JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Аннотация

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Введение

Лимфоузлы специализированные отсеки, где адаптивные иммунные реакции против иностранных и аутоантигены которые инициируются и скоординированные. Процедура, представленные здесь описаны короткий ферментативного расщепления в сочетании с автоматизированной механической пипетки, чтобы получить лимфатических узлов суспензию одной клетки и получить доступ к жизнеспособных лимфатических узлов стромальных клеток, которые поддерживают поверхностную экспрессию нескольких молекул.

Лимфатических узлов стромальных клеток образуют каркас из лимфатического узла и выполнить три основные функции: сначала они фильтровать жидкости тела, чтобы пробовать антигены, патогенные микроорганизмы и их патогенов, связанный молекулярную шаблон (PAMPs), а также цитокинов и опасность, связанная молекулярную шаблон (DAMPS) присутствует в организме. Во-вторых, они привлекают и поручить антиген представляющих клеток (АРС) и лимфоциты взаимодействовать и инициировать адаптивные иммунные реакции; и третье, они обеспечивают структурную среду для гомеостаза и дифференциации лимфоцитов 13. Во время воспаления лимфатических узлов стромальных клеток производить факторы роста, цитокинов и хемокинов, адаптироваться к набуханию тем самым организации взаимодействия дендритные клетки (ДК), T-и B- клетки. Оркестровка иммунных реакций возможно только за счет комплексной структурной архитектуры образованной различных популяций клеток стромы.

Лимфатических узлов стромальных клеток являются CD45 негативные клетки и можно отличить по выражению CD31 или gp38 в фибробластов и эндотелиальных клеток 1 -6. Gp38 + CD31 - определяет T зон ретикулярные клетки (TRC, также известный как FRC: фибробластические ретикулярные клетки), gp38 + CD31 + определяет лимфатические эндотелиальные клетки (LEC), gp38 - CD31 + определяет эндотелиальные клетки крови (БЭК). Кроме того, характеристика субпопуляций показали существование других стромальных клеток лимфатических узлов. В самом деле, небольшое перицитов, как клеточная популяция характеризовалась течениеgp38 - CD31 - население 7. Таким образом, адаптация процедуры выделения является выгодным для идентификации и характеризации функциональных свойств различных лимфатических узлов стромальных клеток.

До развития лимфатических узлов стромальных клеток пищеварения протоколы изучение лимфатических узлов стромальных клеток был ограничен наблюдений в точке с использованием тканей раздел и микроскопии. Тем не менее, структурные и функциональные исследования показали, важные характеристики лимфатических узлов стромальных клеток. Лимфатических узлов стромальные клетки, связанные с podoplanin, коллагена и внеклеточного матрикса (ECM) белков с образованием комплекса 3 размерную структуру, называемую систему трубопровода, который транспортирует лимфатические и связанные с низкой молекулярной массой белки из субкапсулярной синуса лимфатического узла с высоким эндотелием венул в Т-клетках зоне 8. ДК находятся в тесном контакте с клетками стромы и может наблюдаться выступающие в трубчатый ConСтруктура Duit пробовать жидкость и выявления антигенов 8. Взаимодействие лимфатических узлов стромальных клеток (УНЦ и LECS) с ДК опосредуется выпуска и презентации хемокинов CCL21 и CCL19 9,10. CCL19 и CCL21 признаны CCR7 рецептора облегчая ДК и Т-клетки мигрируют в лимфатические узлы зоне Т-клеток 4,11. Несмотря на использование подобных хемокинов, ДК и Т-клетки имеют разные пути миграции в лимфатические узлы 12. Позже, с помощью ферментативного переваривания лимфатического узла и выделения чистых лимфатических узлов стромальных клеток, функциональные исследования проводились на роли различных лимфатических узлов стромальных клеток и их способности взаимодействовать с ДК и Т / В-клеток 6,13. Во-первых, перекрестные помехи между IFN-γ, продуцирующих эффекторных Т-клеток в лимфатических узлах и стромальных клеток индуцирует продукцию метаболита оксида азота, показанной чтобы ослабить Т-клеточные реакции и пролиферации во вторичных лимфоидных органах, 14-16. Во-вторых, лимфатических нода стромальных клеток, как сообщается, поддерживает дифференциацию нормативных подмножеств постоянного тока по производству Ил-10 17, и модулировать наивное гомеостаза Т-клеток с помощью производства IL-7 6,18. В-третьих, TLR выражение в лимфоузлах стромальных клеток предполагает, что клетки стромы подвержены сигнала, полученного от инфекции или самоуправлений молекул выделяется при повреждении тканей. Действительно, лечение лимфатических узлов стромальных клеток с лиганда TLR3 поли (I: C) индуцирует скромную положительную регуляцию основных выражения комплекс гистосовместимости класса I и усилением активности со-ингибирующее молекула PD-L1, но не из костимуляторных молекул, в результате чего кардинальные изменения в периферических тканях антигены выражение 19. Несколько групп показали, лимфатических узлов стромальные клетки экспрессируют антигены периферических тканей и индуцировать толерантность самореактивным Т-клеток 19,21-27. Поэтому, понимания связей между лимфатических узлов стромальных клеток и другой миграционного и реSIDENT клетки лимфатических узлов поможет найти новые целевые молекулы, которые позволят активацию или подавление иммунных реакций при воспалении. Таким образом, осуществление опубликованной ферментативного разделения лимфатического узла не требуется.

