의 생존을 quantifying위한 식민지 수를 보여줍니다.

프로토콜

1. QD의 Solubilization

이것은 CdTe에 적합한 방법입니다. 비슷한 방법 등 InP / ZnS ²⁰ CdSe / ZnS ²¹ 등 QDs 다른 유형과 함께 사용할 수 있습니다.

1. 15 μm의 (첫 번째 exciton 피크에서 광학 밀도 = 2.5)에서 톨루엔의 CdTe QDs의 솔루션을 준비합니다.
2. 유리관에이 주식 200 μL를 전송합니다. 플라스틱을 사용하지 마십시오!
3. 800 μL 톨루엔, 200 밀리미터 borate 버퍼 (산도 9) 1 ML과 11.5 M mercaptopropionic 산성 (MPA) 2 μL를 추가합니다.
4. 병을 모자 30~60초을 위해 적극적으로 잡고 흔들어.
5. 수성 및 유기 - 용매 단계는 자발적으로 분리됩니다. 수성 단계 QDs의 색상이 될 것입니다. 톨루엔 층을 방지하려면 그것을 제거하고 그것을 버리고. 그런 다음 깨끗한 유리병에 수성 단계를 전송합니다.
6. 500 μL, 10000 분자량의 컷오프 원심 분리기 필터를 사용하여 네 번 세척 / 필터링하여 solubilized QDs를 정화. 필터는 있어야13분위한 3,000 XG에 불러 냈어요. 최소한 지난 두 세차장 들어, 원하는 최종 버퍼로 씻는다.
7. 최종 세척 후, 4 ° C.에 원하는 산도와 가게에서 50 밀리미터 borate 버퍼에서 한물간 QDs을 정지 그들은 1-2 주 동안 안정 될 것입니다.
8. 출판 수식 ^22을 기반으로 농도를 추정하는 흡광도와 발광 스펙트럼을 측정합니다.

대표 결과 : 그림 1은 자외선 램프 조명 아래 CdTe QDs의 이미지를 보여주고, 물의 solubilization 전후 방출 스펙트럼은 캡 교류에서 무시할 변화를 보여주고 있습니다. 크기 값은 전자 현미경으로 측정 코어 직경입니다.

2. 항생제에 대한 QD 활용

프로토콜의이 부분은 ​​대부분의 상용 QDs, 금속 입자 등 ^19를 포함한 어떠한 부정 - 충전 물 solubilized nanoparticle에 적용됩니다.

1. 모든 분자가 작동 것이다 eith응급실에 부정 - 충전 solubilized QDs에 자기 조립, 또는 그것과 같은 차 아민으로서 복합 될 수 있습니다 반응성 그룹을 가지고 있습니다. 이 예제에서 우리는 긍정적으로 충전과 활용의 시약을위한 필요없이 자체 - 조립되어 polymyxin B (PMB)를 사용하고 있습니다. 60 μm의에서 H ₂ O에서 PMB를 해산. (선택된 항생제는 H ₂ O를 용해없는 경우 0.1-1 mm의 농도로 DMSO 또는 에탄올에 용해). 이것은 10X 솔루션 (H ₂ O) 또는 100x 용액 (용매)을 것입니다.
2. 당신은 세균성 독성 실험에 필요한 어느 정도 QD 솔루션을 계산합니다. 0.3 ML 당 잘 quadruplicates에있는 96 - 웰 플레이트의 경우, 200 나노미터 켤레축 0.5 ML이 필요합니다. 50 MM borate 버퍼 1 μm의 양자 도트의 100 μL 담긴 두개의 튜브를 준비합니다.
3. 일차 아민에 결합하면 19 밀리그램 / ML (100 ㎜) 1 - 에틸 -3 - [3 - 디메틸]의 솔루션은 H ₂ O에 관련 carbodiimide 하이드로 클로라이드 (EDC)를 준비 솔루션 EDC는 안정되지 않습니다, 즉시 사용하고 나머지는 버린다.
4. 10X 항생제 용액 (H ₂ O) 또는 켤레축 튜브로 100x 용액 (용매에서) 5 μL의 50 μL를 추가합니다. PMB의 경우 : 30:1의 어금니 비율 CdTe 활용은, 60 μm의 제품 PMB 50 μL를 추가합니다. H ₂ O 또는 QD 전용 제어 튜브에 솔벤트를 추가합니다.
5. 필요한 경우 켤레축 튜브에 EDC 주식 용액 1 μL를 추가합니다.
6. 적절한 버퍼 (; 같은 트리스 등 노 아민 함유 버퍼, 그들은 EDC를 억제하므로 borate 버퍼 또는 PBS)로 0.5 ML에 켤레축 볼륨을 가져와.
7. 1 시간을위한 nutator 또는 로커에 알루미늄 호일, 장소와 빛과 실드 튜브. 집계가 발생하면 항생제의 낮은 농도와 결합을 반복합니다. 입자가 집계하지 때까지 농도 위쪽 적정하다.
8. 적절한 필터를 통과하여 conjugates 씻으십시오. 10,000 분자량의 컷오프 대부분의 항생제에 대한 아니지만 단백질이나 항체에 적용됩니다.
9. 흡광도 또는 형광 분광법, 겔 전기 영동, 또는 푸리에 변환 적외선 분광 (FTIR) : 분자에 따라 다른 방법 QD 당 항생제 분자의 개수를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.

