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요약

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

초록

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

서문

림프절은 외국과 자기 항원에 대한 적응 면역 반응이 시작되고 조정되는 전문 구획입니다. 여기에 제시된 절차 림프절 단일 세포 현탁액을 수득하고 여러 분자의 표면 발현을 유지 가능한 림프절 기질 세포에 접근하기 위해 자동화 된 기계적인 피펫 결합 단편의 효소 소화를 설명한다.

림프절 기질 세포가 세 가지 주요 기능을 림프 노드의 골격을 형성하고 이행 : 첫째가 체액 항원, 병원균과 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS)뿐만 아니라, 사이토 카인 및 위험 관련 분자 패턴을 샘플링 필터 (감쇠) 본 몸에. 둘째, 상호 작용 및 적응 면역 반응을 시작하는 항원 제시 세포 (APC)와 림프구를 유치하고 지시; 셋째, 이들은 하나의 림프구 항상성 및 분화 구조 환경을 제공-3입니다. 염증 림프절 기질 세포는 성장 인자, 사이토 카인 및 케모카인을 생산하는 동안, 수지상 세포 간의 상호 작용을 편성함으로써, T- 및 B- 세포 종기에 적응. 면역 반응의 오케스트레이션으로 인해 서로 다른 기질 세포 집단에 의해 형성되는 복잡한 구조 아키텍처에만 가능합니다.

림프절 간질 세포가 CD45 음성 세포와 섬유 모세포하며 내피 세포 1-6에서 CD31의 발현 또는 gp38에 의해 구별 될 수있다. CD31 + 혈액 내피 세포를 정의 (BEC)를 - gp38 + CD31 + 림프 내피 세포 (LEC), gp38를 정의 - Gp38 + CD31는 (섬유 모세포 망상 세포 또한 FRC로 알려진 TRC) T 존 망상 세포를 정의합니다. 또한, 특정 집단의 특성은 다른 림프절 기질 세포의 존재를 한 것으로 밝혀졌습니다. 실제로 작은 주연 세포와 같은 세포 집단은 내에 특성화시켰다gp38 - CD31 - 인구 7. 따라서, 분리 절차의 적응은 다른 림프절 기질 세포의 기능적 특성의 확인 및 특성화를 위해 유리하다.

림프절 기질 세포 소화 개발 전에 림프절 기질 세포의 연구는 조직 절편 및 현미경을 이용한 관찰에 시츄로 제한 프로토콜. 그럼에도 불구하고, 구조적 및 기능적 연구는 림프절 기질 세포의 중요한 특성을 보였다. 림프절 기질 세포는 높은 내피로 림프절의 낭하 부비동에서 림프와 연관된 낮은 분자량 단백질을 수송 도관 시스템이라고 복잡한 3 차원 구조를 형성하기 위해 podoplanin, 콜라겐과 세포 외 기질 (ECM) 단백질과 연결된 T 세포 영역에서 8 세정맥. 수지상 세포는 간질에 밀착되고 관형 콘으로 돌출 관찰 될 수있다duit 구조는 유체 샘플 8 및 항원을 검출한다. 수지상 세포와 림프절 기질 세포 (TRC를 사용해 및 수정체 상피)의 상호 작용은 케모카인의 CCL21와 CCL19 9, 10의 출시와 프리젠 테이션에 의해 매개된다. CCL19와 CCL21은 림프절의 T 세포 영역 4,11로 이전 수지상 및 T 세포를 촉진 CCR7 수용체에 의해 인식됩니다. 비슷한 케모카인을 사용에도 불구하고, 수지상와 T 세포는 림프절 (12)에 서로 다른 이동 경로를 가지고있다. 나중에, 림프절 및 순수한 림프절 기질 세포의 분리의 소화 효소를 사용하여 기능적 연구는 상이한 림프절 간질 세포의 역할과 수지상 세포와 T / B 세포 6,13와 상호 작용하는 그들의 능력에 대해 수행 하였다. 우선, IFN-γ 생산 효과기 T 세포 및 림프절 기질 세포 사이의 크로스 토크는 보조 림프 기관 14-16에서 T 세포 반응과 확산을 저해하는 것으로 대사 산화 질소의 생산을 유도한다. 둘째, 림프 N송시 기질 세포는 IL-10 (17)의 생산을 통해 규제 DC 서브 세트들의 분화를 지원하기 위해, 및 IL-7의 제조 6,18 통해 나이브 T 세포의 항상성을 조절하는 것으로보고되었다. 셋째, 림프절 기질 세포의 TLR 발현은 간질 세포가 조직 손상 중에 방출 감염 또는자가 유래의 분자 신호에 민감한 것을 시사한다. 실제로, TLR3 폴리 리간드와 림프절 기질 세포의 치료 (I는 : C)의 결과, 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I 발현 및 공동 억제 분자 PD-L1의 상향 조절의 완만 한 상향 조절을 유도하고 있지만 보조 자극 분자 주변 조직의 극적인 변화는 식 (19) 항원. 몇몇 그룹은 림프절 기질 세포가 말초 조직 항원을 발현하고 자기 반응성 T 세포의 19,21-27 내성을 유도 보였다. 따라서, 림프절 기질 세포 및 다른 이동성 재 사이의 상호 작용을 이해sident 림프절 세포는 염증 동안에 활성 또는 면역 반응의 억제를 허용하는 새로운 표적 분자를 찾는 데 도움이 될 것이다. 따라서, 림프절의 발행 효소 분리의 구현이 필요하다.

