Матрица-лазерной десорбцией / ионизацией Время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрический анализ интактных белков Больше, чем 100 кДа

Резюме

Точное измерение массы представляет собой важный шаг в ходе расследования белков. Matrix-лазерной десорбцией / ионизацией (MALDI) масс-спектрометрии (МС) могут быть использованы для такого определения и его основным преимуществом является устойчивость к соли, моющих средств и загрязнений. Здесь мы иллюстрируют доступный подход к анализу белков больше, чем 100 кДа по MALDI-MS.

Аннотация

Эффективно определения массы белков имеет решающее значение для многих биологических исследований (например, для структурной биологии исследований). Точная определение массы позволяет оценить правильность белковых первичных последовательностей, наличие мутаций и / или пост-трансляционных модификаций, возможной деградации белков, в однородности выборок, и степень изотопного включения в случае маркировки (например, ¹³ С маркировки ).

Электрораспылением ионизацией (ESI) масс-спектрометрии (МС) широко используется для определения массового денатурированных белков, но его эффективность зависит от состава буфера выборок. В частности, присутствие солей, моющих средств, и загрязняющих веществ сильно снижает эффективность анализа белков по ESI-MS. Matrix-лазерной десорбцией / ионизацией (MALDI) MS является привлекательной альтернативой, благодаря своей толерантности соли и простоте сбора данных и интерпретаТион. Кроме того, определение массы больших гетерогенных белков (больше, чем 100 кДа) легче по MALDI-MS из-за отсутствия перекрытия высокие государственные распределения зарядов, которые присутствуют в спектрах ESI.

Здесь мы представляем доступный подход для анализа белков больше, чем 100 кДа по MALDI-времени пролета (TOF). Мы иллюстрируют преимущества с использованием смеси двух матриц (т.е. 2,5-дигидроксибензойной кислоты и α-циано-4-гидроксикоричной кислоты) и полезность тонкого слоя методом, как подход для осаждения образца. Мы также обсуждаем важную роль матрицы и чистоты растворителя, стандартов, используемых для калибровки, лазерной энергии, а часть времени приобретения. В целом, мы предоставляем информацию, необходимую для новичка для анализа интактные белки размером более 100 кДа по MALDI-MS.

Введение

Структурная биология опирается на производстве высококачественных белков ¹ и, следовательно, должен быть связан с эффективных и надежных методов для анализа белка ^2,3. В нашем масс-спектрометрии (МС) лабораторию в течение института структурной биологии мы должны подтвердить первичную последовательность белков, оценить наличие мутаций и посттрансляционных модификаций, деградация белков, образец однородность и качество изотопной метки (например, дейтерированный белки для ядерного магнитного резонанса исследований ^4). Поскольку структурные биологи используют ограниченный протеолиз различать структурно жесткие домены из гибких частей, мы должны надежно характеризуют такие усеченные белки с помощью MS.

Когда биомолекулы анализируют методом МС, два возможных подхода используются для мягко ионизировать такие тяжелые и неустойчивые молекулы. Электроспрей ионизации (ESI) ионизирует молекулы непосредственно изжидкая фаза ^5; матрица-лазерной десорбционной ионизации (MALDI) требует, чтобы биомолекулы совместно кристаллизованный ультрафиолетовыми поглощающих органических молекул (т.е. матрицы молекул) ^6.

ESI времени пролета (TOF) МС соединен с жидкостной хроматографии стало рутинной метод анализа интактных белков, поскольку это позволяет определение массы с высокой точностью (≤ 50 частей на миллион). Тем не менее, вполне восприимчивы к составу буфера для образцов (в частности, солей и моющих средств) и загрязняющих веществ (например, полимеры), которые иногда трудно устранить, в результате чего подавление сигнала аналита.

MALDI-TOF MS представляет собой эффективную альтернативу ESI-MS потому что его производительность меньшей степени зависит от буферных компонентов, моющих средств и загрязняющих веществ, а также позволяет интактного белка определение массы с достаточной точностью (≤ 500 частей на миллион) для проверки последовательности. После Proteiн пищеварение, MALDI-TOF MS может быть также использован для анализа данных, полученных пептидов для дальнейшего подтверждения первичной последовательности в так называемой "массовой дактилоскопии пептид".

