Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Resumo

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Resumo

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Introdução

Os linfonodos são compartimentos especializados onde as respostas imunes adaptativas contra-antígenos próprios estrangeiros e são iniciadas e coordenadas. O processo aqui apresentado descreve uma digestão enzimática curto combinado com pipetagem automatizada mecânica para obter linfonodo suspensão de células individuais e obter acesso às células viáveis ​​do estroma de nódulos linfáticos, que mantêm a expressão de várias moléculas da superfície.

Formar células do estroma linfonodo cadafalso do linfonodo e cumprir três funções principais: primeiro eles filtram líquidos do corpo para provar antígenos, patógenos e sua patógeno padrão molecular associado (PAMPs), bem como as citocinas e perigo associado padrão molecular (amortece) presente no corpo. Em segundo lugar, eles atraem e instruir as células apresentadoras de antígenos (APC) e linfócitos para interagir e iniciar respostas imunes adaptativas; e em terceiro lugar, que proporcionam um ambiente estrutural para a homeostase e diferenciação dos linfócitos ¹-3. Durante a inflamação células do linfonodo estromais produzem fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas, adaptar-se, assim, o inchaço organizar a interação entre células dendríticas (DCs), T e células B. A orquestração das respostas imunitárias só é possível devido a arquitectura estrutural complexo formado por diferentes populações de células do estroma.

As células do estroma de nódulos linfáticos são células CD45 negativas e pode ser distinguida da expressão de CD31 ou gp38 em células fibroblásticas e endoteliais ^{1 -6.} GP38 ⁺ CD31 ^- define as células da zona T reticulares (TRC, também conhecidos como FRC: células fibroblásticas reticulares), gp38 ⁺ CD31 ⁺ define células endoteliais linfáticas (LEC), gp38 ^- CD31 ⁺ define as células endoteliais do sangue (BEC). Além disso, a caracterização das subpopulações revelou a existência de outras células do estroma de nódulos linfáticos. De facto, uma pequena população de células-pericyte como foi caracterizado nagp38 ^- CD31 ^- população ^7. Portanto, a adaptação do procedimento de isolamento é vantajosa para a identificação e caracterização das propriedades funcionais diferentes de células do estroma de nódulos linfáticos.

Antes do desenvolvimento de linfonodo células estromais digestão protocolos que o estudo de células estromais de linfonodos foi limitado a observações in situ usando secção de tecido e microscopia. No entanto, estudos estruturais e funcionais apresentaram características importantes de células estromais de linfonodos. As células do estroma de nódulos linfáticos são associados com podoplanina, colagénio e proteínas (ECM) de matriz extracelular de modo a formar uma estrutura tridimensional complexa 3 chamado sistema de conduta, a qual transporta as proteínas linfáticas e massa molecular associada menor do seio subcapsular do nó de linfa para o alto endotélio vênulas na zona de células T ^8. DCs estão em contato com células do estroma e pode ser observado saliente no con tubularestrutura duit a amostra de fluido e detectar antigénios ^8. A interação das células do estroma dos nódulos linfáticos (TRCs e LECs) com DCs é mediada pela liberação e apresentação das quimiocinas CCL21 e CCL19 ^9,10. CCL19 e CCL21 são reconhecidos pelo receptor CCR7 facilitar DCs e as células T migrem para a zona das células T linfonodo ^4,11. Apesar de usar quimiocinas semelhantes, as células T e DCs têm diferentes rotas de migração para os linfonodos ^12. Mais tarde, utilizando a digestão enzimática do nódulo linfático e isolamento de células do estroma de nódulos linfáticos puros, estudos funcionais foram realizados sobre o papel dos diferentes células do linfonodo estroma e a sua capacidade para interagir com DC e células T / B ^6,13. Em primeiro lugar, a interferência entre as células produtoras de IFN-T efectoras e células estromais γ nódulos linfáticos induz a produção do óxido nítrico metabolito mostrado para amortecer as respostas das células T e a proliferação dos órgãos linfóides secundários ^14-16. Em segundo lugar, n linfaAs células do estroma ode ter sido relatado para suportar a diferenciação de subconjuntos de DC de regulação através da produção de IL-10, ^17, e para modular a homeostase da célula T ingénuos através da produção de IL-7 ^6,18. Em terceiro lugar, a expressão de TLR em células do estroma de nódulos linfáticos sugerem que as células do estroma são susceptíveis ao sinal obtido a partir de uma infecção ou de auto-moléculas libertado durante a lesão de tecidos. De facto, o tratamento de células do estroma de nódulos linfáticos com o ligando de TLR3 de poli (I: C) induz uma regulação positiva modesta de grande expressão de histocompatibilidade classe I e complexa regulação positiva da molécula co-inibidor PD-L1, mas não das moléculas de co-estimulação, resultando em mudanças dramáticas no tecido periférico antígenos expressão ^19. Diversos grupos têm apontado células do estroma dos nódulos linfáticos expressar antígenos de tecidos periféricos e induzir tolerância das células T auto-reactivas ^19,21-27. Portanto, a compreensão das interacções entre células do estroma dos nódulos linfáticos e outro re migratório ecélulas do linfonodo sident vai ajudar a encontrar novas moléculas alvo para permitir a ativação ou supressão de respostas imunes durante a inflamação. Portanto, é necessária a implementação da separação enzimática publicado do linfonodo.