이전에 게시 된 프로토콜은 낮은 기계적 스트레스 6,19,20와 콜라겐 기반의 효소 소화의 다른 조합을 사용합니다. 그러나 소화 효소 나 소화 효소의 상이한 조합을 가진 긴 인큐베이션 활성화 상태를 분석하고 새로운 림프절 기질 세포를 식별하기 위해 필요한 다양한 표면 분자를 저하 될. 간질 세포 분석의 유형에 따라, 링크 프로토콜 또는 프로토콜 플레쳐 더 적합 할 수도있다. 설명 된 절차에서 다소 짧은 효소 소화가 가능한 림프절 기질 세포 표면 마커의 열화를 최소화하기 위해 자동화 된 기계식 세분화와 결합된다. 이 절차는 재현성이 높은 절연을 가능하게하고낮은 변동성과 95 % 이상의 생존으로 림프절 간질 세포 집단의 차이. 갓 절연 림프절 기질 세포는 시험 관내에서 직접 작용 분석을 수행하는 기질 세포 라인의 표면 마커의 발현, 단백질 분석, 전사 연구뿐만 아니라 설정에 사용될 수있다.

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프로토콜

이 비디오를 게시 및 프로토콜에서 모든 동물의 절차는 분할 한 기관 바젤 슈타 트, 스위스의 승인을 동물의 프로토콜에 따라 실시 하였다.

1 림프절 준비 및 소화

  1. 가열 플레이트 자석 교반기 37 ° C에 비커 초기 가열 물.
  2. 다음과 같은 기본 미디어를 준비 : DMEM 배지 (피루 베이트 제외) 2 % FCS로 보충, 1.2 mM의 염화칼슘 및 펜 / 연쇄상 구균 (페니실린의 100 단위, 스트렙토 마이신 100 μg).
  3. 사용하기 전에 모든 해부 도구를 소독.
  4. CO 2 질식 당 림프절 공여 쥐를 안락사 및 무균 적으로 림프절을 해부하다. 주위의 지방을 해부하지 마십시오. 참고 :이 프로토콜은 주변 피부 배수 림프절 (사타구니, 상완, 겨드랑이)에 최적화되어 있습니다.
  5. 2 ㎖의 차가운 얼음 기본적인 매체를 포함하는 멸균 페트리 접시에 림프절을 놓습니다.
  6. 림프절 캘리포니아를 중단1 ML의 주사기에 고정이 25 G 바늘을 사용하여 psule.
  7. 1 밀리그램 / ㎖의 콜라게나 제 IV 및 40 μg / ml의 DNase의 I. 보충 된 750 ㎕의 배지를 함유 염기성 5 ㎖ 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브에 방해 림프절 조직을 이동시켜
  8. 각 튜브에서 하나의 멸균 자석 교반기를 추가합니다.
  9. 37 ° C로 비커에 넣어 튜브는 물을 예열하고 30 분 동안 느린 속도 (1 라운드 / 초)에서 튜브를 저어.
  10. 가열 플레이트 자석 교반기에서 튜브를 제거하고 림프절 조각이 정착 할 수 있습니다.
  11. 조심스럽게 "비 기질 세포"풍부한 뜨는을 제거합니다. 참고 : T, B, 수지상 세포와 CD45의 분석 경우 - gp38 - CD31가 - 예상된다 "비 기질 세포"부분을 저장합니다.
  12. 워시는 750 ㎕를 기본 매체로 한번 림프절 조직을 나머지. 참고 :이 단계는 면역 능력 마우스로 작업하는 경우에만 필요합니다.
  13. 림프절 조각이 정착하자.
  14. 제거비 기질 세포 부동 분수.
  15. 750 ㎕의 기본 매체가 3.5 mg을 보충 림프절 조각에 추가 / ㎖ 콜라게나 D 40 μg / ml의 DNase의 I.
  16. 다시 37 ° C가 들어있는 비커에 넣어 튜브는 물을 예열.
  17. 천천히 교반하면서 5 분 동안 림프절 조직 다이제스트.
  18. 피펫 및 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 최대한의 속도로 10 회 700 μl를 혼합하여 해리하는 림프절 조직 조각. NOTE :이 소화를 향상시키기 림프절 조직을 방해.
  19. 37 ° C 예열 된 물을 다시 비커에 튜브를 놓습니다.
  20. 천천히 교반하면서 또 10 분간 다이제스트 림프절 조직 단편.
  21. 피펫에 의해 림프절 조직 조각을 해리하는 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 최대한의 속도로 99 사이클 혼합.
  22. 단일 세포 현탁액의 유지 보수를 보장하기 위해 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 7.5 μl를 추가합니다.
  23. 파이프에 의해 해리하는 림프절 조직 절편tting 및 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 최대한의 속도로 99 사이클 혼합.
  24. 750 ㎕의 기본 매체를 추가하고 70 μm의 나일론 메쉬를 통해 세포를 전달합니다.
  25. 원심 분리기 세포 현탁액 1500 XG에 5 분, 4 ° C에서.
  26. 간질 세포를 추가 분석을 위해 이제 사용될 수있다.