대표 결과가 있습니다.이 예제에서는 PMB의 활용은 QD 발광 스펙트럼의 변화에 의해 특징입니다. 그림 2는 PMB 더불어 함께 CdTe QDs의 스펙트럼을 보여줍니다.

3. 96 - 웰 화면에 대한 박테리아의 준비, 항생제 IC에서 ₅₀ 결정

이것은 적절한 매체를 ¹⁸ 년 재배 거의 모든 박테리아 변종에 적용됩니다. 녹음을 계속해야 시간의 정확한 길이는 세균의 성장 속도에 따라 달라집니다. 우리 예제에서, 우리는 lysogeny 스프 (LB) 배지에서 자란 대장균을 사용합니다.

1. 적절한 QD 켤레축의 농도를 선택하기 위해서는 그것을 아는 것이 중요항생제의 IC ₅₀ 혼자 QDs가 독성이있는 경우 복합하게합니다. 이것은 2 일 활용 실험 전에 시작되어야한다. 저녁에는 신선한 식민지에서 세균 성장​​ 매체의 씨앗 10 ML은 올바른 살균 및 biosafety 기법을 사용합니다.
2. 다음날, 1-2 시간 실험을하기 전에, 성장 매체의 거의-최대한의 금액과 맑은 하단 96 - 웰 플레이트의 우물을 각각 입력합니다. 세균성 문화의 1-50 μL (농도가 특정 변형이 성장 얼마나 빨리 의존하게되며 귀하의 실험실에서 보정해야합니다)와 각각 잘 멀티채널 피펫, 씨앗을 사용합니다.
3. 플레이트 판독기에 접시를 넣고 결정 파장 (보통 600 nm의)에서 2 시간 10 분 간격을 읽어 그것을 설정합니다. 박테리아가 너무 빨리 너무 조밀한 성장하지 않도록 접시를 모니터링합니다.
4. 세포가 모든 OD = 0.1-0.15에 도달하면 플레이트 리더에서 접시를 제거하고 녹음을 중지합니다.
5. 혼자 약물을 추가하고 홀로 QDs적어도 triplicates 서로 다른 농도. "어둠"의 제어 및 조명되어야 할 하나의 절반 접시의 한쪽을 사용합니다. 제안된 레이아웃은 그림 3에 있습니다. 농도 한 아주 작은 박테리아를 억제 농도, 그리고 그들을 모두 죽이고 하나를 포함하는 광범위한 충분한 범위에 걸쳐해야합니다.
6. 알루미늄 호일로 접시의 "어둠"의 측면을 보호. 원하는 파장의 램프에 반대쪽을 쉽게받을 수 있습니다. 우리는 2.4 MW 개의 LED (그림 4)와 30-60 분 비추다 만든 사용자 지정 96 자, ​​440 nm의 램프를 사용합니다. 맑은 하의와 검정색 접시는 길 잃은 빛으로부터 unexposed 박테리아를 보호하는 데 도움이됩니다. 빈 컬럼도 노출 및 취소 노출된 양쪽간에 사용할 수 있습니다.
7. 빛의 노출 후 플레이트 리더와 기록 OD 600 성장률에 따라 5-12시간를위한 10 분 간격으로 접시를 넣어. 보관 온도 <32 ° C의 문화 건조 회피 할수있다면.에게
8. 성장 곡선을 그리기선택한 시점에서 대 로그 [농도]와 힐 방정식을 사용하는 항생제의 IC ₅₀ 결정 :

