L&#39;induzione di proteine ​​Cancellazione Through<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione per definire deficit in migrazione neuronale in modelli transgenici

Riepilogo

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Abstract

Delezione genetica utilizzando il sistema Cre-Lox in linee di topi transgenici è un potente strumento utilizzato per studiare la funzione della proteina. Tuttavia, salvo in modelli molto particolari Cre, la cancellazione di una proteina in tutta una popolazione di tessuti o cellule, spesso conduce a fenotipi complessi derivanti da molteplici meccanismi che interagiscono. Determinare se un fenotipo risultati di interruzione di un meccanismo autonomo cella, che è intrinseco alla cella in questione, o da un meccanismo autonomo non cellule, che risulterebbe dal deterioramento dell'ambiente di quella cella, possono essere difficili da distinguere. Per ottenere una visione in funzione delle proteine ​​in un contesto in vivo, in utero elettroporazione (IUE) consente di eliminare gene in un piccolo sottogruppo di cellule all'interno della corteccia in via di sviluppo o di qualche altra regione del cervello selezionata. IUE può essere utilizzato per indirizzare specifiche aree cerebrali, tra cui il telencefalo dorsale, telencefalo mediale, ippocampo, o eminenza gangliare. Questo facilita l'osservazione of conseguenze della cella gene delezione autonoma nel contesto di un ambiente sano. Lo scopo di questo protocollo è quello di mostrare come IUE può essere utilizzato per analizzare un difetto nella migrazione radiale in una linea di topi transgenici floxed, con un'enfasi sulla distinzione tra le cellule effetti autonomi autonomi e non cellulari di delezione della proteina. Confrontando il fenotipo risultante dall'eliminazione gene nell'intera corteccia contro gene delezione IUE mediata in una popolazione di cellule limitata, una maggiore comprensione della funzione delle proteine ​​nello sviluppo cerebrale può essere ottenuto che utilizzando due tecniche in isolamento.

Introduzione

Migrazione Radial è un processo fondamentale per primo sviluppo corticale. Essa dipende da una varietà di fattori cellulari autonomi, come uscita corretta mitosi e la differenziazione neuronale, polarità cellulare, regolazione della dinamica del citoscheletro e l'espressione dei recettori transmembrana, così come non-cellulari fattori autonomi, come la formazione del ponteggio gliali radiali e secrezione di orientamento migratorio molecole ^1-3. Poiché rottura di uno di questi meccanismi può compromettere migrazione neuronale in un modello di topo transgenico ^4-8, determinare la causa di fondo di un difetto di migrazione può essere un processo complesso e difficile. In utero elettroporazione (IUE) può essere utilizzato per integrare e semplificare interpretazione del fenotipo di un modello knock-out genetico e quindi chiarire i meccanismi importanti necessari per la migrazione radiale ^7,9-11.

In utero elettroporazione (IUE) è il processo mediante il quale un carryi plasmide ng sia un gene di interesse e un reporter viene iniettato nel ventricolo nel cervello di un topo o ratto embrionale e quindi trascinato nelle cellule che rivestono il ventricolo attraverso l'uso di una corrente elettrica ^12-14. Questo permette al ricercatore di analizzare l'effetto di alto o in basso regolazione di un gene di interesse per lo sviluppo o la funzione dei neuroni elettroporate. Dopo IUE, il cervello possono essere trattati per immunoistochimica ^7,9-11, elettrofisiologia ¹⁵ o coltura cellulare ^16,17. Il principale vantaggio di IUE è che si permette la manipolazione altamente specifica dell'espressione genica. Inoltre, IUE può essere utilizzato per mirare ad una regione specifica del cervello sviluppo attraverso una corrente diretta (Figura 2). IUE può anche essere utilizzato per mirare ad un tipo di cellula specifico mediante iniezione di plasmidi che trasportano geni sotto il controllo di vari promotori o sistemi di attivazione plasmide (tetraciclina indotta l'espressione del gene è un esempio) ^10,18-21.