В наших руках, определение массы интактных белков, которые больше, чем 100 кДа и гетерогенных (в связи с изменениями или укорочения), легче по MALDI-MS, чем ESI-MS. Это связано с отсутствием перекрывающихся государственных распределения зарядов, присутствующих в спектрах ESI. Кроме того, поскольку MALDI процесс не зависит от размера анализируемого вещества ^7, такие метод дает высокую чувствительность, когда биомолекулы масса превышает 100 кДа. Замечательные анализ интактных белков проводили с использованием самодельных инструментов в период с конца 1980-х годов и в начале 1990-х годов ^8-11.

MALDI-TOF может быть также использован в качестве инструмента отбора для оценки качества образцов белка, поскольку он требует меньше времени для подготовки образца и менее подвержен ИНТЕРФЕРЕНЦИЯCES из-за общих примесей (например, соли). После первой, быстрой оценки по MALDI-MS, образец может быть дополнительно проанализированы ESI-TOF для определения его массы с более высокой точностью. Кроме того, MALDI генерирует ионы, содержащие меньшее количество зарядов, чем ESI и поэтому приобретения и интерпретации MALDI данные более простым. Это позволяет студентам, работающие в структурной биологии для анализа их рекомбинантных белков сразу после краткого обучения.

Два ключевых фактора влияют на качество MALDI спектров: Матрица и техника, используемая для матрицы осаждения (например сушат капель ⁸ и тонкослойной ^{12-16,17,18).} Один органическая матрица [например sinapinic кислота (SA) ^19-21 или α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (α-CHCA) ^14,22,23] часто используется для MS рассмотрении интактных белков и сшитый белковых комплексов . Использование α-CHCA, группа Хаит ранее представил подробный протокол для рУслуги ремонта ультра тонкий слой до MALDI анализе растворимых и мембранных белков ^14,15. Недавно Горка и соавт. Показано графита на основе целевой покрытие для улучшения MALDI анализ пептидов и белков с использованием α-CHCA качестве матрицы ^24.

Здесь мы приводим простой протокол для анализа интактных белков по MALDI-TOF MS, используя смесь двух матриц: 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) и α-CHCA ^25. Мы также систематически оценивать производительность смеси DHB-CHCA по сравнению с СА матрицами и α-CHCA, для контроля интактных белков. Матрица смесь позволяет лучше разрешение (то есть белковые пики гораздо острее). Кроме того, присутствие интенсивных нескольких зарядов ионов (т.е. М ⁺² Н ^{2 +,} M +3 H ^{3 +} и т.д.) обеспечивает более точное определение массы, потому что разрешение осевых инструментов MALDI-TOF выше при более низкой массы к заряду (м / з) ^26. Это особенно полезно для определения молекулярной массы белков больше, чем 100 кДа.

Высокая чувствительность также достигается использованием смеси DHB-CHCA (0,5 пмоль белка с пятнами на MALDI мишени).

Как мы уже упоминали выше, важным фактором, который следует учитывать при использовании MALDI инструмент является матрицей осаждения. Laugesen и соавт. Предложили использовать DHB-CHCA смеси в первый раз ^25, с использованием высушенного осаждения капель. Тем не менее, мы наблюдали лучшие результаты (например, значительно выше чувствительности), когда мы использовали тонкую метод слой, где первый слой, образованный α-CHCA, растворенную в ацетоне. Тонкий слой метод ^12,27 предполагает формирование однородного субстрата матричных кристаллов на MALDI мишени, который был описан в видео Юпитер ранее ^15. Затем образец наносят на этом субстрате, и, наконецДополнительный матрица осаждается (см. ниже). В этой статье, мы также показывают, как внести образец на MALDI мишени, но и как очистить цель ^15, для перекристаллизации, и готовиться матрицы.

В заключение мы стремимся предоставить всю необходимую информацию для анализа интактные белки ученых (в частности, структурные биологи), которые нужно оценить качество произведенных белков в быстрой и простой способ, а кто не так хорошо знакомы с MALDI-TOF MS. По прогнозам в середине 1990-х годов ^28, МС была повышенное влияние на биологических исследований, а его доступность для биологов возросла. Мы надеемся, что информация, которую мы условии будет полезно сделать MALDI-TOF доступны для биологов и ученых, которые хотели бы начать использовать масс-спектрометрии.

