Indução da Eliminação Proteína Através<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação para definir défices de Migração Neuronal em modelos transgênicos

Resumo

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Resumo

Deleção genética utilizando o sistema Cre-Lox em linhas de camundongos transgênicos é uma poderosa ferramenta usada para estudar a função da proteína. No entanto, exceto nos modelos Cre muito específicos, a eliminação de uma proteína em toda uma população tecido ou célula muitas vezes leva a fenótipos complexos resultantes de múltiplos mecanismos de interação. A determinação de se um fenótipo resultados de ruptura de um mecanismo autónomo célula, o que é intrínseco à célula em questão, ou a partir de um mecanismo autónomo não-célula, o que resulta do prejuízo do ambiente da célula que, pode ser difícil de discernir. Para se conhecer a função da proteína num contexto in vivo, in utero electroporação (IUE) permite que a deleção do gene em um pequeno subconjunto de células dentro do córtex desenvolvimento ou alguma outra região do cérebro seleccionado. IUE podem ser utilizados para visar áreas específicas do cérebro, incluindo o telencéfalo dorsal, telencéfalo medial, hipocampo, ou eminência ganglionar. Esta observação facilita of as consequências da deleção do gene da célula autônoma no contexto de um ambiente saudável. O objetivo deste protocolo é para mostrar como IUE pode ser usado para analisar um defeito na migração radial em uma linha de camundongo transgênico floxed, com ênfase na distinção entre os celulares efeitos autônomos autónomos e não celulares de eliminação de proteína. Ao comparar o fenótipo resultante da deleção do gene dentro de todo o córtex contra deleção do gene da IUE mediada por uma população de células limitado, um maior conhecimento sobre a função da proteína no desenvolvimento do cérebro do que pode ser obtido utilizando qualquer técnica de isolamento.

Introdução

Migração radial é um processo fundamental para o desenvolvimento cortical precoce. Ele depende de uma variedade de factores celulares autónomos, tais como saída correcta mitótico e diferenciação neuronal, da polaridade celular, regulação da dinâmica do citoesqueleto e expressão de receptores transmembranares, bem como não-celulares factores autónomos, tais como a formação do andaime glial radial e secreção de orientação migratória moléculas ^1-3. Uma vez que a interrupção de qualquer destes mecanismos pode prejudicar a migração neuronal num modelo de ratinho transgénico ^4-8, determinando a causa subjacente a um defeito na migração pode ser um processo complexo e difícil. No útero electroporação (IUE) pode ser utilizado para complementar e simplificar interpretação do fenótipo de um modelo genético de knock-out e assim elucidar mecanismos importantes necessários para a migração radial ^7,9-11.

No útero electroporação (IUE) é o processo pelo qual um plasmídeo carryi ng tanto um gene de interesse e um repórter é injectado no ventrículo do cérebro de um embrião de ratinho ou de rato e, em seguida, arrastada para as células que revestem o ventrículo através da utilização de uma corrente eléctrica ^12-14. Isto permite ao investigador para analisar o efeito de cima ou para baixo regulação de um gene de interesse no desenvolvimento ou função de neurónios electroporadas. Seguindo IUE, cérebros podem ser processados ​​por imuno-histoquímica ^7,9-11, eletrofisiologia ¹⁵ ou cultura celular ^16,17. A principal vantagem da IUE é que permite a manipulação é altamente específica da expressão do gene. Além disso, IUE pode ser utilizado como alvo uma região específica do cérebro em desenvolvimento por meio de uma corrente dirigida (Figura 2). IUE também pode ser utilizado para atingir um tipo de célula específico através da injecção de plasmídeos que transportam os genes sob o controle de diferentes promotores ou sistemas de activação plasmídeo (expressão do gene da tetraciclina é induzido um exemplo) ^10,18-21.