jove_content "> IUE può essere utilizzato in combinazione con il sistema di escissione gene mediato Cre-Lox ^7-9,11,22. Un plasmide contenente un gene che codifica il messaggio per la proteina Cre può essere elettroporate in un embrione omozigote per l'allele floxed ( in cui le regioni del gene o DNA specifico sono fiancheggiate da due siti loxP per Cre mediata ricombinazione DNA). Cre quindi indurrà ricombinazione del gene di interesse specifico dei precursori neuronali elettroporate, generando un knock-out della floxed allele.The effetto proteine ​​atterramento sulla migrazione neuronale e lo sviluppo all'interno dei singoli neuroni può essere studiata. elettroporazione di Cre induce ricombinazione in solo una piccola popolazione di cellule colpite, lasciando intatto l'ambiente di supporto. Al contrario, l'espressione tessuto specifico di Cre sotto il controllo di un tipo di cellula specifico promotore, si verifica durante tutto il tessuto in modo che entrambi neuroblasti migrano e l'ambiente circostante potrebbero essere influenzate. Pertanto, juxtaposition di questi due approcci può determinare se una data difetto di migrazione è dovuta alla cella meccanismi non autonomi autonomi o cellulari. Migrazione difettoso in entrambi i sistemi sperimentali suggeriscono che i risultati fenotipo osservati da un meccanismo autonomo di cellule; migrazione normale dopo elettroporazione di Cre migrazione difettoso in un modello specifico Cre tessuto indica che il gene di interesse agisce attraverso un meccanismo autonomo non-cellula.

IUE può anche essere usato per eseguire esperimenti di soccorso da electroporating potenziali geni interagiscono in knock out animali ^7,9,10. Ad esempio, un ricercatore potrebbe tentare di salvare un fenotipo migrazione in un modello transgenico da electroporating un bersaglio a valle e determinare se il difetto di migrazione viene corretto in neuroni elettroporate. Questo ha il vantaggio aggiuntivo che un salvataggio di successo indica che la migrazione normale può essere ripristinato manipolando l'espressione della proteina in una specifica neurone, anche se l'ambiente circostante è ancora carente per il gene bersaglio. Ancora una volta, questo approccio è più tempo e conveniente che attraversa o generare linee transgeniche, con il vantaggio di determinare se il meccanismo è difettoso cellule autonoma.

IUE può essere utilizzato per monitorare la migrazione dei neuroni attraverso elettroporazione di un plasmide giornalista in knock out embrioni (Figura 4C). Poiché solo i neuroni che rivestono il ventricolo al momento dell'intervento chirurgico sono elettroporate ^17, IUE può essere utilizzata per seguire i neuroni nati in un momento specifico con il vantaggio di visualizzazione della loro morfologia in vivo.

Infine, è possibile utilizzare per indirizzare IUE regioni cerebrali come la telencefalo mediale o dorsale, ippocampo o eminenza gangliare (Figura 2). Questo dà ricercatori il potere di indagare la funzione del gene in una determinata area indipendente complicazioni risultatoing da proteine ​​atterramento in strutture vicine.

Proteina retinoblastoma (pRb), P107 e P130 comprendono la famiglia di proteine ​​tasca e sono ben regolatori del ciclo cellulare uscita stabilita. Tuttavia, vi è una crescente evidenza che queste proteine ​​regolano anche del ciclo cellulare aspetti indipendenti di sviluppo neurale. Come abbiamo già dimostrato, pRb e P107 svolgono un ruolo cruciale sia in tangenziale ^4,23 e migrazione radiale ^6. Qui, dimostriamo il ruolo della proteina tasca familiari pRb e P107 sulla migrazione neuronale ⁶ per esemplificare l'uso di elettroporazione in utero di Cre in un modello transgenico. In sintesi, IUE fornisce un modo potente di analizzare cellule effetti autonome di delezione del gene (o sovraespressione). Se combinato con tessuto specifico knock out modelli, IUE può fornire ulteriori informazioni riguardanti i meccanismi che controllano la migrazione neuronale.

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Protocollo

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla University of Animal Care comitato etico di Ottawa, aderendo alle linee guida del Consiglio canadese Animal Care.

Preparazione 1. Pre-chirurgici e materiali

1. Plasmidi Preparazione:
   1. Preparare plasmidi usano il Qiagen MegaPrep secondo il protocollo del produttore. Inoculare almeno 400 ml di brodo LB con batteri trasformati per garantire una resa elevata DNA e incubare durante la notte.
   2. Risospendere plasmide in 100-200 microlitri TE ad una concentrazione finale di almeno 5 mg / mL. Aliquota DNA e conservare a -20 ° C. Se la concentrazione è troppo bassa, non precipitare e risospendere come questo può aggiungere impurità. Iniziare con una nuova preparazione.
   3. Prima della chirurgia, diluire un singolo plasmide (Cre-GFP per esempio) per 2 mg / mL in acqua sterile con 1 ml di 0,1% (w / v) colorante Fast verde per 10 o 20 ml di soluzione diluita plasmide. Se GFPe il gene di interesse sono da co-elettroporate su plasmidi separati, iniettare il plasmide GFP e il plasmide che porta il gene di interesse ad un rapporto di 1: 4 per massimizzare la probabilità che tutte le celle contrassegnate con GFP sono co-elettroporate con entrambi plasmidi.
2. Tirare i tubi microcapillari di vetro (diametro esterno 1 mm - di seguito denominati aghi) su un estrattore standard di ago, utilizzando un unico tiro passo a 62 ° C.
3. Autoclave una confezione chirurgica contenente i seguenti: porta-aghi, divaricatore ferita, pinze, forbici per la chirurgia, forbici per aghi, cucitrice, graffette, garza, le coperture della ferita, teli chirurgici (Figura 1A, B; Materials Table).
4. Raccogliere altri strumenti necessari: elettroporatore, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 o 7 mm), saline, sutura, siringa da 5 ml (Materials Table).