H가 힐 계수이고, y를 _{최대 성장} (이상 고원에있는)의 가장 높은 지점이며, Y _분 고원에서도 이상적으로, 제로 지점입니다. 그것은 혼자 QDs 사용한 농도에서 세포 독성 정도 표시되지 않을 것이므로 값이 결정되지 않습니다.

대표 결과입니다. 녹음 기간 끝에, 맑은 우물이 완료 세포 죽음을 나타내는 것이고, 세포 밀도 구배는 약물의 농도를 증가를 따라 나타납니다. 박테리아는 S 자형 성장 곡선 (그림 5) 표시한다; 최대 고원의 위치는 변형하기 변형에서 매우 다양하며 온도에 따라 달라집니다 것입니다. 주어진 시점이 될 수 있습니다대표로 선택하고 값을 꾸몄다 대 로그 [항생제] IC에서 ₅₀ (그림 5 B에게) 주다. QD 독성을 평가하기 위해, 생존 대 로그 [QD]도 꾸몄다하지만, 혼자 QDs과 상당한 세균 살인을 달성하면 (그림 5 C) 드문 경우가 있습니다.

4. 항생제 / QDs와 96 - 웰 화면에 대한 박테리아의 작성

1. 실험, 적절한 풍부한 매체로 새로운 식민지에서 문화의 씨앗 10 ML은 올바른 살균 및 biosafety 기법을 사용하기 전에 일. 그것이 매우 불안정하지 않는 QD-항생제 켤레축는이 날에 대비해야합니다.
2. 실험 전에 1~2시간은 성장 매체의 거의-최대한의 금액과 맑은 하단 96 - 웰 플레이트의 우물을 각각 입력합니다. 세균성 문화의 1-50 μL와 각각 잘 멀티채널 피펫, 씨앗을 사용합니다.
3. 플레이트 판독기에 접시를 넣고 부 3과 같은 파장에서 2 시간 10 분 간격을 읽어 그것을 설정합니다.
4. 세포가 모든 OD = 0.1-0.15에 도달하면 플레이트 리더에서 접시를 제거하고 녹음을 중지합니다.
5. 적어도 사통으로 작성된 서로 다른 농도에서 QD conjugates를 추가합니다. "어둠"의 제어 및 조명되어야 할 하나의 절반 접시의 한쪽을 사용합니다. 제안된 레이아웃은 그림 6에 있습니다. 박테리아는 전용 제어 스트립은 항상 문화, 온도와 케이스의 문제에 포함되어야하는 등 성장 조건에 영향을 미칩니다. 단일 전용 약물의 스트립에만 QD는 또한 이전에 완료 제어 판과 일치하도록 포함되어야합니다. 우물의 나머지 부분은 좋은 통계를 허용하기 위해 conjugates을 다하고 있습니다.
6. 알루미늄 호일로 접시의 "어둠"의 측면을 보호. 원하는 파장의 램프에 반대쪽을 쉽게받을 수 있습니다.
7. 빛의 노출 후 플레이트 리더와 기록 OD 600 5~12시간를위한 10 분 간격으로 접시를 넣어. <32 ° C 가능하면 박사를 피하기 위해 온도를 유지문화 잉.