Ранее опубликованные протоколы используют различные комбинации коллагеназы основе ферментативного расщепления с малой механической нагрузкой 6,19,20. Однако длинные инкубации с пищеварением ферментов или различным сочетанием пищеварения фермента может ухудшить различные поверхностные молекулы, необходимые для анализа состояния активации и определения новых лимфатических узлов стромальных клеток. В зависимости от типа анализа стромальных клеток, протоколы передачи или Fletcher протокол может быть более подходящим. В описанной выше процедуре, немного короче ферментативное расщепление в сочетании с автоматизированной механической дезагрегации, чтобы свести к минимуму деградацию поверхности маркера жизнеспособных лимфатического узла стромальных клеток. Эта процедура позволяет хорошо воспроизводимый изоляцию иРазличие лимфоузлов населения стромальных клеток с низкой изменчивости и более 95% жизнеспособность. В недавно выделенные стромальные клетки лимфатических узлов может быть непосредственно использован для поверхностного маркера экспрессии, анализа белка и транскрипции исследований, а также установление линий стромальных клеток для выполнения функциональных анализов в пробирке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

В этом видео-публикации и протокола, все процедуры животных были проведены в соответствии с протоколом животных, утвержденной кантона администрации Базель-Штадт, Швейцария.

1 лимфатические узлы Подготовка и пищеварения

  1. Предварительного нагрева воды в химическом стакане до 37 ° С с помощью магнитной мешалки с нагревательной пластиной.
  2. Готовят щелочной среде следующим образом: DMEM среде (без пирувата), дополненной 2% FCS, 1,2 мМ CaCl 2 и ручка / Strep (100 единиц пенициллина, 100 мкг стрептомицина).
  3. Стерилизовать все рассечение инструментов перед использованием.
  4. Усыпить мышей лимфатических узлов доноров на CO 2 удушья и асептических рассекать лимфатические узлы. Не препарировать окружающую жира. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для периферической кожи слива лимфатического узла (паховые, плечевой, подмышечной).
  5. Поместите лимфатические узлы в стерильную чашку Петри, содержащую 2 мл ледяной щелочной среде.
  6. Нарушить лимфатических узлов окpsule с помощью двух 25 G иглы, закрепленные на 1 мл шприц.
  7. Передача нарушенную ткани лимфатического узла в 5 мл полипропилена с круглым дном пробирку, содержащую 750 мкл щелочной среде с добавлением 1 мг / мл коллагеназы IV и 40 мкг / мл ДНКазы I.
  8. Добавьте одну стерильную магнитной мешалки в каждой пробирке.
  9. Место трубки в химическом стакане с 37 ° С предварительно нагревают воду и перемешивают в пробирки с медленной скоростью (1 раунд / сек) в течение 30 мин.
  10. Снимите трубку с магнитной мешалкой с нагревательной пластины и пусть фрагменты лимфатических узлов урегулировать.
  11. Осторожно удалите супернатант обогащенный "не-стромальных клеток". ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализ Т, В, дендритных клеток и CD45 - gp38 - CD31 - предусматривается, спасти «не-стромальных клеток" фракции.
  12. Промывочный остальные ткани лимфатического узла один раз 750 мкл щелочной среде. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только при работе с иммунокомпетентных мышей.
  13. Давайте фрагменты лимфатических узлов урегулировать.
  14. Удалитьне-стромальных клеток-плавающей фракции.
  15. Добавить к фрагментам лимфатических узлов 750 мкл основной среде, дополненной 3,5 мг / мл коллагеназы D и 40 мкг / мл ДНКазы I.
  16. Место трубки обратно в химический стакан, содержащий 37 ° C предварительно нагревают воду.
  17. Дайджест ткани лимфатического узла в течение 5 мин, медленно помешивая.
  18. Разбивку лимфатические фрагменты узел ткани с помощью пипетки и смешивания 700 мкл для 10 циклов при максимальной скорости, используя автоматизированную многоканальную пипетку. ПРИМЕЧАНИЕ: Это нарушает ткани лимфатического узла для улучшения пищеварения.
  19. Поместите пробирку назад в стакан с 37 ° C разогретой водой.
  20. Дайджест фрагменты ткани лимфатического узла для еще 10 мин, помешивая.
  21. Обеспечить представление лимфатические фрагменты узел ткани с помощью пипетки и перемешивания в течение 99 циклов при максимальной скорости, используя автоматизированную многоканальную пипетку.
  22. Добавить 7,5 мкл 0,5 М ЭДТА, чтобы обеспечить поддержание суспензии отдельных клеток.
  23. Разбивку фрагменты ткани лимфатического узла по трубеПриступая и перемешивания в течение 99 циклов при максимальной скорости, используя автоматизированную многоканальную пипетку.
  24. Добавить 750 мкл щелочной среде и передать клетки через нейлоновое сито 70 мкм.
  25. Центрифуга клеточной суспензии 5 мин при 1500 х г, 4 ° С.
  26. Стромальных клеток теперь могут быть использованы для дальнейшего анализа.