2. Preparare Mouse for Surgery

1. Per la gestione del dolore, iniettare un-p temporizzatoMouse regnant con buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) un'ora prima dell'intervento. Applicare questo protocollo per topi a tempo ovunque da embrionale giorno 12,5 (E12.5) a E17.5.
2. Utilizzare microloader puntali delle pipette per eseguire il carico tirato aghi con la soluzione plasmide. Non riempire fino in fondo la punta dell'ago ma ciò causerebbe l'ago ad occludersi.
3. Anaesthetize mouse usando 2-5% gas isoflurano con 1 L / min O _2. Una volta immobile, posto in maschera e applicare una pomata per gli occhi per evitare l'essiccazione. Iniettare con 1 ml di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) per via sottocutanea in indietro.
   NOTA: Quando si lavora con gas isoflurano, utilizzare un scavenger gas di riconquistare gas in eccesso ed evitare la fuoriuscita nella stanza.
4. Shave addome. Lavare addome con Chlorohexadine scrub, risciacquare con acqua, e applicare una soluzione di preparazione finale del chlorohexadine e il 70% di etanolo. Mouse copertura con telo sterile o garza per coprire la pelliccia, ma lasciare l'addome esposto (Figura 1C, D).

3. In utero elettroporazione

1. Fare un'incisione nella pelle sopra l'addome tra i capezzoli inferiori. Tirare la pelle lontano dallo strato muscolare sottostante strappando il tessuto connettivo, poi tagliare attraverso il peritoneo nella cavità addominale lungo la linea alba. Inserire il riavvolgitore ferita per tirare i bordi della ferita parte.
2. Rimuovere l'utero dalla cavità addominale e stenderlo come mostrato (Figura 1E).
   1. Se diversi cuccioli deve essere iniettato con differenti plasmidi (come GFP vs GFP con il gene di interesse), contare i cuccioli su ogni lato e decidere quali e quanti iniettare con ciascun plasmide. Sostituire un lato dell'utero posteriore nell'addome per mantenere gli embrioni caldo e lubrificati. Inumidire Subito dell'utero esposta con soluzione salina (preferibilmente riscaldato alla temperatura corporea).
   2. Se iniettando tutti cuccioli con lo stesso plasmide (come quando l'iniezione Cre-GFP in embrioni transgenici) only rimuovere un corno dell'utero alla volta.
3. Mettere un ago caricata nella testa di presa della bacchetta di iniezione e con attenzione tagliare la punta con un paio di piccole forbici chirurgiche o pinza sottile. Tagliare la punta in modo che l'ago rimane più a lungo possibile, pur consentendo al fluido di passare attraverso (Figura 1Ji-iv).
   1. Regolare la lunghezza di iniezione (in secondi) e la pressione di iniezione sul microinjector modo che una piccola goccia e facilmente visibile di 0,1-0,2 microlitri appare sulla punta dell'ago quando viene premuto il pedale paddle. Tenere il volume di questa goccia più coerente possibile tra gli aghi diversi.
      NOTA: questo passaggio è cruciale per la sopravvivenza degli embrioni (vedi la discussione).
   2. Utilizzare i seguenti parametri di iniezione per la FemtoJet: iniezione di pressione (pi) = 250-300 hPa; tempo di iniezione (ti) = 0,8-1,2 sec; Pressione compensazione = 10-50 hPa. Se necessario, modificare questi parametri per accogliere variazione tra gli aghi.
4. Seleggere un embrione e posizionarla delicatamente sulla schiena, la testa inclinata verso l'alto (Figura 1F).
   NOTA: Questo può richiedere ruotando o spostando l'embrione; fare attenzione a non applicare troppa pressione ed evitare la rottura del sacco amniotico durante la manipolazione dell'embrione.
5. Una volta che l'embrione è a posto, individuare il ventricolo, che presenta una forma di mezzaluna ombra parallelo al seno sagittale. Premere la punta dell'ago verso l'utero sopra il ventricolo con una leggera angolazione e guidare l'ago attraverso la parete uterina. La quantità di pressione richiesta dipende dalla nitidezza dell'ago. Spingere l'ago attraverso la corteccia nel ventricolo.