대표 결과입니다. QDs과 항생제의 조합은 혼자 항생제보다 독성이있을 수 있으며, 마찬가지로 독성, 이상 독성. 이것은 성장 곡선과 IC ₅₀ 측정을 사용하여 계량하실 수 있습니다. 그림 7 그 항생제로서 동등하게 독성 혼자, 그리고 더 많은 독성 conjugates의 예를 conjugates의 예를 보여줍니다.

5. 플레이트 카운트

1. 시리얼 dilutions과 식민지의 계산에 사용되는 치료를 9​​6 - 웰 플레이트 중 하나 이상 우물을 선택합니다.
2. PBS 또는 생리 식염수 (0.9 % NaCl)로 선택된 세균 샘플은 각각의 시리얼 희석하십시오. 세균 용액 20 μL를 전송 180 μL 생리 식염수로 희석, 피펫 팁, 믹스를 변경 180 μL 생리 식염수로 희석 세균성 해결책 20 μL를 전송합니다. 6 회 반복합니다.
3. 적절한에 각 희석 및 플레이트에서 10 μL을 가지고 고체 미디어 플레이트. 그것이 물건을 살해하는 것이 더 쉽습니다로서 직사각형 요리가 선호되고 있지만 한 샘플의 모든 8 농도는 10cm 원형 배양 접시에 도금 수 있습니다.
4. 벌써 15 분 벤치에 말리면. 다음 16시간 동안 세균에 적합한 온도로 품어.
5. 에 (# 콜로니의 X 희석 계수) / 볼륨 도금 = CFU / ML. 따라 식민지 백작과 콜로니 형성 단위 (CFU)를 계산

그림 8은 예제 CFU 플레이트를 보여줍니다.

6. 대표 결과

그림 1. CdTe의 QDs. () CdTe QDs의 여덟 준비는 자외선 지팡이 (365 nm의)와 조명. 물 solubilization 전과 후 5 선택한 크기의 (B) 흡광도와 방출 스펙트럼. 점선 라인이 톨루엔의 스펙트럼이며, 고체 라인은 물에있다.

files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg "/>
그림 2. QD-PMB conjugates의 스펙트럼과 겔 분석. 오렌지 발광 CdTe의 QDs이 예제에 사용되었다; QDs 다른 종류의 효과가 각 실험에 대해 평가해야합니다. () 전형적인 흡광도 (회색 라인) 및 PMB의 활용 및 PMB 160 어금니 등가물의 추가 후 방출 (점선) 이전 QDs의 방출 스펙트럼 (블랙 라인). PMB의 비율과 QD 방출 강도 (사각형)과 피크 파장 위치 (삼각 관계) 사이 (B) 관계.

그림 3. 제어 성장 접시 플레이트 레이아웃을 제안했습니다. PMB와 QD 농도의 넓은 범위가 표시됩니다. 판 중 하나는 절반 (파란색 강조 표시) 반구되고, 동일한 절반 빛으로부터 보호됩니다. 여기를 클릭하십시오큰 그림을 볼 수 있습니다.

그림 4. 균일한 플레이트 조사하기위한 사용자 지정 96 LED 램프, 외관을 자랑 되겠지요. 일반적인 휴대용 자외선 램프도 사용할 수 있지만 균일하게 전체를 커버 플레이트하지 않습니다.