림프절 기질 세포의 2 염색

  1. 성공적 TRC, LEC, BEC 및 DN 세포를 인식하는 항-CD45, 항 podoplanin (gp38), 항-CD31 항체의 조합을 사용한다.
  2. , 안티 gp38-PE (1 : 200), 항 CD31-APC (1 : 200) 100 ㎕를 HBSS의 2를 포함 : 라이브 / 죽은 추적기, 항 CD45-FITC (200 일)로 소화 림프절 조직을 품어 어둠 속에서 20 분 이상, 4 ° C에 대한 % FCS.
  3. 2 % FCS를 포함 HBSS의 5백리터를 추가 세포를 씻으
  4. 원심 분리기 세포 현탁액 1500 XG에 3 분, 4 ° C에서.
  5. 2 % FCS를 포함 HBSS 100 ㎕에 다시 일시 중지합니다.
  6. equipp 플로우 사이토에 염색 된 세포를 실행다음 광학 에드 : 여기까지 세 레이저를 소스 : 청색 (488 nm의, 공기 냉각, 20 mW의 고체 상태), 적색 (파장 633 nm, 17 mW의 헬륨 네온), 바이올렛 (405 나노 미터, 30 mW의 고체 상태) .
  7. 게이트 CD45 - 세포는 조혈 세포를 제외합니다.
  8. 게이트 단봉 (FSC-W) 및 살아있는 세포 (LIVE / DEAD 추적기) 이중선과 죽은 세포를 제외합니다.
  9. , LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) 및 DN (gp38 - CD31 -) 세포 (그림 1 참조) - CD31 대 플롯 gp38는 TRC (gp38 + CD31)를 시각화합니다.

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결과

본 프로토콜로 인해 자동화 된 멀티 채널 피펫 기계 세분화에 짧은 소화 시간 (45 분 최대)로 링크 등., 2007 (6)에 의해 발표 된 수정 소화 프로토콜입니다. 또한, 상기 절차는, 더 표준화 상이한 림프절 기질 세포에 표면 마커의 열화를 최소화하고 동시에 하나 이상의 샘플의 처리를 허용한다.

의 콜라겐 IV와 콜라게나 D는 플레처 프로토콜 13에서 링크 프?...

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토론

림프절 기질 세포의 연구는 최근에 의한 소화 작용이 발행 프로토콜 6,13의 개발에 연구 초점이되었다. 두 프로토콜은 단일 림프절 간질 세포를 획득하기에 적절하지만, 소화 효소의 이용과 소화의 시간 차이가있다. 기질 세포와 그 표면 마커 효소 소화와 기계적 스트레스에 민감하기 때문에, 최적화 된 프로토콜이 필요합니다.

갓 해부 림프절에서 가능한 림프절 기?...

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공개

The authors declare they have no competing financial interests.

감사의 말

The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCSFinal concentration 2%
CaCl2Sigma499609Final concentration 1.2 mM
Collagenase IVWorthington Biochemical Corporation>160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase DRoche11088882001use at 3.5 mg/ml
DNAse IRoche 11284932001use at 40 µg/ml
Stiring magnetsFAUST5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 mlFalcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating functionIKA-RCT-standard9720250
Petri dishes 100 mm, sterileTPP6223201
25 G needlesTerumo
anti mouse CD45 AbBiolegendClone 30-F11
anti mouse CD11c AbBiolegendClone N418
anti mouse Podoplanin AbBiolegendClone 8.1.1
anti mouse CD31 AbBiolegendClone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel		Eppendorf4861 000.821/8301.250 µl max. volume
anti mouse CD140aBiolegendClone APA5
anti mouse CD80BiolegendClone 16-10A1
anti mouse CD40BiolegendClone 1C10
anti mouse I-AbBiolegendClone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)BiolegendClone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kitInvitrogenL10119

참고문헌

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