   NOTA: Anche se vi è raramente qualsiasi ulteriore resistenza rilevabile, la testa del embrione è spesso spinto via un po 'e poi si ritrae, come l'ago passa attraverso la corteccia nel ventricolo.
6. Pompare il paddle piede per iniettare la soluzione plasmide. Continuare a pompare fino a una zona verde è visibile ed è conforme alfigura dell'arco del ventricolo (Figura 1G). Nei giovani embrioni (E12.5 a E14.5) il colorante spesso diffondere nel ventricolo controlaterale.
   NOTA: Il numero di pompe dipende dal diametro della punta dell'ago, l'età dell'embrione (e conseguente dimensioni del ventricolo) e il volume di iniezione desiderato. Mantenere il volume iniettato più coerente possibile tra embrioni.
7. Iniettare tre o quattro embrioni. Tenere tutti gli embrioni esposti umide con soluzione salina durante procedura.
8. Ritornare alla primi embrioni iniettati e posizionare le pale in modo che l'elettrodo positivo disegnare il plasmide nella regione desiderata del cervello (Figura 1H). Angle l'elettrodo negativo in modo che il percorso più breve tra gli elettrodi passa direttamente attraverso la struttura mirato per elettroporazione (Figura 2).
9. Una volta che le pale sono a posto, applicare lo shock. A seconda dell'età e delle dimensioni degli embrioni, utilizzare 5 impulsi di 35-50 V (vedi T1 grado). Utilizzare i seguenti parametri di elettroporazione: lunghezza di impulso di 5 msec, con un intervallo di impulso di 950 msec. Ripetere con tutti gli embrioni iniettati.
10. Tagliare la punta di nuovo ago pre-caricato come al punto 3.3, come l'ultimo ago probabile secca e ostruita durante la fase 3.9. Iniettare la prossima serie di tre o quattro embrioni sia con lo stesso plasmide o un plasmide diverso e quindi applicare la scossa come al punto 3.9. Quando tutti i cuccioli in un lato dell'utero vengono iniettati, rimuovere il secondo lato dell'utero dall'addome della femmina e quindi sostituire la parte completata per mantenerlo caldo.
11. Ritorno entrambi i lati dell'utero alla femmina facendo attenzione a mantenere la superficie umida con soluzione fisiologica e non applicare troppa pressione per evitare traumi alle cavità amniotiche. Suturare lo strato muscolare chiusa con un semplice punto continuo. Staple la pelle chiusa. Se i punti non sono disponibili, suturare la pelle con un semplice punto interrotto. (Figura 1I)
12. Mentre suturing, progressivamente abbassare il isoflurano per consentire l'anestesia della femmina incinta per alleggerire.
    NOTA: Questo accelerare l'eccitazione della diga dopo l'intervento chirurgico è completo; mantenendo la femmina anestetizzato per il più breve tempo possibile migliorare la sopravvivenza dell'embrione. Tempo chirurgico totale, a partire da quando la femmina viene prima anestetizzato, deve essere di circa 30 min.

4. Aftercare

1. Posizionare la femmina suturato in un incubatore o su una piastra elettrica per recuperare da anestesia. Il suo letto in biancheria pulita e posizionare un gel ripresa standard nella gabbia mantenere l'idratazione. Per la gestione del dolore dopo un intervento chirurgico, dare le donne tre dosi di buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) a 8 intervalli hr dopo l'intervento, poi quattro dosi supplementari a intervalli di 12 h.

5. Brains raccolta

NOTA: Brains possono essere raccolte a qualsiasi età fino all'età adulta. Si applica la seguenteper la raccolta di cervelli prima della nascita. Si noti che una volta che i cuccioli sono nati, l'ordine all'interno dell'utero è perso, quindi o ogni pup nella lettiera deve essere iniettata con lo stesso plasmide, o un altro metodo di distinguere tra controllo e animali da esperimento deve essere messo a punto.