그림 5. 제어 성장 플레이트에 대한 예제 결과입니다. () 다른 약물 농도와 대표 세균 성장​​ 곡선은 0에서 세포 죽음을 완료합니다. 농도가 주어로 열린 기호 PMB에만이므로 단단한 기호 조사없이 CdTe-PMB가, 그리고 절반 채워진 기호 조사와 CdTe-PMB입니다. 조사는 PMB 전용 샘플에 아무런 영향을 미치지 않았다, 이러한 곡선은 명확성을 위해 생략되었다 그래서. QD 비율 : 모든 PMB-CdTe conjugates는 30:1 PMB입니다. (B) 200 분 대 로그 [PMB]의 성장 곡선 값의 음모하고 EQ로 맞출 수 있습니다. (1). cont하기빛의 효과를위한 rol은 곡선은 빛의 노출 30 분과 항생제와 함께 이루어집니다. CdTe QDs를 사용하여 200 분 대 QD 농도,시 (C) 세균의 생존. 일부 독성은 IC ₅₀ 값을 결정하는 빛의 노출,하지만 너무 작은과 함께 볼 수있다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 6. 켤레축 테스트 플레이트에 대한 레이아웃을 제안했습니다. 접시의 파란색 강조 절반 빛에 노출되어야하고, unhighlighted 절반 보호를받습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 7. 예를 켤레축 테스트 플레이트에 대한 검색 결과. 200 분의 성장 곡선 값은 PL 있었다otted와 EQ에 적합. (1). () CdTe-PMB의 conjugates 혼자 PMB를 통해 독성을 증가 보여줍니다. (B) 골드 nanoparticle AU-PMB의 conjugates 혼자 PMB 아무런 독성 증가를 보여 없습니다.

그림 8. CFU 플레이트의 예. E. 96 - 웰 플레이트에 놓는 대장균은 30 분 조사와 함께 또는없이 QD-PMB로 치료되었다. 다음 4 시간 동안 32 ° C에서 incubated. 각 세균 시료의 시리얼 dilutions은 생리 식염수와 10 ⁷ X의 dilutions ~ 100 X 10 μL로 만들어진이 한천 조각 위에 도금되었다. 플레이트는 37 ° C와 식민지 16 시간 후에 집계되었다 incubated되었다. 플레이트는 지시와 같은 행을 따라 dilutions를 표시, 컬럼은 다음과 같습니다 (A) 0.06 μm의 PMB + 2 NM CdTe, (B) 0.12 μm의 제품 PMB + 4 nm의 CdTe (C) 0.2 μm의 PMB + 6.7 nm의 CdTe, (D) 0.06 μm의 PMB + 2 NM은 반구 (E) 0.12 μm의 PMB + 4 NM CdTe 반구, (F) 0.2 μm의 PMB + 6.7 nm의 CdTe irra를 CdTediated.

토론

Nanoparticles은 새로운 안티 미생물 대리인의 창조에 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 성장 곡선 분석은 성장 저해 세포에서 적극적으로 재배 세포를 구별 세균 세포 밀도를 모니터링하는 방법입니다. 플레이트 카운트와 결합하면 켤레축의 항생제 가능성에 대한 철저한 분석을 위해 수 있습니다. 96 - 웰 형식은 가벼운 노출과 같은 농도의 상대적으로 높은 처리량 변화 및 ​​기타 조건을 허용하고,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
버퍼 구성 요소에게 # 1 Borate	어부	붕산 - 74-1
버퍼 구성 요소 # 2 Borate	시그마 - 올드 리치	나트륨 테트라 보 레이트 B9876
MPA는	시그마 - 올드 리치	M5801
Vivaspin 500	GE 헬스케어	28-9322	가능한 다양한 MWCO
유리 튜브	어부	03-338C
EDC	시그마 - 올드 리치	E6383
Polymyxin B	시그마 - 올드 리치	P1004
세균성 GRowth 매체 (LB) 구성 요소 # 1	어부	NaCl S271
세균성 성장 매체 (LB) 구성 요소 # 2	BD	Tryptone 211,705
세균성 성장 매체 (LB)는 구성 요소 # 3	BD	효모 엑기스 211,929
빛의 노출을위한 램프	사용자 정의
삭제 - 하단 96 - 웰 플레이트	어부	07-200-567 또는 07-200-730
형광 분광계	분자 장치
흡광도 플레이트 리더	분자 장치
고체 미디어 BactoAgar	Bioshop	AGR001.1
배양 접시는 높이 들어라	어부	08-75-12
직사각형 배양 접시	어부	08-757-11A