Protocolos previamente publicados usar diferentes combinações de digestão enzimática à base de colagenase com baixo esforço mecânico ^6,19,20. No entanto, longas incubações com enzimas da digestão ou a combinação de diferentes tipos de enzima de digestão pode prejudicar várias moléculas de superfície necessárias para analisar o status de ativação e identificar novas células estromais de linfonodos. Dependendo do tipo de análise de células do estroma, o protocolo de ligação ou Fletcher protocolo pode ser mais adequado. No processo descrito, de uma digestão enzimática ligeiramente mais curto é combinado com a desagregação mecânica automatizado para minimizar a degradação da superfície marcador linfáticos viável células estromais nó. Este procedimento permite que o isolamento altamente reprodutível edistinção de nódulos linfáticos de populações de células do estroma com uma baixa variabilidade e de mais do que 95% de viabilidade. As células do estroma de nódulos linfáticos isolados de fresco pode ser usado directamente para a expressão do marcador de superfície, a análise de proteínas, e estudos de transcrição, bem como o estabelecimento de linhas de células estromais de realizar os ensaios funcionais in vitro.

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Protocolo

Nesta publicação de vídeo e protocolo, todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo de animais aprovados pela Autoridade Cantonal Basel-Stadt, Suíça.

1. Linfonodos Preparação e Digestão

1. Pré-aquecimento de água num copo a 37 ° C num agitador magnético com placa de aquecimento.
2. Prepare médio básico como se segue: DMEM (sem piruvato) suplementado com 2% de FCS, 1,2 mM _CaCl2 e Pen / Strep (100 unidades de penicilina, 100 ug de estreptomicina).
3. Esterilizar todos os instrumentos de dissecção antes do uso.
4. Eutanásia camundongos linfonodo doadores por asfixia com _CO2 e assepticamente dissecar os gânglios linfáticos. Não dissecar a gordura ao redor. NOTA: Este protocolo é otimizado para o nó periférico de drenagem linfática da pele (inguinal, braquial, axilar).
5. Coloque gânglios linfáticos em uma placa de Petri esterilizada, contendo 2 ml de meio de base de gelo frio.
6. Interromper o linfonodo capsule usando duas agulhas 25 G fixos em 1 ml seringa.
7. Transferir o tecido de linfonodos interrompido num tubo de polipropileno de 5 ml de fundo redondo contendo 750 ul meio básico complementado com 1 mg / ml de colagenase IV, e 40 ug / ml de ADNase I.
8. Adicionar um agitador magnético estéril em cada tubo.
9. Colocar o tubo no recipiente com 37 ° C pré-aquecido de água e agita-se os tubos a uma velocidade lenta (1 volta / seg) durante 30 min.
10. Remover o tubo do agitador magnético com placa de aquecimento e deixar fragmentos de linfonodos resolver.
11. Remova cuidadosamente o sobrenadante enriquecido em "células não-estromal". NOTA: Se a análise de T, B, células dendríticas e CD45 ^- gp38 ^- CD31 ^- está prevista, salvar a fração "células não-estromais".
12. Lavar o tecido restante linfonodo uma vez com 750 ul meio básico. NOTA: Esta etapa é necessária somente se a trabalhar com camundongos imunocompetentes.
13. Vamos fragmentos de linfonodos resolver.
14. Remover ofracção flutuante de células não-estromal.
15. Adicionar aos fragmentos de nódulos linfáticos meio básico de 750 ul suplementadas com 3,5 mg / ml de colagenase D e 40 ug / ml de ADNase I.
16. Colocar o tubo de volta na taça que contém a 37 ° C pré-aquecido a água.
17. Digerir o tecido do linfonodo para 5 min, enquanto lentamente mexendo.
18. Linfáticos fragmentos de tecido nó desagregados por pipetagem e misturando 700 mL para 10 ciclos em máxima velocidade usando uma pipeta multicanal automatizada. NOTA: Isso atrapalha linfonodo para melhorar a digestão.
19. Colocar o tubo de volta no recipiente com água a 37 ° C pré-aquecido.
20. Fragmentos de tecidos de linfonodo Digest para mais 10 min, enquanto lentamente agitação.
21. Desagregar fragmentos de tecidos de nódulos linfáticos por pipetagem e mistura por 99 ciclos a velocidade máxima utilizando uma pipeta multicanal automatizada.
22. Adicionar 7,5 mL de 0,5 M de EDTA para garantir a manutenção da suspensão de célula única.
23. Fragmentos de tecidos de linfonodo desagregados por tubotting e mistura por 99 ciclos a velocidade máxima utilizando uma pipeta multicanal automatizada.
24. Adicionar meio básico de 750 ul e as células passam através de uma malha de nylon de 70 ^ m.
25. Centrifugar a suspensão de células de 5 min a 1500 xg, 4 ° C.
26. As células do estroma pode ser agora usado para posterior análise.