1. Preparare a freddo (4 ° C), filtrato 4% paraformaldeide (PFA) prima eutanasia femmina.
2. Euthanize femmina con una iniezione intraperitoneale di una dose letale di pentobarbital sodio (100 mg / kg di peso corporeo) e tagliare addome aperto. Estrarre entrambi i lati dell'utero e lay out come quando cuccioli stati inizialmente iniettati.
   1. Nel caso in cui tutti i cuccioli ricevuto lo stesso plasmide, ad esempio quando si inietta Cre in una lettiera transgenico, ordine embrione non è importante, quindi tagliato l'utero fuori della femmina e posto in PBS.
   2. Se cuccioli sono stati iniettati con diversi plasmidi, assicurarsi di individuare ogni cucciolo, rilevando eventuali cuccioli morti, e determinare quali sono stati iniettati con controllo e speriplasmidi Tal prima di rimuovere l'utero dalla femmina. Fare attenzione a tenere traccia di quali pup appartiene a quale gruppo dopo l'utero è in PBS.
3. Rimuovere ogni cucciolo individualmente, decapitarlo con forbici affilate o una lametta e mettere la testa in PBS. In caso di topi transgenici, raccogliere campioni di tessuto per la genotipizzazione e mantenere ogni testa separata, ad esempio in una piastra 12 pozzetti.
4. Sotto un ambito dissezione, rimuovere il cervello dal cranio, facendo attenzione a non intaccare la corteccia o strappare la linea mediana. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, controllare per vedere se il cervello hanno un GFP + patch, che indica che sono stati elettroporate con successo.
5. Fissare cervelli di immersione in PFA a 4 ° C durante la notte.
   NOTA: Controllare il cervello per l'espressione di GFP prima della fissazione da quando PFA spesso spegne il segnale.
6. Cervelli Cryoprotect attraverso l'immersione nel 20% di saccarosio per almeno tre giorni prima del congelamento. Utilizzare un gradiente di saccarosio del 10%, 15% e 20% (24 ore in ciascuna soluzione) to prevenire danni ai tessuti a causa della pressione osmotica. Conservare il cervello congelato a -80 ° C e tagliare su un criostato a 10-14 micron sezioni spesse.

6. Co-colorazione con anti-GFP

NOTA: Se il recupero dell'antigene è necessario per co-macchia con anti-GFP, è importante usare un antigene protocollo di recupero delicata che non compromette il segnale GFP. Alcuni protocolli di recupero antigene sono troppo dure da utilizzare in combinazione con GFP colorazione (anche con un anticorpo contro GFP). Un acido citrico base pre-trattamento prima dell'applicazione dell'anticorpo primario è efficace per la maggior parte epitopi ^24.

1. Fare una soluzione 0,01 M di acido citrico in DDH ₂ O. pH a 6 con un pH metro calibrato.
2. Calore acido citrico in camera di colorazione in forno a microonde o bagnomaria fino citrico raggiunge 75-80 ° C. Mettere i vetrini in camera di colorazione per 10-15 minuti. Mantenere la temperatura più stabile possibile.
3. Lavare i vetrini in PBS3x per 3 minuti a temperatura ambiente. Applicare l'anticorpo primario e procedere con immunocolorazione secondo un protocollo standard.
4. Convalidare Cre escissione mediata da co-etichettatura per GFP e il gene di interesse per confermare abbattere (Figura 3A).

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Risultati

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo’s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

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Discussione

Due delle principali sfide in svolgimento in electroporations utero sono 1) la prevenzione embrione letalità e 2) riduzione della variabilità tra electroporations. Uno dei fattori più importanti nella prevenzione letalità è la qualità ago, come aghi smussati infliggere più danni per l'embrione. Quando si taglia l'ago, mantenere la punta più a lungo possibile, pur consentendo una gocciolina visibile di 0,1-0,2 ml di fluido apparire dopo una pompa del paddle piede (Figura 1J).

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square Wave Electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0211	Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm)	Platinum forcep style electrodes
Femtojet	Eppendorf	920010504	Microinjector
Griphead 0	Eppendorf	920007414	Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder	Eppendorf	920007392	Connects griphead to tube
Injection Tube	Eppendorf	920007431	Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control	Eppendorf	920005098	Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips	Eppendorf	930001007	Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit	Qiagen	12181	5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G	Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14084-09
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Straight
Colibri Retractors	Fine Science Tools	17000-03
Stapler	Fine Science Tools	12031-07	For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder	Medical Tools	SNH-6737	Straight, with lock
Needle Puller	Narishige	PC-10	For pulling microcappillaries
Microcapillaries	Drummond	1-000-800	0.4 mm inner diameter glass capillary tubes