Роман<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

Резюме

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Аннотация

Большинство из известных болезней, которые сопровождаются расстройствами сердечно-сосудистой системы. Исследования в сложности взаимодействующих путей, активированных в течение сердечно-сосудистых патологий, однако, ограничен из-за отсутствия надежных и физиологически соответствующих методов. Для моделирования патологических событий сосудистых мы разработали анализ в пробирке для изучения взаимодействия эндотелия и цельной крови. Анализ состоит из первичных человеческих эндотелиальных клеток, которые размещены в контакте с цельной крови человека. Способ использует встроенную кровь без каких-либо очень мало или антикоагулянтом, что позволяет изучение тонких взаимодействий между молекулярных и клеточных компонентов, присутствующих в кровеносном сосуде.

Мы исследовали функциональные возможности анализа путем сравнения активации свертывания по различных объемов крови инкубировали с или без пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC). В то время как больший объем крови способствовалиувеличение в образовании тромбина антитромбин (ТАТ) комплексы, наличие HUVEC привело к снижению активации свертывания. Кроме того, мы применили анализ изображения прикрепления лейкоцитов к HUVEC, стимулированных фактора некроза опухоли (ФНО) и обнаружили присутствие CD16 ⁺ клеток, что значительно выше, на ФНО стимулированных клеток по сравнению с стимулированных клеток после контакта с кровью. В заключение, анализ может быть применен для изучения сосудистых патологий, где взаимодействие между эндотелием и отсек крови возмущенные.

Введение

Методы анализа крови-сосудистой взаимодействия в сердечно-сосудистых заболеваний обычно включают научно-исследовательские эксперименты на животных. Результаты, созданные в экспериментальных моделях на животных исследования могут, однако, практически не имеют последствий для заболевания человека. ^1,2 Таким образом, существует потребность в хорошим и надежным в пробирке моделей для исследования клеточных взаимодействий между отсеке крови и сосудистых эндотелиальных клеток в человек-как. Поэтому мы создали клетки камерный модель эндотелия в крови. Это основано на ранее описанной модели, используемой для исследования взаимодействия между биоматериалов и цельной крови человека. ³ В отличие от других установок в пробирке, где, как правило, ограниченное количество очищенных компонентов, то есть, тромбоциты, лейкоциты или эндотелиальные клетки доступны, присутствует модель включает все компонентов, присутствующих в кровеносный сосуд.

Настройка эндотелиальной крови сELL камера модель предназначена для использования других свеженарисованного крови человека с небольшим или без добавления антикоагулянта. Кровь хранится в течение более длительных периодов времени приобретают так называемые очаги хранения, где разбивка эритроцитов могут помешать деликатных взаимодействия между кровью и эндотелиальных клеток. ⁴

Чтобы избежать образование тромбов во время обработки цельной крови экс естественных требует либо высокие дозы антикоагулянта или, что все материалы в контакте с кровью должны быть не активирующий. Как не-активирующие поверхности редки в лабораторных условиях, в качестве альтернативы материалы могут быть снабжены защитным слоем иммобилизованного гепарина. Защитный слой иммобилизованного гепарина (далее именуемые как гепарин Corline поверхности (CHS)), которые могут быть применены к большинству материалов создания поверхности контакта, где кровь может происходить, не вызывая активацию каскада свертывания. ⁵ Таким образом, путем предоставления камер с CHS, эндотелия крови сеLL камера модель позволяет использовать очень низких концентрациях антикоагулянта в крови. Как избежать добавление высоких концентраций антикоагулянта в камере модели эндотелиальной крови делает возможным изучать чувствительные взаимодействия внутри кровеносного сосуда, что в противном случае может быть замаскирован. ⁶

Клетка камера модель эндотелия крови состоит из двух палат, образованных путем присоединения пластиковые цилиндры (высота: 8 мм; радиус: 9 мм) до пластиковой микроскопа. Края, стоящие вверх на цилиндрах оснащены пазами, которые оснащены резиновыми уплотнительными кольцами, используемых для герметизации камер против культивирования клеток горкой. Камеры лишь частично заполнены кровью, как воздух остается в камере удерживает кровь в движение, когда камеры впоследствии поворачивается в вертикальное положение (рис 1).

Для того чтобы оценить функциональность модели, были проведены эксперименты с либо полностью CHS покрытиемкамерные или пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC). Две отдельные объемы крови анализировали и образование тромбина антитромбин (ТАТ) комплексов (непрямого маркера коагуляции) было измерено с твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Мы тогда оценивали влияние объемов крови и фактора некроза опухоли (ФНО) стимулировали эндотелиальные клетки на вербовке лейкоцитов анализом изображений.