2 Окрашивание лимфатических узлов стромальных клеток

  1. Использование комбинации анти-CD45, анти-podoplanin (gp38), анти-CD31 антителами успешно распознавать TRC, LEC, BEC и DN клетки.
  2. Выдержите переваривается ткани лимфатического узла с Live / Dead трекер, анти-CD45-FITC (1: 200), анти-gp38-PE (1: 200), анти-CD31-APC (1: 200) в 100 мкл HBSS, содержащий 2 % FCS в течение не менее 20 мин, 4 ° С, в темноте.
  3. Промывают клетки добавлением 500 мкл HBSS, содержащей 2% FCS
  4. Центрифуга клеточной суспензии 3 мин при 1500 х г, 4 ° С.
  5. Повторное приостановить в 100 мкл HBSS, содержащим 2% FCS.
  6. Запуск окрашенных клеток в проточной цитометрии equippред со следующими оптики: источник возбуждения до трех лазеров: синий (488 нм, с воздушным охлаждением, 20 мВт твердотельный), красный (633 нм, 17 мВт гелий-неоновый), и фиолетовый (405 нм, 30 мВт твердотельный) .
  7. Ворота CD45 - клетки, чтобы исключить кроветворных клеток.
  8. Gate фуфайки (FSC-W) и живые клетки (ОНЛАЙН / DEAD трекер), чтобы исключить дублеты и мертвые клетки.
  9. Участок gp38 против CD31 для визуализации TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) и DN (gp38 - CD31 -) клеток (рисунок 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Настоящий протокол является изменение протокола пищеварение опубликованные Ссылка др., 2007 6 с более коротким временем пищеварения (45 мин максимум) за счет механического разукрупнения с автоматизированной многоканальной пипетки. Кроме того, эта процедура более стандартизир...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Изучение лимфатических узлов стромальных клеток в последнее время стал фокус исследования в связи с развитием двух опубликованных протоколов пищеварения 6,13. Оба протокола являются достаточными, чтобы получить одного лимфатического узла стромальные клетки, но отличаются по пр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare they have no competing financial interests.

Благодарности

The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCSFinal concentration 2%
CaCl2Sigma499609Final concentration 1.2 mM
Collagenase IVWorthington Biochemical Corporation>160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase DRoche11088882001use at 3.5 mg/ml
DNAse IRoche 11284932001use at 40 µg/ml
Stiring magnetsFAUST5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 mlFalcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating functionIKA-RCT-standard9720250
Petri dishes 100 mm, sterileTPP6223201
25 G needlesTerumo
anti mouse CD45 AbBiolegendClone 30-F11
anti mouse CD11c AbBiolegendClone N418
anti mouse Podoplanin AbBiolegendClone 8.1.1
anti mouse CD31 AbBiolegendClone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel		Eppendorf4861 000.821/8301.250 µl max. volume
anti mouse CD140aBiolegendClone APA5
anti mouse CD80BiolegendClone 16-10A1
anti mouse CD40BiolegendClone 1C10
anti mouse I-AbBiolegendClone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)BiolegendClone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kitInvitrogenL10119

Ссылки

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35(2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

90

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены