A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per lo studio delle interazioni tra l&#39;uomo di sangue intero e l&#39;endotelio

Riepilogo

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Abstract

La maggior parte delle malattie conosciute sono accompagnati da disturbi del sistema cardiovascolare. Studi sulla complessità dei percorsi interagenti attivate durante patologie cardiovascolari sono tuttavia limitati dalla mancanza di metodi robusti e fisiologicamente rilevanti. Per modellare eventi vascolari patologici abbiamo sviluppato un saggio in vitro per studiare l'interazione tra endotelio e sangue intero. Il test consiste di cellule endoteliali umane primarie, che sono posti a contatto con il sangue umano intero. Il metodo utilizza sangue nativo con nessuna o pochissima anticoagulante, permettendo studio delle delicate interazioni tra componenti cellulari e molecolari presenti in un vaso sanguigno.

Abbiamo studiato la funzionalità del dosaggio confrontando attivazione della coagulazione da diversi volumi di sangue incubate con o senza cellule endoteliali umane della vena ombelicale (HUVEC). Considerando che un volume di sangue più grande contribuito allaun aumento della formazione di trombina antitrombina (TAT) complessi, presenza di HUVEC comportato ridotta attivazione della coagulazione. Inoltre, abbiamo applicato l'analisi delle immagini di attaccamento dei leucociti a HUVEC stimolate con fattore di necrosi tumorale (TNF) e ha trovato la presenza di cellule CD16 ⁺ per essere significativamente più alto sul TNF stimolato cellule rispetto alle cellule non stimolate dopo il contatto con il sangue. In conclusione, il dosaggio può essere applicato per studiare le patologie vascolari, dove vengono perturbate interazioni tra l'endotelio e il comparto sangue.

Introduzione

Metodi per l'analisi delle interazioni sangue-vascolare nelle malattie cardiovascolari in genere comportano esperimenti di ricerca degli animali. Risultati creati in modelli animali sperimentali di ricerca possono, tuttavia, hanno poca o nessuna incidenza malattie umane. ^1,2 Come tale, c'è una necessità di una buona e affidabile in vitro per studiare le interazioni cellulari tra il compartimento sangue e cellule endoteliali vascolari un sistema simile a quella umana. Abbiamo quindi stabilito un modello di camera di cellule endoteliali del sangue. Questo si basa su un modello descritto precedentemente utilizzato per studiare le interazioni tra biomateriali e sangue umano intero. ³ Contrariamente alle altre configurazioni in vitro in cui il numero di componenti purificati, di solito limitati cioè, trombociti, leucociti e cellule endoteliali sono disponibili, la presente modello incorpora tutti componenti presenti in un vaso sanguigno.

La messa a punto del endoteliale sangue cmodello di camera di ell è stato progettato per consentire l'uso di sangue umano appena prelevato con poco o nessun anticoagulante aggiunto. Sangue conservato durante i periodi di tempo più lunghi acquisire nell'ambito cosiddetti lesioni di stoccaggio in cui ripartizione degli eritrociti può interferire con delicate interazioni tra il sangue e le cellule endoteliali. ⁴

Per evitare la formazione di grumi durante la manipolazione di sangue intero ex vivo richiede elevate dosi di anticoagulanti o che tutto il materiale a contatto con il sangue deve essere non-attivazione. Come superfici non attivanti sono rari in ambiente di laboratorio, i materiali possono in alternativa essere dotati di uno strato protettivo di eparina immobilizzata. Uno strato protettivo di eparina immobilizzata (nel seguito indicato come superficie Corline eparina (CHS)), che può essere applicato alla maggior parte dei materiali che creano una superficie di contatto in cui il sangue può avvenire senza causare l'attivazione della cascata coagulativa. ⁵ Quindi, fornendo le camere con CHS, il ce endoteliale sanguell modello di camera permette l'uso di concentrazioni molto basse di anticoagulante nel sangue. Evitare l'aggiunta di alte concentrazioni di anticoagulante nel modello endoteliale camera di sangue consente di studiare le interazioni sensibili all'interno di un vaso sanguigno che altrimenti potrebbero essere mascherato. ⁶

Il modello di camera di cellule endoteliali del sangue è composto da due camere formate allegando cilindri di plastica (altezza: 8 mm; raggio: 9 mm) a un vetrino da microscopio in plastica. I bordi rivolti verso l'alto sui cilindri sono dotati di scanalature che sono dotati di O-ring di gomma utilizzati per sigillare le camere contro la slitta coltura cellulare. Le camere sono solo parzialmente pieni di sangue come l'aria rimasta nella camera mantiene il sangue in movimento quando le camere vengono successivamente ruotati in posizione verticale (Figura 1).

Per valutare la funzionalità del modello, abbiamo eseguito esperimenti con entrambi completamente rivestita CHScamera o ombelicale umano Vena cellule endoteliali (HUVEC). Due volumi di sangue separati sono stati analizzati e la formazione di trombina antitrombina (TAT) complessi (un indicatore indiretto della coagulazione) è stata misurata con enzyme linked test immunoenzimatico (ELISA). Abbiamo poi valutato l'effetto dei volumi di sangue e il fattore di necrosi tumorale (TNF) stimolato le cellule endoteliali su reclutamento dei leucociti mediante analisi di immagine.