Рисунок 1. Установка в ячейки камеры модели эндотелия в крови. (А) Вид сверху схематическое изображение камеры крови, достигнутый в ПММА. (B) Первичные эндотелиальные клетки человека культивируют на слайдах камеры 1-а. Свежий цельной крови человека добавляется в двух камерах на предметное стекло микроскопа. Камеры и все материалы, используемые для обработки крови, рассматриваются с защитным HS покрытия. После удаления стены сеLL культура слайд, клетки помещают перед кровь и система зажимается на замке. (С) эндотелиальных клеток крови камеры затем инкубируют при вращении в 37 ° С. После этого реакции в отсеке крови могут быть проанализированы с помощью ELISA и эндотелиальные клетки могут быть проанализированы с помощью микроскопии.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь брали из здоровых лиц по открытой системы вены в утверждении с этике Совета в Упсале (Разрешение № 2008/264).

1. Посев Клетки

1. Культура первичные эндотелия пупочной вены человека (HUVEC-клетки) при 37 ° С в 5% СО ₂ в колбах Т75 с покрытием с 1% желатина в PBS, рН 7,4.
2. Удаление питательной среды от T75 колбу, содержащую HUVEC (или другого типа первичных эндотелиальных клеток человека) и промыть клетки с 2,1 мМ ЭДТА в PBS, рН 7,4. Отделить клетки путем добавления 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА и инкубации в течение 2 - 3 мин в 37 ° С.
3. Сбор клеток путем промывки колбу с 9 мл 10% FBS в PBS, рН 7,4, и передачи клеточной суспензии в 15 мл пробирку. Спин вниз клетки при 735 х г в течение 5 мин.
4. Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют осадок клеток эндотелия в среде роста клеток микрососудистой (ЕС GMMV) и подсчет клеток в камере Бюркера. Семенной 21000 Cлоктей / см ² в 1-луночных слайдов культуры клеток и инкубируют при 37 ° С. HUVEC будет конфлюэнтны после 1 - 2 дней культивирования. Контролировать морфологию клеток и слияния ежедневно под световым микроскопом.

2. Подготовка цельной крови

1. Подготовьте все искусственные поверхности, которые будут в контакте с кровью с двойным слоем фиксированного гепарина (СГГ) в соответствии с инструкциями изготовителя. Материалы с покрытием CHS защищено от пыли можно хранить при комнатной температуре в течение 6 месяцев без потери функции.
2. Используйте открытые системы венепункции до крови от здорового донора вскоре (<30 мин) до начала эксперимента эндотелия камеры кровь. Пара Игла (18 г х 50 мм), чтобы CHS кремния с покрытием трубки (внутренний диаметр: 2 мм), прежде чем тщательно сбора крови в 50 мл CHS покрытием трубки. Дополнение крови с НФГ достичь конечной концентрации 0,75 МЕ / мл. Смешайте кровь осторожно INVErting трубы 2 - 3 раза.

3. Кровь эндотелия палата Модель

1. Изготовление камер крови (рис 1А; вид сверху) в акриловой полиметилметакрилата (ПММА), состоящей из двух цилиндров (высота 8 мм и радиус 9 мм), склеенных к слайду ПММА (25 х 75 мм). Установите края цилиндров, стоящих перед вверх с резиновыми уплотнительными кольцами для уплотнения камеры крови против стеклах с культивируемых эндотелиальных клеток (рис 1b). Поворот камеры в крови, подключенные к культуральной слайда с эндотелиальными клетками после этого в вертикальном положении (рис 1С).
2. Используйте CHS покрытую пипетки для переноса 1,5 мл крови в каждый CHS покрытием камеры уход принимая не активировать кровь.
3. Передача 1 мл крови в микроцентрифужных пробирках, содержащих 30 мкл 0,34 MK ₃ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ K ₃ ЭДТА для определения концентрации белка в плазме с использованием начальноетвердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Тщательно перемешать и хранить кровь пробирки на лед.
4. Снять пластиковые стенки клеточных культур стеклах в соответствии с инструкциями изготовителя и тщательно промыть клетки в PBS рН 7,4. Убедитесь, что впоследствии удалить столько жидкости, сколько возможно из слайдов. Не позволяйте клетки высыхают.
5. Поместите слайд в верхней части камер крови, с клетками, с которыми сталкивается кровь. Закрепите слайд, поставив зажим вокруг эндотелиальных клеток в крови камеры. Используйте пластиковый слайд для дополнительной поддержки, чтобы избежать поломки предметное стекло для культивирования клеток при размещении зажим.
6. Закрепите камеру эндотелия в крови клеток на вращающемся колесе (40 см в диаметре) место в водяной бане при 37 ° C. Поворот каждую камеру на колесе при 0,5 мкг в течение 30 мин.
7. После инкубации демонтировать эндотелиальных клеток в крови камеру. Вымойте культуры клеток слайдов в PBS рН 7,4 и фиксации клеток в лед холодной 1% параформальдегиде (PFA) еили 10 мин. Передача 1 мл крови из каждой камеры к микроцентрифужных пробирках, содержащих 30 мкл 0,34 МК ₃ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ K ₃ ЭДТА и смешать пробирки осторожно. Держите пробирки на лед.
8. Центрифуга трубки при 4560 х г в течение 10 мин в 4 ° С. Перенесите плазму крови к новым микропробирок и магазин в -70 ° C до дальнейшего анализа.