протокол

1. Белок Подготовка образцов: Буфер обмена (необязательно)

5-25 мкл микромолярных концентраций белка (от 1 до 20 мкм) необходимы. Буфер обмена может быть проведена с использованием центробежной ультрафильтрации устройств (например Vivaspin, Sartorius) или фильтрационных колонок гель микроцентрифуги (например, Micro Bio-спинового 6 столбцов хроматографии, Bio-Rad) ^29,30. Буфер обмена шаги можно повторить 2-3х. Подробное описание буфера обмена ранее представлены ^29,30. Например, мы используем 20 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан (т.е. трис) рН 8 в качестве конечного буфера.

Примечание: Этот шаг можно опустить во многих случаях. Это должно осуществляться, когда образец содержит молекулы белка или буферы, которые могут сильно помешать обнаружению MS [например глицерина, 4 - (2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-кислота, HEPES]. Это также полезно для улучшения КуЭк спектров.

2. Перекристаллизация матриц с целью улучшения их чистоты (дополнительно)

1. Налейте 10 мл 40%-ного этанола (EtOH) в колбе из пирекса.
2. Добавить 600 мг матрицы.
3. Использование на водяной бане и резистивный нагреватель, теплый матрицу решение и размешать, пока матрица полностью не растворится, используя стеклянную палочку или магнитной мешалки.
4. Повторите шаг 2, пока вы не насыщенный раствор.

Примечание: Использование слишком большого объема растворителя или растворения матрица гораздо ниже точки кипения раствора вызовет плохой выход кристаллов или кристаллов не совсем.

5. Разрешить решение медленно охлаждаться. Вы можете оставить его при комнатной температуре в течение нескольких часов и затем при 4 ° С в течение ночи. Примечание: если кристаллы не образуются, кристаллизация может быть вызвано царапин внутреннюю часть стакана (чуть ниже поверхности раствора) с использованием стеклянной мешалки.
6. Сбор матричные кристаллы фильтрацией.
7. Промойте кристаллы с минимальным количеством ледяной растворителе и фильтровать их.
8. Разрешить кристаллы, чтобы высохнуть. Вы можете использовать вакуум для этого шага.

3. Очистка MALDI нержавеющей стали Target

1. Промойте MALDI тарелку с метанолом (MeOH) и осторожно протрите чистящей ткани специально изготовленной для лабораторных приложений (например Kimwipe).
2. Промойте цель H ₂ O и протрите его чистящей ткани.
3. Вставьте MALDI пластины в 600 мл химический стакан и покрыть ее 50% EtOH.
4. Обрабатывают ультразвуком в цель в растворе EtOH в течение 10 мин в ультразвуковой ванне.
5. Если есть остатки, оставшиеся на пластине, повторите шаги еще раз 1-4.
6. Наконец, промойте цель с метанолом (или с водой, см. примечание ниже), наклоните его таким образом, что вся жидкость собирается на чистящей ткани. Пусть целевой высохнуть при комнатной температуре или при использовании азот-Поток газа.

Примечание: Аналогичная процедура была ранее описана ^15.

Примечание: растворитель (метанол или вода) используется для промывки последней цели определяет целевые некоторые особенности. Если цель промывают MeOH, образец распространяется на цель гораздо больше, чем при использовании воды.

4. α-CHCA Тонкослойная Решение: Подготовка и осаждения на MALDI Target

1. Растворить α-CHCA в ацетоне, с тем чтобы насыщенного раствора.
2. Рукой (без пипетки) окунуть 10 мкл наконечник (например GELoader Tip, Eppendorf) в в α-CHCA насыщенного раствора: небольшое количество раствора будет течь в наконечнике (из-за капиллярного).
3. Прикоснитесь очень быстро (то есть 1 сек) в MALDI цель кончика пипетки и депонировать α-CHCA ацетон решение на MALDI мишени. Это будет представлять собой тонкий слой матрицы, где белокобразец будет сдан на хранение. Попробуйте создать тонкослойной место как можно меньше.

Примечание: При использовании в качестве матрицы SA, мы готовить тонкий слой с помощью насыщенного раствора SA в ацетоне.

5. Подготовка Natrix Solutions: SA, α-CHCA, DHB и CHCA_DHB Микс ²⁵

1. Готовят раствор 20 мг / мл SA в ACN, 0,1% TFA (70:30, об / об).
2. Подготовка 20 решение мг / мл α-CHCA в ACN и 5% муравьиной кислоты (70:30, об / об) [названа "раствором α-CHCA"].
3. Подготовка 20 мг / мл раствора в DHB ACN и 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) (70:30, об / об) [названный как "DHB решение"].
4. Смешайте "решение α-CHCA" и "DHB решение" в соотношении 1:1 (объем / объем), чтобы получить "CHCA_DHB решение".

Примечание: Можно смешивать "решение α-CHCA" и "DHB решение" в различных соотношениях, при анализе белков с массой менее 100 кДа. Для EXAmple отношение 40:60 между α-CHCA и DHB (об / об) дает лучшее разрешение, но меньше чувствительность (см. обсуждение).

6. Образец Нанесение на MALDI Target

1. Депозит 0,5 мкл образца белка на предварительно подготовленный α-CHCA тонким слоем. Сразу после этого добавить 0,5 мкл матричной раствора (т.е. раствора SA или раствора α-CHCA или "CHCA_DHB смеси"). Это означает, смешивания образца и матрицы на цель.

Примечание: Обычно смешивает образец белка с матрицей в соотношении 1:1. Это отношение имеет решающее значение для хорошего качества MALDI спектров. Если вы хотели бы проверить различные концентрации образца, вы можете использовать кислотный раствор ACN_formic (описанный выше), чтобы разбавить образец.

Примечание: Если вы предпочитаете, вы можете смешать образец и матрицу в трубке, а затем внести смешанный "sample_matrix решеТион "на тонком слое.

Примечание: Мы предлагаем вам протестировать различные концентрации образца, потому разбавления пробы позволяет уменьшить помехи загрязняющих веществ. Чтобы разбавить образец, вы можете использовать кислотный раствор ACN_formic (описанный выше), чтобы разбавить образец.

7. Калибрующего Отложение

1. Депозит 0,5 мкл стандарта калибрующего (например, "белковые II", Bruker Daltonics, Бремен), то добавить 0,5 мкл матричного решения.

Примечание: Загрузите калибрующего на MALDI пластины рядом с образцом пятен белка (см. обсуждение).

8. MALDI Spectra Приобретение калибрующего и Белки Образцы

Как только образцы и калибрующего сушат, вы можете наблюдать «пятна» под микроскопом. Это наблюдение не является обязательным и может быть интересна в основном для новичков. Для получения спектров образца, вставить тыс.э цель в приборе MALDI-TOF и выберите соответствующие инструментальные параметры, которые различны для каждого типа оборудования. Чтобы получить наиболее подходящий настройку необходимо следовать рекомендациям производителя. Как общих соображений при анализе интактные белки, следует использовать инструмент в линейном режиме (не в режиме отражателя, который подходит для пептидов анализы). Обычно мы используем наш прибор в режиме положительных ионов. Кроме того, ключевым параметром является "импульсный извлечения ионов", который улучшает инструментальную разрешение ^31. Говоря простым языком, "импульсный извлечения ионов" можно определить как паузы между генерации ионов образца и времени, когда ионы ускоряются к детектору. При анализе интактные белки, нужно использовали "импульсный извлечения ионов" (например, 500 нс) больше, чем при наблюдении пептиды (например, 80 нс).

Выберите нужный диапазон м / г, приобретают спектры Oе калибрующего, и откалибровать прибор. Когда вы приобретаете спектры вашим образцам, используйте соответствующий интенсивности лазерного излучения (см. обсуждение).

Результаты

Мы проанализировали неповрежденный белок (Хромосома область техническое обслуживание 1 белка, Crm1; молекулярную массу: 123386 Da) с использованием двух различных матриц, два метода осаждения и ту же интенсивность лазерного (рис. 1). SA и CHCA_DHB смесь были использованы в качестве матриц. Смесь дали масс-спектры более высокого качества с точки зрения отношения сигнал-шум и чувствительности (фиг.1А и B). В частности, мы смогли обнаружить 0,5 пмоль белка, нанесенного на MALDI мишени (рис. 1в). Такое же количество белка было едва уловимым использованием SA (рис. 1D). Кроме того, используя смесь матрицы, методом выбора для матрицы осаждения был "тонкий слой" подход (рис. 1А). Используя метод "сухой капли", мы не обнаружили белок с массой более 100 кДа (данные не показаны). Используя CHCA_DHB смесь (рис. 1А и 1С), многозарядных ионов в Proteiн наблюдалось, что позволяет определение массы с более высокой точностью, так как разрешение пиков в осевых инструментов MALDI-TOF обратно пропорциональна т / г ^26.

Мы также проанализировали мономерного бета-галактозидазу (116300 Da) (рис. 2). Спектры CHCA_DHB были лучше, чем спектров SA с точки зрения чувствительности и разрешения. Кроме того, наличие многозарядных ионов (М ^{2 +,} M ^{3 +} и М ^{4 +)} позволило нам подтвердить массу белка с высокой точностью (рис. 2A и 2C). Использование тонкого подхода слоя, мы сравнили производительность CHCA_DHB смеси, SA и только α-CHCA для анализа иммуноглобулина, IgG (148500 Да) (рис. 3). Когда мы соотносить различные данные, белковые сигналы были выше и с лучшим разрешением в спектрах CHCA_DHB. В заключение, использование CHCA_DHB смеси и способа осаждения тонкого слоя продемонстрировал значительные улучшения в качестве крупного неповрежденной массового белок спектров приобретенного с использованием прибора MALDI TOF.

Рисунок 1. MALDI-TOF анализ нетронутыми Хромосома области технического обслуживания 1 белка, (Crm1), молекулярная масса: 123 386 Da. А) 1 пмоль Crm1 была проанализирована с помощью DHB_CHCA сочетание как матрица В) суммы:. 1 пмоль; матрица:. С.А. С) количество: 0,5 пмоль; матрица:. DHB_CHCA д) Количество: 0,5 пмоль; матрица: С. А.. Сигнал из пиков, выраженных в произвольной единицу интенсивность масштабе, нормализуется до максимального текущей стоимости в каждом спектре.

пг "Первоначально" / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg "/>
Рисунок 2. MALDI-TOF анализ неповрежденной бета-галактозидазы (116300 Da). А) количество: 20 пмоль; матрица DHB_CHCA Б) количество:. 20 пмоль; матрица:. С.А. С) количество: 5 пмоль; матрица:. DHB_CHCA D) количество: 5 пмоль; матрица: SA.

Рисунок 3. MALDI-TOF анализ интактного иммуноглобулина, IgG (148500 Да); сумма:. 1,7 пмоль Спектры, полученные с помощью CHCA_DHB смесь были гораздо более интенсивным (максимум: 8200 произвольный единичный, а.е.), чем спектры SA (максимум: 1200 а.е.) и спектры α-CHCA (максимум: 4500 а.е.)

Обсуждение

Мы представили протокол деталь для получения высокого качества масс-спектры больших интактных белков с молекулярными массами больше, чем 100 кДа, используя прибор MALDI-TOF. Ряд важных аспектов, касающихся подготовки образца должны быть тщательно продуманы, чтобы улучшить качество масс-спектров. Матрицы и растворители высокой чистоты имеют решающее значение, потому что все загрязняющие вещества, присутствующие в матрицах и растворителей сосредоточены на цели MALDI после испарения растворителя. Для того чтобы повысить чистоту MALDI матриц можно очистить их с помощью классических методов перекристаллизации (см. выше). Мы также рекомендуем, чтобы недавно подготовке матрицы решений (по крайней мере один раз в неделю), чтобы улучшить кристаллизацию матрицу и, чтобы избежать деградации матрицы.

Подход осаждения матрица имеет очень важное значение для окончательного качества спектров. Как описано выше, метод тонкослойной наш метод ое выбор ^12. Кроме того, оптимизированный подход для нанесения первого слоя. Когда матрица растворяют в ацетоне, чтобы получить насыщенный раствор, пропанона позволяет быстрое испарение растворителя, но и делает размер первого слоя очень трудно контролировать. Мы предлагаем использовать наконечник GELoader как щеточкой, что вы окунуться в matrix_acetone решения, чтобы получить минимальный объем, который можно быстро осаждаться на цель. Размер первого слоя как-то управляет окончательный размер MALDI месте: небольшое место (т.е. 0,5-0,75 мм диаметром) является предпочтительным, поскольку в этом случае концентрация образца выше, чем в случае большого месте. Получение небольшое пятно отличается от ультра-тонкий слой подхода ранее предложенной в Юпитер видео ^15. В Fenyő др.. Тонкий решение слой распространилась по всему MALDI мишени, используя сторону кончика пипетки. Этот подход требует проверки тонкий слой, который должен удовлетворить конкретные критерии(Например, скорость испарения растворителя). Если критерий не выполняется, то цель MALDI следует мыть и новый тонкий слой должен быть подготовлен. Это делает препарат весьма трудоемким для новичка. Кроме того, осаждение образец / матрицы смеси на пластине требует аспирации избыточного растворителя с использованием вакуумной линии и стадии промывки с помощью TFA ¹⁵ является необходимым, что делает Fenyo соавт. Препарат немного более сложной, чем нашему подходу.

Объемное соотношение между матрицей и образцом является весьма важным для успешного анализа интактных белков по MALDI-TOF. После тестирования различных соотношений мы предлагаем использовать соотношение 1:1. Другой матрица: образец доля может поставить под угрозу качество спектров, вероятно, связано с неоднородной кристаллизации. Порядок, в котором матрица и образец откладываются также имеет важное значение. После нанесения тонкого слоя матрицы, образец хранение и сразу после (до SAMPле пятно становится сухой) смесь CHCA_DHB добавляется. Эта процедура была определена как "сэндвич методом" ^27, где одна проба на хранение между двумя матричных слоев. В качестве альтернативы, раствор CHCA_DHB и образец может быть смешан в 0,5 мл пробирку, а затем наносили на тонком слое CHCA ^12. Это дает место с однородной слоем кристаллов, полученных в спектрах высокого качества. При анализе белков с массой ниже, чем 100 кДа, концентрация DHB может быть увеличена (например, 60:40 DHB: CHCA); это может привести к более острый пик, но может поставить под угрозу чувствительность измерений (т.е. менее интенсивные пики).

Для правильной калибровки прибора, важно внести в калибрующего стандарты очень близкие к выборочных точках, позволяя один, чтобы получить более массовое точность. "Процедура калибровки псевдо-внутренняя" ранее предложил ^15: после приобретения образца спектра, калибрующего место, которое яс лазерной выстрел и сигнал калибрующего добавляются в спектре образца. Это позволяет внутренне калибровки спектр образца с помощью калибрующего пики.

Энергия лазера следует также тщательно контролировать во время приобретения спектров. В большинстве случаев, более высокая энергия повышает чувствительность, но снижает разрешение. Мы предлагаем использовать минимальную возможно лазерную энергию без ущерба для чувствительности приобретения. Кроме того, для улучшения спектрального качества, можно приобрести больше выстрелов на каждом образце месте. Обычно больше снимков вы приобрести (1000-2000 выстрелов), тем выше интенсивность сигнала. При попадании в место с лазером, необходимо найти правильное положение (то есть "сладкое место"), поскольку образец не однородно распределены. Вы можете снимать на той же площади, пока сигнал не растет, а затем попытаться найти другую область, содержащую образец.

В заключение высокой чистоты матриц и SolvЭнты, методы, используемые для образца и осаждения матриц на мишени, положение стандартов, используемых для калибровки, интенсивность лазерной энергии, момент приобретения (количество выстрелов / место) являются важнейшими факторами, которые следует принимать во внимание при анализ интактные белки по MALDI-TOF MS.

Вклад авторов

LS и ВБС разработан эксперименты, выполненные эксперименты масс-спектрометрии, проанализировали данные, и написал рукопись.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253
Trizima	Sigma	T6066
Micro Bio-Spin 6 chromatography columns	Bio-Rad	732-6221
Vivaspin 500	Sartorius	VS0122	various molecular weight cut off
Methanol	Fluka	14262
Ethanol	Fluka	02860
KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers	Kimberly Clark	05511
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma Aldrich	C8982
Acetone	Sigma Aldrich	650501
2,5-dihydroxybenzoic acid	Fluka	39319
GELoader Tips	Eppendorf	0030 001.222
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Formic acid	Fluka	09676
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich	302031
Protein Standard II	Bruker Daltonics	207234	It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine
Immunoglobulin G	ABSciex	GEN602151
			[header]
			EQUIPMENT
Water purifier PURELAB Ultra Analytic	ELGA LabWater	89204-052
Autoflex MALDI-TOF instrument	Bruker Daltonics
MALDI-TOF target	Bruker Daltonics