jove_content "> IUE pode ser usado em conjunto com o sistema de excisão de genes mediada por Cre-Lox ^7-9,11,22. Um plasmídeo contendo um gene que codifica a mensagem para a proteína Cre pode ser electroporada em um embrião homozigótica para o alelo floxed ( em que as regiões do gene ou ADN específicas estão flanqueados por dois locais loxP para recombinação de ADN mediada Cre). Cre irão então induzir a recombinação do gene de interesse, especificamente em precursores neuronais electroporadas, gerando um knock-out do efeito de floxed allele.The proteína knockdown sobre migração e desenvolvimento dentro dos neurônios individuais neural pode então ser estudado. Eletroporação de Cre induz recombinação em apenas uma pequena população de células afetadas, deixando o ambiente de suporte intacta. Em contraste, a expressão tecido específico de Cre sob o controle de um tipo específico de célula promotor, ocorre ao longo de todo o tecido, de modo que ambos os neuroblastos migram e o ambiente circundante poderia ser afectada. Assim, juxtaposition dessas duas abordagens podem determinar se um determinado defeito migração é devido à célula mecanismos não-autónomos autônomos ou celulares. Migração com defeito em ambos os sistemas experimentais sugerem que o fenótipo resultados observados de um mecanismo autônomo celular; migração normal após a electroporação de Cre com migração defeituoso em um modelo Cre específica para tecidos indica que o gene de interesse está a actuar através de um mecanismo autónomo não-célula.

IUE também pode ser usado para realizar experimentos de resgate por electroporating potenciais genes que interagem em knock out animais ^7,9,10. Por exemplo, um investigador poderia tentar recuperar um fenótipo migração num modelo transgénico por electroporating um alvo a jusante e determinar se o defeito de migração é corrigida nos neurónios electroporadas. Isto tem a vantagem adicional de que um resgate com êxito indica que a migração normal pode ser restaurada através da manipulação de expressão de proteína numa specas neurónio, embora o ambiente circundante é ainda deficiente para o gene alvo. Mais uma vez, esta abordagem é mais tempo e de custo eficaz do que cruzar ou a geração de linhagens transgênicas, com o benefício adicional de determinar se o mecanismo defeituoso é célula autônoma.

IUE pode ser usado para controlar a migração de neurónios através de electroporação de um plasmídeo repórter em knock out embriões (Figura 4C). Como apenas os neurónios que revestem o ventrículo no momento da cirurgia são electroporadas ^17, IUE pode ser usado para seguir os neurónios carregados em um momento específico, com a vantagem da visualização da sua morfologia in vivo.

Finalmente, é possível utilizar IUE alvo regiões do cérebro tais como o telencéfalo ou medial dorsal, hipocampo ou eminência ganglionar (Figura 2). Isso dá aos pesquisadores o poder de investigar a função do gene em um independente de complicações resultado específico áreaPasso da proteína knockdown em estruturas vizinhas.

Proteína do retinoblastoma (pRb), p107 e p130 compreendem a família de proteínas de bolso e são bem reguladores de saída do ciclo celular estabelecida. No entanto, há evidências crescentes de que estas proteínas regulam também aspectos independentes do ciclo celular de desenvolvimento neural. Como mostramos anteriormente, pRb e p107 desempenham um papel crucial em ambos tangencial ^4,23 e migração radial ^6. Aqui, demonstramos o papel da proteína de bolso pRb e membros da família p107 sobre a migração neuronal ⁶ para exemplificar o uso de electroporação in utero de Cre num modelo transgénico. Em resumo, IUE fornece uma maneira poderosa de analisar os efeitos de células autônomas de deleção do gene (ou sobre-expressão). Quando combinado com tecido específico nocautear modelos, IUE pode fornecer informações adicionais sobre os mecanismos que controlam a migração neural.

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Protocolo

NOTA: Todos os experimentos foram aprovados pela University of Animal Care comissão de ética de Ottawa, aderindo às Diretrizes da Canadian Council on Animal Care.

Preparação 1. Pré-cirúrgico e de Materiais

1. O plasmídeo Preparação:
   1. Prepare plasmídeos utilizando o Qiagen Megaprep de acordo com o protocolo do fabricante. Innoculate, pelo menos, 400 ml de caldo LB com bactérias transformadas de assegurar um rendimento elevado de DNA e incubar durante a noite.
   2. Ressuspender o plasmídeo em 100-200 ul de TE a uma concentração final de, pelo menos, 5 mg / mL. DNA Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Se a concentração for demasiado baixa, não se precipitam e ressuspender como este pode adicionar impurezas. Começar de novo com uma nova preparação.
   3. Antes da cirurgia, diluir um único plasmídeo (Cre-GFP por exemplo) a 2 mg / mL em água estéril com 1 ml de 0,1% (w / v) de corante Verde Rápido por 10 ou 20 ul de solução diluída de plasmídeo. Se GFPe o gene de interesse está a ser co-electroporados em plasmídeos separados, injectar o plasmídeo GFP e o plasmídeo que transporta o gene de interesse a uma razão de 1: 4 para maximizar a probabilidade de que todas as células marcadas com GFP, são co-electroporado com ambos plasmídeos.
2. Puxe tubos microcapilares de vidro (diâmetro exterior 1 mm - doravante referidas como agulhas) em um extrator de agulha padrão, usando um único passo de puxar a 62 ° C.
3. Autoclave um bloco cirúrgico contendo o seguinte: porta-agulhas, afastador de feridas, fórceps, tesouras para a cirurgia, tesouras para agulhas, grampeador, grampos, gaze, tampas de feridas, campos cirúrgicos (Figura 1a, b; Materials Table).
4. Colete outras ferramentas necessárias: electroporador, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 ou 7 mm), soro fisiológico, sutura, seringa de 5 ml (Materials Table).

