Индукция белка Удаление Через<em&gt; В утробе матери</em&gt; Электропорация Определить дефицит в миграции нейронов в трансгенных моделей

Резюме

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Аннотация

Генетическая удаление с помощью системы Cre-LOX в трансгенных линий мышей является мощным инструментом, используемым для изучения функции белка. Тем не менее, за исключением весьма конкретных моделей Cre, удаление белка в течение ткани или клеточной популяции часто приводит к сложным фенотипами, происходящими из нескольких взаимодействующих механизмов. Определения, является ли результаты фенотип от срыва автономного клеточного механизма, который присущ клетки в вопросе, или от автономного механизма предотвращения клеток, которые возникнут в результате обесценения внешней среды, клетки, может быть трудно различить. Чтобы получить представление о функции белка в контексте, в естественных условиях, в маточно электропорации (ИЭГ) позволяет делеции гена в небольшой группе клеток в развивающемся коры или какой-либо другой выбранной области головного мозга. ИЭГ может использоваться для решения конкретных проблем головного мозга, в том числе спинной конечного мозга, медиальной мозге, гиппокампе, или ганглионарной возвышения. Это облегчает наблюдения; ОF последствий клеток автономной делеции гена в контексте здоровую окружающую среду. Цель этого протокола заключается, чтобы показать, как ИЭГ может быть использована для анализа дефект в радиальном миграции в floxed трансгенной линии мышей, с акцентом на различия между клеток автономных и не клеточных автономных эффектов белка удаления. Сравнивая фенотип в результате делеции гена в пределах всей коре по сравнению с ИЭГ-опосредованной делеции гена в ограниченном клеточной популяции, более глубокое понимание функции белка в развитии мозга может быть получено, чем при использовании либо технику в изоляции.

Введение

Радиальная миграция является центральный процесс начале развития коры. Это зависит от различных клеточных автономных факторов, таких как правильный выход митотической и нейрональной дифференцировки, клеточной полярности, регулирование динамики цитоскелета и экспрессии трансмембранных рецепторов, а также не-клеточных автономных факторов, таких как формирование радиальной глии строительные леса и секреция миграционной руководством молекул ^1-3. С нарушением какого-либо из этих механизмов может привести к ухудшению миграцию нейронов в трансгенной мыши модели ^4-8, определения основную причину дефекта в миграции может быть сложным и трудным процессом. Внутриутробное электропорации (ИЭГ) могут быть использованы для дополнения и упрощения интерпретация фенотипа генетического плей-модели и тем самым выяснить важные механизмы, необходимые для радиального миграции ^7,9-11.

Внутриутробное электропорации (ИЭГ) является процесс, при котором плазмида лай нг как представляющий интерес ген и репортеру вводят в желудочек головного мозга мыши или крысы эмбриона, а затем втягивается в клетках, выстилающих желудочек через использование электрического тока ^12-14. Это позволяет исследователю проанализировать эффект вверх или вниз регулирования гена в развитии или функции электропорации нейронов. После ИЭГ, мозги могут быть обработаны для иммуногистохимии ^7,9-11, электрофизиологии ¹⁵ или культуре клеток ^16,17. Основным преимуществом является то, что МСЭ в позволяет высокой удельной манипуляции экспрессии генов. Кроме того, Институт экономики города могут быть использованы для нацеливания на определенную область развивающегося мозга через направленной тока (рис 2). ИЭГ также могут быть использованы для нацеливания на определенную тип клеток за счет инъекции плазмид, несущих гены под контролем различных промоторов или систем активации плазмиду (тетрациклин индуцированной экспрессии гена, является примером) ^10,18-21.

jove_content "> ИЭГ может быть использован в сочетании с Cre-LOX опосредованного генного вырезания системы ^7-9,11,22. плазмиду, содержащую ген, кодирующий сообщение для белка Cre может быть электропорации в эмбрион, гомозиготных по аллелю (floxed в котором ген или ДНК конкретных областей примыкают два LoxP участков для Cre опосредованной рекомбинации ДНК). Cre затем индуцируют рекомбинацию интересующего гена в частности, в электропорации нейронных предшественников, создавая нокаут в floxed allele.The эффекта нокдаун белка на нейронной миграции и развития в отдельных нейронов могут быть изучены. Электропорация Cre вызывает рекомбинацию лишь в небольшом населения пораженных клеток, в результате чего опорную среду неповрежденными. В противоположность этому, конкретные ткани экспрессия Cre под контролем специфического типа клеток промоутер, происходит в течение всей ткани так, чтобы обе мигрирующих нейробластов и окружающая среда могут быть затронуты. Таким образом, Juxtaposition из этих двух подходов не может определить, является ли данный миграция дефект в связи с клеточно-автономными или сотовые неавтономных механизмы. Неисправный миграция в обеих экспериментальных системах о том, что результаты наблюдений фенотипа от А автономной клеточного механизма; нормальным миграции следующие электропорации Cre с дефектной миграции в ткани конкретной модели Cre означает, что интерес ген действует через автономную механизма без клеток.

ИЭГ также может быть использован для выполнения аварийно-спасательных эксперименты по электропорации потенциальных взаимодействующих генов в выбивают животных ^7,9,10. Например, следователь может попытаться спасти миграции фенотип трансгенных модели, электропорации нисходящего цели и определения, если дефект миграции корректируется в электропорации нейронов. Это имеет дополнительное преимущество, что успешное спасение указывает, что нормальная миграция может быть восстановлено путем манипулирования экспрессию белка в спеспецифичны нейронов, даже если окружающая среда по-прежнему недостаточно для целевого гена. Опять же, этот подход требует больше времени и экономически эффективным, чем пересечение или получения трансгенных линий, с дополнительным преимуществом определения наличия дефектных механизм клеточной автономно.

ИЭГ может использоваться для отслеживания миграции нейронов путем электропорации репортерной плазмиды в выбить эмбрионов (фиг.4С). Как только нейроны, выстилающие желудочка во время операции подвергали электропорации ^17, ИЭГ может использоваться, чтобы следовать нейронов, рожденных в определенный момент времени с преимуществом визуализации их морфологии в естественных условиях.

Наконец, можно использовать МСЭ целевой области мозга, такие как медиальной или спинной конечного мозга, гиппокампе или Ганглионарный бугорок (рисунок 2). Это дает исследователям право расследовать функции гена в конкретной области, независимо от осложнений результатчисле из белка нокдаун в соседних структур.

Белок ретинобластомы (PRB), p107 и p130 составляют семейство карманных белков и хорошо зарекомендовали себя регуляторы выхода из клеточного цикла. Тем не менее, появляется все больше доказательств того, что эти белки регулируют также клеточного цикла независимых аспекты развития нервной системы. Как мы уже показала, НРБ и p107 играют решающую роль как в тангенциальном ^4,23 и радиально миграции ^6. Здесь мы демонстрируем роль карман белка члены семьи PRB и P107 на нервной миграции ⁶ для иллюстрации использования в утробе матери электропорации Cre в трансгенной модели. Таким образом, Институт экономики города обеспечивает мощный способ анализа клеток автономные эффекты делеции гена (или избыточной экспрессии). В сочетании с конкретной выбить модели ткани ИЭГ может предоставить дополнительную информацию о механизмах, контролирующих нейронной миграции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты были одобрены Университета по уходу за животными комитет по этике Оттавы, придерживаясь Руководящих принципов Канадского совета по уходу за животными.

1. Предоперационная подготовка и материалы

1. Плазмиды Приготовление:
   1. Подготовка плазмиды с помощью Qiagen Megaprep в соответствии с протоколом производителя. Инокуляции по крайней мере, 400 мл LB бульоне с трансформированных бактерий, чтобы обеспечить высокую доходность ДНК и инкубировать в течение ночи.
   2. Ресуспендируют в плазмиду 100-200 мкл ТЕ до конечной концентрации по меньшей мере 5 мкг / мкл. Аликвоты ДНК и хранить при -20 ° С. Если концентрация слишком низкая, не выпадают в осадок и ресуспендируют так как это может добавить примесей. Начните с нового препарата.
   3. Перед операцией, разбавленным единый плазмиды (CRE-GFP, например) с 2 мкг / мкл в стерильной воде с 1 мкл 0,1% (вес / объем) Fast Green красителя на 10 или 20 мкл разбавленного раствора плазмиды. Если GFPи представляющий интерес ген, должны быть совместно электропорации на отдельных плазмид, вводить GFP плазмиды и плазмиды, несущей ген интереса в соотношении 1: 4, чтобы максимизировать вероятность того, что все клетки, помеченные GFP которые совместно электропорации с обоими плазмиды.
2. Потяните стекло микрокапиллярных трубы (1 мм внешний диаметр - далее именуемые игл) на стандартной иглы съемник, используя один шаг глоток 62 ° C.
3. Автоклав хирургической пакет, содержащий следующие: иглодержатели, раневые втягивающее, щипцы, ножницы для хирургии, Ножницы для игл, степлер, скобы, марля, раны крышки, хирургические простыни (рис 1а, б; Материалы таблицу).
4. Соберите другие необходимые инструменты: электропоратора, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 или 7 мм), физиологический раствор, шов, 5 мл шприц (Материалы таблицу).

2. Подготовьте мышь для хирургии

1. Для обезболивания, вводят приурочен-рцарствующий мышь с бупренорфина (0,05 мг / кг массы тела) за один час до операции. Применить этот протокол для мышей, приуроченных где-то от эмбрионального день 12,5 (E12.5) до E17.5.
2. Используйте microloader наконечники для резервного нагрузка вытащил иглы с плазмидой решения. Не заполняйте всю дорогу в кончик иглы, но так как это вызовет игла забивается.
3. Анестезировать мыши, используя 2-5% ИФ газ с 1 л / мин O _2. После того, как неподвижный, место в маску и нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание. Вводят 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) подкожно в спину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с ИФ газа, использовать газ поглотитель вернуть излишки газа и предотвращения его утечки в комнату.
4. Бритье живота. Вымойте живот с Chlorohexadine скраб, промыть водой и обратиться окончательное подготовительную решение chlorohexadine и 70% этанола. Обложка мышь с стерильной драпировки или марлей, чтобы покрыть мех, но оставить живота подвергается (рис 1в, г).

3. Внутриутробное Электропорация

1. Сделайте надрез в коже на животе между нижними сосками. Потяните кожу от нижележащего слоя мышц, оторвав соединительной ткани, а затем вырезать через брюшину в брюшную полость по белой линии. Вставьте раны втягивающего тянуть края раны друг от друга.
2. Удалить матку из брюшной полости и положите его, как показано (рис 1E).
   1. Если разные щенки, который будет введен с различными плазмидами (например, GFP против GFP с интересующего гена), кол щенков на каждой стороне, и решить, какие и сколько вводить с каждой плазмиды. Заменить одну сторону матки обратно в брюшную полость, чтобы сохранить эмбрионов тепло и смазкой. Сразу увлажнить подвергается матки насыщенным раствором соли (предпочтительно нагревают до температуры тела).
   2. Если все инъекционных щенков с одной и той же плазмиды (например, при введении Cre-GFP в трансгенных эмбрионов) ONLу удалить один рог матки одновременно.
3. Положите заряженное иглу в тисках главы впрыска палочки и аккуратно вырезать наконечник с парой небольших хирургических ножниц или тонким пинцетом. Вырезать наконечник так, чтобы игла остается до тех пор, насколько это возможно, все еще ​​позволяя жидкости проходить через (фиг 1Ji-IV).
   1. Отрегулируйте длину инъекции (в секундах) и давление впрыска на microinjector так, что маленький, но хорошо видна капелька 0,1-0,2 мкл на кончике иглы появляется при нажатии ногой весло. Держите объем этой капли как можно более последовательными между различными иглами.
      Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для выживания эмбриона (см обсуждение).
   2. Используйте следующие параметры впрыска для FemtoJet: инъекционных давление (Pi) = 250-300 кПа; Время впрыска (TI) = 0,8-1,2 сек; компенсации давления = 10-50 гПа. Если требуется, настройте эти параметры, чтобы приспособить различия между иглами.
4. Sвыбрать эмбрион и аккуратно поместите его на спину, голова наклонена вверх (рис 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребовать поворота или сдвига эмбриона; будьте осторожны, чтобы не применять слишком много давления и избежать разрыва амниотической манипулируя эмбриона.
5. После того, как эмбрион находится в месте, найти желудочек, который представляет как форме полумесяца теневой параллельно сагиттальной пазухи. Сенсорный кончике иглы к вышеуказанному желудочка матки под небольшим углом и вести иглу через стенку матки. Количество требуемого давления зависит от остроты иглы. Введите иглу через кору в желудочек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что редко какая-либо дополнительная обнаружить сопротивление, глава эмбриона часто оттолкнул немного, а затем отскакивает, как игла проходит через кору в желудочек.
6. Насос ножной весло, чтобы придать плазмиды решение. Продолжайте качать до тех пор, зеленая зона не видно и соответствуетдуги форма желудочка (рис 1G). У молодых эмбрионов (E12.5 к E14.5) краситель часто диффундируют в противоположной желудочка.
   Примечание: число насосов зависит от диаметра кончика иглы, возраст эмбриона (и в результате размера желудочка) и требуемого объема впрыска. Держите объем вводят как можно более последовательными между эмбрионов.
7. Подайте три или четыре эмбрионов. Держите все открытые эмбрионов влажные физиологическим раствором в течение процедуры.
8. Перейти к первым эмбрионов инжектированных и разместить таким образом, чтобы лопасти положительный электрод привлечет плазмиды в желаемой области мозга (фиг 1H). Угол отрицательный электрод, так что самый короткий путь между электродами проходит непосредственно через структуры, подлежащего электропорации (рисунок 2).
9. После того, как весла на месте, применять шок. В зависимости от возраста и размера эмбрионов, использовать 5 импульсов 35-50 V (см Tвозможность 1). Используйте следующие параметры электропорации: длительность импульса 5 мс с интервалом импульса 950 мс. Повторите со всеми вводили эмбрионов.
10. Отрежьте кончик новой предварительно загруженным иглы, как в шаге 3,3 в качестве последнего иглы вероятно, сушат и забитой на этапе 3.9. Подайте следующий набор из трех или четырех эмбрионов с или же плазмиды или иной плазмиды, а затем применить шок, как в шаге 3.9. Когда все щенки в одну сторону матки вводят, удалите вторую сторону матки от самки живот, а затем заменить заполненную сторону, чтобы сохранить его теплым.
11. Вернуться обе стороны матки самке будьте осторожны, чтобы поверхность влажной физиологическим раствором и не применять слишком много давления, чтобы предотвратить травмы амниотической мешков. Шов мышечный слой закрывается с помощью простой непрерывный шов. Скоба кожи закрыты. Если скобки нет, зашить кожу с простым прерванной строчки. (Рис 1I)
12. В то время как suturiнг, постепенно отказаться от изофлурана, чтобы позволить беременной самки анестезия, чтобы облегчить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит ускорить возбуждение плотины после операции завершена; держать самку под наркозом в течение минимального времени, как это возможно улучшит выживаемость эмбрионов. Общее время операции, начиная с момента, когда женщина сначала анестезировали, должно быть примерно 30 мин.

4. Последующий уход

1. Поместите пришивать женщина в инкубаторе или на грелку, чтобы оправиться от наркоза. Постельное ее на чистое постельное белье и разместить стандартный гель для восстановления в клетке поддержания гидратации. Для лечения боли после операции, дают женщин три дозы бупренорфина (0,05 мг / кг массы тела) в 8 ч интервалами после операции, затем четыре дополнительных доз в 12 ч интервалами.

5. Сбор Мозги

ПРИМЕЧАНИЕ: Мозги могут быть собраны в любом возрасте до взрослой жизни. Относитсядля сбора мозги до рождения. Отметим, что после рождения щенков, порядок в матке теряется, так как каждый щенок в помете должны быть введены с той же плазмиды или другой метод дифференцирования между контрольными и подопытными животными должны быть разработаны.

1. Приготовления холодных (4 ° С), фильтруют 4% параформальдегида (PFA) до эвтаназии женщины.
2. Эвтаназии женщина с помощью внутрибрюшинного введения смертельной дозы фенобарбитала натрия (100 мг / кг массы тела) и разрезать живот. Вытяните обе стороны матки и заложить, как и при щенков были первоначально введены.
   1. В случае, когда все щенки получили плазмиду же, например, при введении в Cre трансгенных помета, для того эмбрион не имеет значения, поэтому вырезать матку из самки и поместить в PBS.
   2. Если щенки были введены с различными плазмидами, необходимо локализовать каждый щенка, отметив, мертвые щенков, и определить, какие из них были введены с управлением и экспериментальTal плазмиды до удаления матки от женского. Будьте осторожны, чтобы отслеживать, какие щенок принадлежит к какой группе после матка в PBS.
3. Удалите каждую щенка индивидуально, обезглавить с острыми ножницами или лезвием бритвы и поместить голову в PBS. В случае трансгенных мышей, собирают образцы ткани для генотипирования и держать голову каждый по отдельности, например, в 12-луночный планшет.
4. При вскрытии рамки, извлечь мозг из черепа, стараясь не повреждая кору или оторвать от средней линии. Использование флуоресцентного микроскопа, убедитесь в том, мозги есть GFP + патч, указывая, что они были электропорации успешно.
5. Исправить мозги погружением в PFA при 4 ° С в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте мозги для выражения GFP до фиксации с PFA часто гасит сигнал.
6. Cryoprotect мозги через погружение в 20% сахарозы, по крайней мере, трех дней до замерзания. Использование градиенте сахарозы в 10%, 15% и 20% (24 ч в каждом растворе) тО предотвратить повреждение тканей вследствие осмотического давления. Хранить замороженные мозги при -80 ° С и нарезать на криостате при 10-14 мкм секций.

6. Сотрудничество окрашивание анти-GFP

ПРИМЕЧАНИЕ: Если поиск антиген необходимо в целях координации пятно с анти-GFP, важно использовать нежное антиген извлечения протокол, который не идет на компромисс сигнал GFP. Некоторые протоколы поисковые антиген слишком жесткими для использования в сочетании с окрашиванием GFP (даже с антителом против GFP). Основной лимонной кислоты предварительной обработки перед нанесением первичных антител является успешным для большинства эпитопов ^24.

1. Сделайте 0,01 М раствор лимонной кислоты в DDh ₂ O. рН до 6 с помощью калиброванного рН-метра.
2. Тепло лимонной кислоты в окрашивания камеры в микроволновой печи или на водяной бане до лимонной кислот достигает 75-80 ° C. Положите слайды в окрашивания камере в течение 10-15 мин. Поддерживать температуру как можно более стабильным.
3. Вымойте слайдов в PBS3x в течение 3 мин при комнатной температуре. Применение первичное антитело, и приступить к иммунным окрашиванием в соответствии со стандартным протоколом.
4. Проверка Cre опосредованной удаление СО-маркировки для GFP и гена, чтобы подтвердить сбить (фиг.3А).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo’s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Два из основных проблем при выполнении внутриутробному electroporations являются: 1) предотвращение эмбриона летальность 2) уменьшения изменчивости между electroporations. Одним из наиболее важных факторов в предотвращении летальность качество иглы, как тупые иглы нанести больший ущерб эмбрион?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square Wave Electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0211	Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm)	Platinum forcep style electrodes
Femtojet	Eppendorf	920010504	Microinjector
Griphead 0	Eppendorf	920007414	Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder	Eppendorf	920007392	Connects griphead to tube
Injection Tube	Eppendorf	920007431	Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control	Eppendorf	920005098	Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips	Eppendorf	930001007	Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit	Qiagen	12181	5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G	Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14084-09
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Straight
Colibri Retractors	Fine Science Tools	17000-03
Stapler	Fine Science Tools	12031-07	For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder	Medical Tools	SNH-6737	Straight, with lock
Needle Puller	Narishige	PC-10	For pulling microcappillaries
Microcapillaries	Drummond	1-000-800	0.4 mm inner diameter glass capillary tubes