2 Coloração de Linfonodo células estromais

1. Use uma combinação de anti-CD45, anti-podoplanina (gp38), os anticorpos anti-CD31 para reconhecer com sucesso células TRC, LEC, BEC e DN.
2. Incubar o tecido linfático nó digerido com vivo inoperante rastreador /, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) em 100 uL de HBSS contendo 2 % FCS para, pelo menos, 20 min, 4 ° C, no escuro.
3. Lave as células adicionando 500 l de HBSS contendo 2% de FCS
4. Centrifugar a suspensão de células a 3 minutos a 1500 xg, 4 ° C.
5. Re-suspender em 100 uL de HBSS contendo 2% de FCS.
6. Executar as células marcadas num citómetro de fluxo equed, com as seguintes óptica: fonte de excitação com até três lasers: azul (488 nm, arrefecido a ar, de 20 mW de estado sólido), vermelho (633 nm, 17 mW HeNe), e violeta (405 nm, 30 mW de estado sólido) .
7. Portão de CD45 ^- células para excluir as células hematopoiéticas.
8. Singlets Portão (FSC-W) e de células vivas (VIVO / rastreador DEAD) para excluir doublets e células mortas.
9. Plot gp38 contra CD31 para visualizar TRC (gp38 ⁺ CD31 ^-), LEC (gp38 ⁺ CD31 ^+), BEC (gp38 ^- CD31 ⁺⁾ células (ver Figura 1) e DN (gp38 ^{- -} CD31).

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Resultados

O presente protocolo é um protocolo de digestão modificada publicada por ligação et al., 2007 ⁶ com um menor tempo de digestão (45 minutos no máximo), devido à desagregação mecânica com uma pipeta multicanal automatizado. Além disso, o processo é mais padronizado, minimiza a degradação de marcadores de superfície em diferentes células do estroma de nódulos linfáticos e permite a manipulação de mais de uma amostra ao mesmo tempo.

Colagenase IV e colagen...

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Discussão

O estudo das células do estroma dos nódulos linfáticos recentemente tornou-se um foco de investigação devido ao desenvolvimento de dois protocolos de digestão publicados ^6,13. Ambos os protocolos são adequados para obter único nó de linfa de células estromais, mas diferem na utilização de enzimas de digestão e tempo de digestão. Uma vez que as células estromais e seus marcadores de superfície são sensíveis à digestão enzimática e tensão mecânica, um protocolo optimizado é necessária. ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	LifeTechnologies-Gibco	41965-039
FCS			Final concentration 2%
CaCl2	Sigma	499609	Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation		>160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D	Roche	11088882001	use at 3.5 mg/ml
DNAse I	Roche	11284932001	use at 40 µg/ml
Stiring magnets	FAUST		5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml	Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function	IKA-RCT-standard	9720250
Petri dishes 100 mm, sterile	TPP	6223201
25 G needles	Terumo
anti mouse CD45 Ab	Biolegend		Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab	Biolegend		Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab	Biolegend		Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab	Biolegend		Clone MEC13.3
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel	Eppendorf	4861 000.821/830	1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a	Biolegend		Clone APA5
anti mouse CD80	Biolegend		Clone 16-10A1
anti mouse CD40	Biolegend		Clone 1C10
anti mouse I-Ab	Biolegend		Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)	Biolegend		Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit	Invitrogen	L10119