2. Prepare-Rato para Cirurgia

1. Para o manejo da dor, injetar a-p cronometradorato reinante com buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) uma hora antes da cirurgia. Aplicar este protocolo para ratos cronometrados em qualquer lugar a partir de dia embrionário 12,5 (E12.5) para E17.5.
2. Use Microloader pontas de pipeta de back-carga tracionada agulhas com a solução de plasmídeo. Não encher todo o caminho para a ponta de agulha ainda como isso vai fazer com que a agulha fique obstruída.
3. Anestesie rato usando 2-5% de isoflurano gás com 1 L / min _{de O2.} Uma vez imóvel, colocar na máscara de rosto e aplicar pomada para os olhos para evitar a secagem. Injectar com 1 ml de solução salina (NaCl a 0,9%) por via subcutânea nas costas.
   NOTA: Quando se trabalha com gás isoflurano, utilize um limpador de gás para recapturar o excesso de gás e evitar que ele escape para o quarto.
4. Shave abdômen. Lave abdômen com Chlorohexadine matagal, lave com água e aplicar uma solução final prep de chlorohexadine e etanol 70%. Rato Cubra com cortina estéril ou gaze para cobrir a pele, mas deixe abdômen exposto (Figura 1C, D).

3. No útero Electroporation

1. Realizar uma incisão na pele ao longo do abdómen entre os bicos inferiores. Puxe a pele para longe da camada muscular subjacente ao rasgar o tecido conjuntivo, em seguida, cortado através do peritoneu para dentro da cavidade abdominal ao longo da linha alba. Inserir o afastador de ferida para puxar os bordos da ferida separados.
2. Retirar o útero da cavidade abdominal e colocá-lo para fora, como mostrado (Figura 1E).
   1. Se os filhotes são diferentes para ser injectados com diferentes plasmídeos (tal como GFP contra GFP com o gene de interesse), contar as crias de cada lado e decidir quais e quantos injectar cada plasmídeo. Substituir um lado do útero de volta para o abdómen para manter os embriões quente e lubrificado. Imediatamente humedecer o útero exposto com solução salina (de preferência aquecida até à temperatura do corpo).
   2. Se a injecção todos os filhotes com o mesmo plasmídeo (tal como quando se injecta Cre-GFP em embriões transgénicos) only remover um chifre do útero de uma vez.
3. Coloque uma agulha colocado na cabeça aderência da varinha de injeção e corte cuidadosamente a ponta com um par de pequenas tesouras cirúrgicas ou uma pinça fina. Cortar o bico de modo que a agulha permanece tanto tempo quanto possível, enquanto ainda permite que o fluido passe através de (Figura 1Ji-iv).
   1. Ajustar o comprimento de injecção (em segundos) e a pressão de injecção na microinjector de modo que uma pequena gotícula ainda facilmente visível de 0,1-0,2 uL aparece na ponta da agulha quando o pé de pá é pressionado. Mantenha o volume deste gota tão consistente quanto possível entre diferentes agulhas.
      Nota: Esta etapa é crucial para a sobrevivência dos embriões (ver discussão).
   2. Utilize os seguintes parâmetros de injeção para o FemtoJet: injetar pressão (pi) = 250-300 hPa; tempo de injecção (ti) = 0,8-1,2 segundos; pressão de compensação = 10-50 hPa. Se necessário, ajustar estes parâmetros para acomodar variações entre as agulhas.
4. Seleger um embrião e posicione-o com cuidado em suas costas, a cabeça inclinada para cima (Figura 1F).
   NOTA: Isso pode exigir virar ou mudar o embrião; ter cuidado para não aplicar muita pressão e evitar a ruptura do saco amniótico ao manipular o embrião.
5. Uma vez que o embrião está no lugar, localizar o ventrículo, que se apresenta como uma forma de crescente sombra paralelo para o seio sagital. Toque a ponta da agulha para o útero acima do ventrículo em um pequeno ângulo e guiar a agulha através da parede uterina. A quantidade de pressão necessária depende da agudeza da agulha. Empurre a agulha através do córtex para o ventrículo.
