Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего

Резюме

Метафазы к анафазе переход срабатывает через анафазе способствующих комплекса (APC / C)-зависимых убиквитинирования и последующее уничтожение циклин B. Здесь мы создали систему, которая после импульсно-погоня маркировки, позволяет контролировать протеолиза циклин B во всей популяции клеток и облегчает обнаружение вмешательства митотической контрольно-пропускном пункте.

Аннотация

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability ¹. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease ^2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle¹. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/C^Cdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths¹.

Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects ⁵.

To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B ⁶.

To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety ⁶ (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) ^7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium ⁷ (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation ⁶ (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable ^9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium ⁶.

протокол

1. Посев из U2OS на основе циклин B-SNAP Reporter Cells (клон 11 ячеек ⁶⁾ на предметные стекла палата

1. Trypsinize субконфлюентные SNAP репортер клетки, которые могут расти асинхронно в логарифмической фазе, по крайней мере, 48 часов.
2. Работа с 8 хорошо камер микроскопа (постоянное распределение клеток).

Для посева клеток на 8 хорошо камер микроскопа при постоянном распределение по всей поверхности микроскоп камеры, центрифуги 10000 клеток и ресуспендируют в 350 мкл фенола красного без нормального среднего роста (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллин / стрептомицин и пируват натрия). Передача клеточной суспензии в микроскоп камеры (рис. 2).

Работа с 8 хорошо камер микроскопа (максимальная плотность клеток в центре).

Для посева клеток при более высокой плотности в центре микроскопа chambэ-э, загрузить камеру с 300 мкл фенола красного без нормального среднего роста. Добавить 5000 клеток тщательно центра микроскоп камеры (рис. 2).

Рабочая, 96 а специальная оптика пластин (постоянное распределение клеток).

Для посева клеток на 96-луночных планшетах при постоянном распределение по всей поверхности хорошо, центрифуги 5000 клеток и ресуспендируют в 300 мкл фенола красного без нормального среднего роста. Передача клеточной суспензии в 96-луночный планшет. В зависимости от общего числа клеточных содержащих скважины требуется, изменить количество клеток и общего объема суспензии среды (рис. 2).

Рабочая, 96 а специальная оптика пластин (максимальная плотность клеток в центре).

Для посева клеток на 96-луночные планшеты, осторожно добавить 1500 клеток в 15 мкл фенола красного без нормального среднего роста маленькийл падение в центр каждой лунки для достижения ограничение роста клеток к центру скважины (рис. 2).

3. Разрешить посеянных клеток расти в течение по крайней мере 18 ч при стандартных условиях культуры клеток (37 ° C, 100% влажность воздуха, 5% CO _2).

2. Окрашивание Reporter Клетки с SNAP основания

1. За 30 мин до начала процедуры окрашивания позволяют аликвоты фенола красного без нормального среднего роста, чтобы нагреть до 37 ° C.
2. Для удобства обращения с SNAP подложки (в нашем случае TMR Star) растворить ПМР звезды в ДМСО, чтобы получить концентрацию в раствор 400 мкм, которые могут храниться при температуре -20 ° C.
3. Перед окрашиванием, развести 0,5 мкл ПМР раствора звезды в 200 мкл фенола красного без нормального среднего роста (37 ° С) до получения конечной концентрации маркировка 1 мкм.
4. Удалить нормального среднего роста с асинхронным растущие клетки и инкубировать в лabeling среде в течение 25 мин при стандартных условиях культуры.
5. Удалите маркировки среднего и мытье клеток в четыре раза с фенолом красным бесплатно нормальной среде роста (37 ° C). Инкубировать клетки в 300 мкл фенола красного без нормального среднего роста (37 ° C) в течение 30 мин. Перед транспортировкой к микроскопу заменить свежей среды с фенолом красным бесплатно нормальной среде роста (37 ° C) для удаления остатков субстрата SNAP несвязанного.
6. Транспорт клетки в микроскоп в пенопластовую коробку на подогретого (37 ° C) тепловой блок свести к минимуму изменения температуры.

3. Измерение интенсивности флуоресценции

1. За два часа до анализа регулировки температуры воздуха в климатической камере до 37 ° С в сухом режиме для того, чтобы привести всю микроскоп со всеми его компонентами до нужной температуры. Предварительный подогрев перед установкой влажности важна, чтобы избежать конденсации и последующего повреждения микроскопом.
2. Отрегулируйте т влажности воздухаили 60% и СО ₂ до 5% до начала анализа.
3. Запустить сканирование ^ R Приобретение программного обеспечения и определить стандартные параметры (см. таблицу 1).
4. Определение позиций скважин для анализа.
5. Определить Δt (время цикла опроса) и абсолютное число приобретение циклов.
6. Если анализ большего числа скважин необходимо, выберите аппаратное автофокусом, иначе это достаточно использовать программное обеспечение автофокуса в одиночку.
7. Начало приобретения и контролировать в течение первых двух циклов приобретения. Микроскоп будет сосредоточено на гистонов H2-GFP сигнала, с последующим приобретением первое изображение этого канала перед фильтром меняется и соответствующий звезды ПМР образ приобрел (рис. 3). Это повторяется по всем позициям в рамках хорошо и для каждой из скважин должны быть рассмотрены, прежде чем повторять снова на следующий цикл.

4. Анализ Протеолитические и профилипеть Scan ^ R

1. Запустить сканирование ^ R программного обеспечения для анализа и анализа изображений с ядрах клеток, как визуализация на гистонов H2-GFP, определяемый как главный объект, с использованием порогового уровня на основе интенсивности сигнала и водоразделов алгоритм для оказания помощи в отделение соседних клеток. Подобъекта, состоящие из ядра с цитоплазмой должны быть созданы для анализа TMRstar. (Важно свойств основного объекта X и Y позиции, времени и максимальной и средней интенсивности GFP для основных объектов и суммарной интенсивности делится на области для TMRstar подобъект.) Этот анализ может занять несколько часов из-за большого объема данных количествах.
2. Перейдите в режим трассировки для визуализации подобъект среднего ПМР звезды интенсивности флуоресценции с течением времени (ячейка следы), отнесенные к проанализированы основные объекты (рис. 4). Число клеток должны быть рассмотрены может быть сужен путем стробирования на этих измерений длительностью не менее 140 циклов и с высокой максимальной интенсивности H2-GFP. Глядяна большее число клеток позволяет первым представителем и объективный взгляд (рис. 4).
3. Выделите ячейку следов интереса к себе гистонов H2-GFP и ПМР звезды флуоресценции одновременно на одном уровне клетки (рис. 5).
4. С помощью правой кнопки мыши на ячейку интерес и создать экспортируемый картинной галереи для иллюстрации гистона H2-GFP и циклин B-SNAP ПМР Звезда для каждого момента времени.
5. Изменение населения режим сканирования ^ R программного обеспечения для анализа и ворота региона, в котором клетка интерес представляют на X против Y точка сюжета (рис. 5Б).
6. Применить новом окне сюжет точка в закрытом региона и визуализировать означает ПМР звезды интенсивности флуоресценции с течением времени (рис. 5С).
7. Экспорт данных (время и интенсивность флуоресценции) в Microsoft Excel для дальнейшего расчета.

5. Представитель Результаты

ФигаЮр 5D и 5E изображают циклин B кинетики, в лице ПМР Звезда кривой интенсивности флуоресценции, ячейки, которая протекает через регулярные митоза без признаков хромосомной смещения (рис. 5E). После уплотнения цитоплазмы после ядерного пробоя оболочки (NEBD, как указано в красном треугольнике), TMR звезды интенсивности флуоресценции показывает резкое увеличение до изоморфными окна (светлые участки на схеме) достигается, когда клетка вступает прометафазе ^6. Интенсивность флуоресценции остается на стабильном уровне до тех пор, пока клетка проходит через профазе и метафазе, а затем начинает быстро падать, когда все хромосом создали стабильную пластину метафазы (рис. 5D и 5E). Это падение предшествует разделение хромосом в анафазе (синяя точка на кривой). В конце митоза хроматин начинает decondense (синие столбики) и клетка принимает межфазных морфологии в то время как кривая флуоресценции интенсивность приближается кплато, которое ниже, чем на плато перед митоза (рис. 5D и 5E).