4. Анализ крови эндотелиальных взаимодействий

1. Выполнение иммунофлуоресцентного окрашивания с мышиного антитела против человеческого CD16 с последующим вторичным козьим антителом против мышиного Alexa 488 и фаллоидином-TexasRed. Выполнение каждого этапа окрашивания в течение 1 ч при комнатной температуре и мыть слайды в PBS, рН 7,4 между каждым шагом. Контрастное ядер с DAPI в течение 10 мин при комнатной температуре. Анализ компонентов крови, связанные с эндотелиальных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии в сочетании с анализа изображений с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений, таких как CellProfiler.
2. QuantiFY реакции в отсеке крови с тромбином антитромбина (ТАТ) ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя образцов плазмы.
3. Используйте соответствующие статистические инструменты, например., Непарный т тест, чтобы проанализировать данные.

Результаты

Необходимость ЦОН покрытия

Для того чтобы измерить реакции в цельной крови, специфичные для тех, вызванное эндотелиальных клеток, все материалы, используемые для эндотелиальных клеток крови камере должен быть снабжен покрытием, CHS перед использованием. 2А (слева) показывает без покрытия камеру после 30 минут контакт крови с четко видимой сгустка настоящее. Лечение в камеру с CHS (рис 2А, справа), с другой стороны защищает кровь от неконтролируемого активации, гарантируя, что результаты обусловлены эндотелиальных взаимодействий клеток крови.

Влияние объема крови в палате

Активация коагуляции, скорее всего, в застойной крови, как вероятность взаимодействия активированных факторов свертывания увеличивается. В ячейки камеры модели эндотелия в крови, в крови поддерживается в движении из-за циркуляции воздушного пузыря внутри камеры. В Order чтобы определить влияние изменения объема крови, а следовательно, и размер пузырьков воздуха, камера CHS покрытием был подключен к ЦОН покрытием стекло, что был испытан с 1,5 мл или 1,75 мл цельной крови в течение 30 мин. Объем крови без какого-либо движения по пузырька воздуха в 2,5 раза больше, когда 1,75 мл крови добавляют в камере по сравнению с тем, когда 1,5 мл крови используется (Фигура 2В). Измеренные TAT-значения предложил увеличилось ТАТ-образование с увеличением объема крови (рис 2D). Когда HUVEC (фиг.2С) инкубировали с 1,5 или 1,75, или мл цельной крови, никаких различий не было отмечено между двумя группами, предполагая, что эндотелиальные клетки могут модулировать активацию коагуляции (рис 2D).

Влияние ФНО на крови Cell вербовкой и Активация коагуляции

Для того, чтобы изучить влияние ФНО по вербовке лейкоцитов, ЭКПВЧ были удовольствиемред с 20 нг / мл TNF-alpha 4 ч до контакта с кровью. Кровь контакт - либо с 1,5 мл или 1,75 мл крови - продолжали в течение 30 мин, после чего культуры препараты окрашивали для CD16 (рис 2F), отображаемого а количество CD16 ⁺ клеток количественно. Вербовка CD16 ⁺ клеток значительно увеличивается при лечении ФНО (рис 2Е) от 100 до 256 CD16 ⁺ клеток / мм ² (р <0,0001) с 1,5 мл крови и от 172 до 378 (P <0,0001) с 1,75 мл крови. Образование комплексов TAT была измерена в соответствующих образцах плазмы крови инкубируют с ФНО либо обработанных или необработанных клеток (рис 2G). TNF-alpha стимулированных клеток индуцируется приблизительное удвоение TAT комплексов, по сравнению с необработанными клетками.

ФигаЮр 2: Функциональные возможности клеток камерной модели эндотелия в крови. (A) Камеры с или без CHS инкубировали с цельной крови. Без CHS, сгусток образовался после 30 мин. Измерение тромбин-антитромбин (ТАТ) комплексов, непрямого маркера коагуляции крови, в инкубируемых без CHS было> 6000 мкг / мл. (Б) объем крови, не двигалась вращающимся воздушным пузырем будет меняться в зависимости от различных объемов крови. С добавлением 1,5 мл крови, этот объем будет 0,3 мл, в то время как она вырастет до 0,74 мл с добавлением 1,75 мл. (С), полученную с использованием HUVEC фазово-контрастной микроскопии показывают типичные эндотелиальных клеток морфологии сливной монослоя до контакт с кровью. (D) значения TAT для камер полностью CHS покрытием показать небольшую разницу, когда различные объемы крови добавляются. Добавление 1,5 мл крови в результате 35 ± 11 мкг / мл (п = 7) по сравнению с 1,75 мл, в результате чего 8577; 70 мкг / мл ТАТ (N = 8). Это различие не больше не присутствует, когда HUVEC инкубировали с одних и тех же объемов крови; 66 ± 55 мкг / мл в течение 1,5 мл (N = 5) и 66 ± 29 мкг / мл в течение 1,75 мл (N = 7). (Е) Количественное определение количества CD16 ⁺ клеток присутствуют на или без стимуляции или TNF, стимулировали HUVECs после контакт с кровью. Количество CD16 ⁺ клеток значительно возрастает с ФНО стимулировали клетки инкубировали либо с 1,5 мл (базальных: 100 ± 40 клеток / мм; ФНО: 256 ± 121 клеток / мм) или 1,75 мл (базальных: 172 ± 67 клеток / мм; ФНО: 378 ± 185 клеток / мм) из цельной крови (F) Типичные изображения без стимуляции и ФНО стимулировало ЭКПВЧ окрашенные для фаллоидином (красный), CD16 (зеленый) и DAPI (синий).. Шкала бар = 250 мкм (G) Образование TAT комплексов примерно в два раза путем ФНО стимулированных клеток по сравнению с необработанными клетками, инкубированных с крови (1,5 мл:. 2.1 ± 0,1 раза больше, ТАТ, п = 3; 1,75 мл: 1,7 ± 1,0 раза больше, ТАТ, N = 4). Все значения представлены как среднее ± стандартное отклонение; р значения были рассчитаны по непарных т тестов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Множественные взаимодействия между кровью и стенкой сосуда, как правило, поддерживают в состоянии покоя в связи с неклейкой и анти-тромботической природы эндотелия. ⁷ Во патологических состояний, связанных с воспалением, эндотелий активирован с результирующим увеличением адгезии рецепторов выражения ⁸ и снижается способность ингибировать гемостаз. ⁹ Активация каскада систем в крови в свою очередь усиливает тромбогенности эндотелия приводит к дальнейшему тромбоз и лейкоцитов вербовки. ¹⁰ Для лучшего понимания этого деликатных взаимодействия между эндотелиальных клеток и цельной крови, у нас есть разработаны роман в методе экстракорпорального где культивированные эндотелиальные клетки в контакт с цельной крови. Насколько нам известно, наши установки является первым, чтобы показать эндотелиальные клетки инкубировали с целой человеческой крови с отсутствием или очень мало антикоагулянта для более длительных периодов времени.

нт "> Чувствительность этой системы включен по открытой системы венепункции в сочетании с защитным слоем иммобилизованного гепарина на всех поверхностях, расположенных в контакте с кровью. Использование открытой системы закупок в течение крови уменьшает активацию каскадных систем во венепункции в то время позволяя использовать само-определяется количеством антикоагулянта. Коммерчески доступные эвакуированные пробирки крови, однако, может быть использован в зависимости от предполагаемого конечного точек исследования. Конечная концентрация антикоагулянта добавлен к наиболее коммерчески доступных замкнутой системе труб может ингибировать чувствительны , а в противном случае трудно изучить, взаимодействие в установке. ⁶ защитную поверхность гепарина дополнительно устраняет активацию крови через поверхностный контакт любыми другими, чем эндотелиальных клеток поверхностей. ⁵ Действительно, инкубации цельной крови с добавлением небольшого количества нефракционированного гепарина в Камера без защиты CHS привело к образованию сгустка.

пузырь воздуха внутри камеры обеспечивает смешивание крови во время инкубации с эндотелиальными клетками. Для того чтобы оценить влияние размера пузырьков воздуха, мы использовали два разных объемов крови. В этой модели, мы измерили аналогичные уровни ТАТ, независимо от размера воздушного пузыря в камерах инкубированными с ЭКПВЧ. ТАТ был, однако, увеличивается с меньшим размером пузырьков воздуха в полностью CHS лечить камеры. Это, в соответствии с ранее описанными эндотелиальных клеток свойствами ^11, указывает, регулирующий воздействие на повышенной активации свертывания, представленной на эндотелиальных клетках, что отсутствует в инертной CHS камере. Пузырь воздуха в системе создает поток при вращении камеры. Размер пузырьков будет влиять на силы внутри этой вращающейся системе. Это показано с помощью наших результатов на фиг.2d были меньше пузырь создает более высокие значения, представляющие ТАТ уменьшенную силу по IE крови, движение кровиВнутри камеры ниже, и, таким образом, активацию каскада системы происходит в большей степени. Следует отметить, что в этой системе мы создаем вращающийся поток, который будет отличаться в скорости по камере с высокой скоростью вдоль стен и самый низкий в центре. Это, очевидно, не является оптимальным среда с учета потоков и напряжения сдвига для эндотелиальных клеток, но все же у нас есть система получения устойчивых и воспроизводимых результатов. Более оптимальные условия включают ламинарный поток циркулирующего в отсутствие турбулентности. Это, однако, не представляется возможным в модели, представленной здесь, и, насколько нам известно, такие системы не доступна на сегодняшний день. Хотя существует несколько микрофлюидальные системы доступны коммерчески, которые не можно комбинировать с цельной крови без каких-либо или низких уровней антикоагулянта добавлен к этому система не обеспечит правильную чувствительную оценку взаимодействий между всеми компонентами, присутствующими в крови и эндотелиальных клеток,

Кроме того, было увеличение в 2 раза в наборе клеток крови в сторону ФНО активирована HUVEC в комбинации с удвоенной формирования ТАТ независимо от объема крови. Это подтверждает стабильность модельной системе, а также показывает возможность использовать активированный эндотелий в сочетании с цельной крови. Будущие на, камера эндотелиальных клеток крови может быть использован для изучения набора клеток крови в сторону активированных эндотелиальных клеток с помощью различных маркеров на клетках, выраженных в различных условиях и этапах активации. Кроме того, модель может быть использована в сочетании с фармакологическими агентами, чтобы оценить воздействие на воспалительные состояния.

Таким образом, мы показываем большую пользу объединения камерный модель человеческой кровью и сосудистых клеток, чтобы создать полную человека в системе экстракорпорального выполнять соответствующие исследования сосудистых заболеваний.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)	PromoCell	C-12200	Any other type of primary human endothelial cell may be used.
Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)	PromoCell	C-22120
Gelatin	Sigma-Aldrich	G-2500	Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.
TAT ELISA	Enzyme Research Lab.	TAT-EIA-C
Mouse anti-human CD16	DAKO	F7011	Dilution 1:100
Goat anti-mouse Alexa 488	Molecular Probes	A11001	Dilution 1:500
Phalloidin-Texas Red	Molecular Probes	A22287	Dilution 1:200
DAPI	Molecular Probes	D1306	Dilution 10 μg/ml
EDTA	Sigma	E-6758
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco Life Tecnologies	25200-056
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437
1 well cell culture slides	BD Falcon	354101
Blood Chambers	NA	NA	Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS
Clamps	Office Depot	2052204
Corline Heparin Surface (CHS)	Corline Systems AB	945-00
Hypodermic needle	Terumo	NN-1850R	Size: 18 G x 5 mm
Unfractionated Heparin (UFH)	Leo Pharma	585679
K3EDTA	Alfa Aesar	1709958	Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O
PFA	Sigma-Aldrich	P-6148
Fluorescence microscope	Nikon	80i
Light microscope	Nikon	TS100
Image analysis software	Broad Institute	CellProfiler	Available for free at www.cellprofiler.org