   NOTA: Embora raramente há qualquer resistência detectável adicional, a cabeça do embrião é, muitas vezes se afastou um pouco e depois recua quando a agulha passa pelo córtex para o ventrículo.
6. Bombear o pé remo para injectar a solução plasmídeo. Continue a bombear até a área verde é visível e está em conformidade com oforma de arco do ventrículo (Figura 1G). Em embriões jovens (E12.5 a E14.5) o corante muitas vezes difundem-se para o ventrículo contralateral.
   NOTA: O número de bombas depende do diâmetro da ponta da agulha, a idade do embrião (e resultante tamanho do ventrículo) e o volume de injecção desejado. Mantenha o volume injetado o mais consistente possível entre embriões.
7. Injectar três ou quatro embriões. Mantenha todos os embriões expostos úmidos com solução salina durante todo o procedimento.
8. Volte para os primeiros embriões injetados e colocar as pás de tal forma que o eletrodo positivo vai chamar o plasmídeo para a região desejada do cérebro (Figura 1H). Ângulo do eléctrodo negativo, de modo que o caminho mais curto entre os eléctrodos passa directamente através da estrutura de alvo para electroporação (Figura 2).
9. Uma vez que as pás estão em vigor, aplicar o choque. Dependendo da idade e do tamanho dos embriões, utilizar 5 pulsos de 35-50 V (ver T1 capaz). Utilize os seguintes parâmetros eletroporação: comprimento de pulso de 5 ms com um intervalo de pulso de 950 ms. Repita o procedimento com todos os embriões injetados.
10. Corte a ponta da agulha nova pré-carregado como no passo 3.3 como a última agulha provável seca e obstruído durante a etapa 3.9. Injectar o próximo conjunto de três ou quatro embriões quer com o mesmo plasmídeo ou num plasmídeo diferente e, em seguida, aplicar o choque como no passo 3.9. Quando todos os filhotes em um dos lados do útero são injetados, remova o segundo lado do útero do abdome da fêmea e, em seguida, substituir o lado preenchido para mantê-lo aquecido.
11. E volta de ambos os lados do útero para a fêmea tendo o cuidado de manter a superfície húmida com solução salina e não aplicar demasiada pressão para impedir o trauma para os sacos amnióticas. Suturar a camada muscular fechado meio de sutura contínua simples. Staple a pele fechada. Se os grampos não estão disponíveis, a sutura da pele com uma costura simples interrompido. (Figura 1I)
12. Enquanto suturing, transformar progressivamente para baixo o isoflurano para anestesia da fêmea grávida a clarear.
    NOTA: Isto irá acelerar a excitação da barragem após a cirurgia está completa; mantendo a fêmea anestesiados por um tempo tão curto quanto possível irá melhorar a sobrevivência dos embriões. Tempo total de operação, a partir de quando a fêmea é anestesiada em primeiro lugar, deve ser de aproximadamente 30 minutos.

4. Cuidados posteriores

1. Coloque a fêmea suturado numa incubadora ou numa almofada de aquecimento para recuperar da anestesia. Cama-la na cama limpa e coloque um gel padrão de recuperação na gaiola manter a hidratação. Para o manejo da dor após a cirurgia, as fêmeas dão três doses de buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) em 8 intervalos h após a cirurgia, em seguida, quatro doses adicionais em intervalos de 12 h.

5. Brains Colhendo

NOTA: Brains pode ser colhida em qualquer idade até a idade adulta. O seguinte diz respeitopara a recolha de cérebros antes do nascimento. Note-se que uma vez que os filhotes nascem, a ordem dentro do útero está perdido, por isso ou cada filhote da ninhada deve ser injetado com o mesmo plasmídeo, ou outro método de diferenciação entre controle e animais experimentais deve ser concebido.

1. Prepare a frio (4 ° C), filtrou-se 4% de paraformaldeído (PFA) antes da eutanásia fêmea.
2. Eutanásia da fêmea utilizando uma injecção intraperitoneal de uma dose letal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg de peso corporal) e cortar abdómen aberto. Retire ambos os lados do útero e colocar para fora como quando filhotes foram inicialmente injetada.
   1. No caso em que todas as crias receberam o mesmo plasmídeo, tal como quando se injecta Cre em uma ninhada transgénicos, a fim de embriões não é importante, por conseguinte, reduzir o útero para fora do local e fêmea em PBS.
   2. Se os filhotes foram injetados com diferentes plasmídeos, certifique-se de localizar cada filhote, anotando todos os filhotes mortos, e determinar quais foram injetados com controle e experimenplasmídeos Tal antes de remover o útero da fêmea. Tenha cuidado para manter o controle de quais filhote pertence a qual grupo após o útero está em PBS.
3. Retire cada filhote individualmente, decapitar com uma tesoura afiada ou uma lâmina de barbear e colocar a cabeça no PBS. No caso de ratinhos transgénicos, recolher amostras de tecido para a genotipagem e manter cada cabeça separado, tal como em uma placa de 12 poços.
4. De acordo com um escopo de dissecação, remover o cérebro do crânio, tomando cuidado para não nick o córtex ou rasgar a linha média. Usando um microscópio de fluorescência, verificar para ver se o cérebro tem um GFP + patch, indicando que eles foram electroporados com sucesso.
5. Fix cérebros por imersão em PFA a 4 ° C durante a noite.
   NOTA: Verifique cérebros para a expressão de GFP antes da fixação desde PFA frequentemente sacia o sinal.
6. Cryoprotect cérebros através de imersão em 20% sacarose durante pelo menos três dias antes da congelação. Usar um gradiente de sacarose de 10%, 15% e 20% (24 h em cada solução) to evitar danos nos tecidos devido à pressão osmótica. Armazenar cérebros congelados a -80 ° C e cortado num criostato a 10-14 mm de espessura.

6. Co-coloração com anti-GFP

NOTA: Se a recuperação do antígeno é necessário de modo a co-mancha com anti-GFP, é importante o uso de um protocolo de recuperação do antigénio suave que não comprometa o sinal GFP. Alguns protocolos de recuperação antigênica são muito duras para usar em conjunto com a coloração GFP (mesmo com um anticorpo contra GFP). Um ácido cítrico de base pré-tratamento antes da aplicação do anticorpo primário é bem sucedido para a maioria dos epitopos ^24.

1. Adicione uma solução de ácido cítrico em ddH ₂ O. 0,01 M para pH 6 utilizando um medidor de pH calibrado.
2. Ácido cítrico calor na câmara de coloração no microondas ou banho-maria até ácidos cítrico atinge 75-80 ° C. Coloque as lâminas em câmara de coloração para 10-15 min. Manter a temperatura tão estável quanto possível.
3. Lavar as lâminas em PBS3x durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aplicar o anticorpo primário e prosseguir com a imunocoloração de acordo com um protocolo padrão.
4. Validate Cre excisão mediada por co-rotulagem para GFP e o gene de interesse para confirmar derrubar (Figura 3A).

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Resultados

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo’s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

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Discussão

Dois dos principais desafios na realização em electroporations útero são: 1) prevenção de mortalidade do embrião e 2) diminuir a variabilidade entre electroporations. Um dos fatores mais importantes na prevenção de letalidade é a qualidade da agulha, como agulhas grossas infligir mais danos ao embrião. Quando o corte da agulha, de manter a ponta tanto tempo quanto possível, enquanto que permite ainda uma gota visível de 0,1-0,2 uL de fluido apareça na sequência de uma bomba do pé da pá...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square Wave Electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0211	Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm)	Platinum forcep style electrodes
Femtojet	Eppendorf	920010504	Microinjector
Griphead 0	Eppendorf	920007414	Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder	Eppendorf	920007392	Connects griphead to tube
Injection Tube	Eppendorf	920007431	Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control	Eppendorf	920005098	Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips	Eppendorf	930001007	Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit	Qiagen	12181	5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G	Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14084-09
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Straight
Colibri Retractors	Fine Science Tools	17000-03
Stapler	Fine Science Tools	12031-07	For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder	Medical Tools	SNH-6737	Straight, with lock
Needle Puller	Narishige	PC-10	For pulling microcappillaries
Microcapillaries	Drummond	1-000-800	0.4 mm inner diameter glass capillary tubes