Автофокус настройки	Гистон H2-GFP (приобретение основных параметров объекта)	Циклин B-SNAP помечены ПМР звезды (Приобретение установок)	Приобретение Повторение цикла
Грубо автофокусом + / -39 мкм 24 слоев Изобразительное автофокусом + / -5,4 Мкм 14 слоев	GFP набор фильтров: Выдержка: 100 мс Интенсивность света: 25%	TRITC набор фильтров: Выдержка: 150 мс Интенсивность света: 33,3%	От 2 до 5 мин.
GFP набор фильтров: Выдержка: 12 мс Интенсивность света: 12,5%			До 48 часов продолжения анализа (ограничен пониженной влажности воздуха 60%)

Таблица 1. Стандартные настройки, которые используются для анализа протеолиза циклин B. Гистонов H2-GFP был использован в качестве эталона для определения структуры фокальной плоскости для измерения циклин B-SNAP интенсивности флуоресценции. Свет интенсивности при фокусировке процедуру ниже по сравнению с настройками захвата изображения, чтобы избежать кумулятивного фототоксичности.

Рисунок 1. Схема измерения протеолиза циклин B по выражению химерных производной B циклин с деградацией характеристиками, аналогичными эндогенного белка. Снижение интенсивности флуоресценции после импульсного погони маркировки является мерой APC / C-деятельности.

Рисунок 2. Анализ клеток на 8 хорошо слайдов или 96-луночных планшетах. Регулярное распределениеклеток по всей поверхности хорошо достигается за счет ресуспендирования в конечном объеме 300 мкл и рекомендуется, если только одна или несколько позиций вручную, определенных для анализа. Обогащение клеток в центральной области достигается путем добавления клетки к центру предварительно заполненных или пустых скважин. Этот метод рекомендуется в случае автоматизированного получения изображений в различных скважин.

Рисунок 3. Последовательность сбора данных.) Обнаружение гистонов H2-GFP используется для определения плоскости фокуса и мониторинг хромосомных выравнивания во время митоза. B) Интенсивность флуоресценции от интенсивности флуоресценции ПМР звезда является мерой абсолютного количества импульсно-меченых погони циклин B-SNAP.

Рисунок 4. Представитель Scan ^ R Анализ программных изображением среднего ПМР звездыинтенсивности флуоресценции (суммарная интенсивность TMRstar разделены по площади) с течением времени. Выбор следом представитель клетки (синие). Соответствующие изображения (показано на рисунке справа) позволяют одновременной визуализации гистонов H2-GFP (зеленый) и циклин B-SNAP (красный). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 5. A + B) Пример для стробирования точек, представляющих ячейку проценты по XY-точка сюжета. C) Визуализация средней интенсивности флуоресценции TMRstar (суммарная интенсивность TMRstar разделены по области) в течение времени, используя точку сюжета. D + E) представитель флуоресценции кривой интенсивности циклин B-SNAP с изоморфными окна (brigher поля на диаграмме) между NEBD (ядерного пробоя оболочки) и хроматин деконденсации (синяя полоса), а генерируются в Microsoft Excel. Анафаза указывается тОн синяя точка на кривой. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Фильм 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительных фильм .

Обсуждение

Мы приведем здесь живой клетке изображений подход, основанный на содействие одновременного мониторинга циклин B протеолиза и хромосомы выравнивания. Такой подход позволяет исследовать митотический управления в невозмущенной клеточных популяций на одном уровне клетки. Cyclin кривые B д?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Наименование продукта	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Линии Reporter клетки	генерируется в доме, как описано 6	клонировать 11 клеток Репортер (U2OS на основе циклин B-клеток, экспрессирующих SNAP)
Ретровирусные циклин B-SNAP вектор экспрессии	генерируется в доме, как описано 6	pLNCX2-циклин B mut5-SNAP
Phenolred без DMEM	Gibco	21063-029	Дополнение с FCS, пируват натрия, пенициллина / стрепто-MYCIN требуется
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	Со 400 мкМ раствор в ДМСО
Специальные пластины Opstics, 96 а	Costar	3720
μ-Slide 8 хорошо, ibiTreat	Ibidi	80826
Микроскопия блок	Олимп	IX-81 обратного микроскоп с климатической камере
Цель	Олимп	UPLSAPO 20x цели (NA 0,75)
Приобретение программного обеспечения	Олимп	Сканирование ^ R Приобретение программного обеспечения (v.2.2.09)
Анализ программного обеспечения	Олимп	Сканирование ^ R анализа программного обеспечения (v.1.2.0.6)