Figura 1. Configurazione del modello di camera di cellule endoteliali del sangue. (A) Top disegno schematico della camera di sangue realizzato in PMMA. (B) primarie cellule endoteliali umane sono coltivati ​​su 1-e diapositive da camera. Fresco sangue umano intero è aggiunto due camere su un vetrino da microscopio. Le camere e tutti i materiali utilizzati per la manipolazione del sangue sono trattati con un rivestimento protettivo HS. Dopo aver rimosso le pareti della cell cultura scivolo, le cellule sono posti di fronte al sangue e il sistema è bloccato chiuso. camere cellule (C) La endoteliale sangue vengono poi incubate in rotazione 37 ° C. Successivamente, le reazioni nel comparto sangue possono essere analizzati mediante ELISA e le cellule endoteliali possono essere analizzate mediante microscopia.

Protocollo

NOTA: Il sangue è stato prelevato da individui sani di prelievo venoso sistema aperto in approvazione presso il Ethical Review Board a Uppsala (Permesso n 2008/264).

1. Le celle semina

1. Colture primarie di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) a 37 ° C in 5% di CO ₂ in fiasche T75 rivestiti con 1% di gelatina in PBS pH 7.4.
2. Rimuovere terreno di coltura da un pallone T75 contenente HUVEC (o altro tipo di cellule endoteliali umane primarie) e lavare le cellule con 2,1 mM EDTA in PBS pH 7,4. Staccare le cellule con l'aggiunta di 1 ml 0,25% tripsina-EDTA e incubazione per 2 - 3 min a 37 ° C.
3. Raccogliere cellule sciacquando il pallone con 9 ml di 10% FBS in PBS pH 7,4 e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. Centrifugare le cellule a 735 xg per 5 min.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere accuratamente il pellet cellulare in mezzo di crescita delle cellule endoteliali microvascolari (CE GMMV) e contare le cellule in una camera Bürker. Seed 21.000 cells / cm ² in 1 pozzetti diapositive colture cellulari e incubare a 37 ° C. Il HUVEC sarà confluente dopo 1 - 2 giorni di coltura. Monitorare la morfologia cellulare e la confluenza quotidiana al microscopio ottico.

2. Preparazione di sangue intero

1. Preparare tutte le superfici artificiali che verranno a contatto con il sangue con un doppio strato di eparina immobilizzata (CHS) secondo le istruzioni del produttore. Materiali rivestiti CHS protetti dalla polvere possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 6 mesi senza perdita di funzione.
2. Utilizzare venipuntura sistema aperto per prelevare il sangue da un donatore sano breve (<30 min) prima di iniziare l'esperimento camera endoteliale nel sangue. Coppia ago ipodermico (18 G x 50 mm) a CHS tubo in silicone rivestito (diametro interno 2 mm) prima di raccogliere accuratamente sangue in una provetta CHS rivestito 50 ml. Supplemento sangue con eparina non frazionata per raggiungere una concentrazione finale di 0,75 IU / ml. Mescolare il sangue delicatamente inverting il tubo di 2 - 3 volte.

Modello 3. Sangue endoteliale Camera

1. Realizzare camere di sangue (Figura 1A; vista dall'alto) in acrilico polimetilmetacrilato (PMMA) costituito da due cilindri (altezza 8 mm di raggio 9 mm) che sono incollati a una diapositiva PMMA (25 x 75 mm). Montare i bordi dei cilindri rivolti verso l'alto con O-ring di gomma per sigillare la camera di sangue contro i vetrini con cellule endoteliali coltivate (Figura 1B). Ruotare le camere di sangue collegati alla slitta coltura con cellule endoteliali successivamente in posizione verticale (Figura 1C).
2. Utilizzare un puntale CHS rivestito di trasferire 1,5 ml di sangue in ogni CHS rivestiti camera facendo attenzione a non attivare il sangue.
3. Trasferire 1 ml di sangue in provette da microcentrifuga contenente 30 ml 0.34 MK ₃ EDTA per raggiungere una concentrazione finale di 10 mM K ₃ EDTA per la determinazione delle concentrazioni di proteine ​​plasmatiche iniziale utilizzandoun enzima legato Test immunoenzimatico (ELISA). Mescolare accuratamente il sangue e mantenere i tubi in ghiaccio.
4. Rimuovere le pareti di plastica delle colture cellulari vetrini in base alle istruzioni del produttore e con attenzione lavare le cellule in PBS pH 7.4. Assicurarsi di rimuovere in seguito quanto più liquido possibile dalle diapositive. Non lasciate che le cellule asciugare.
5. Posizionare il vetrino sopra le camere di sangue, con celle di fronte al sangue. Fissare la diapositiva posizionando un morsetto attorno alla camera di cellule endoteliali del sangue. Utilizzare uno scivolo di plastica per un sostegno supplementare per evitare la rottura del vetrino di coltura cellulare quando si posiziona il morsetto.
6. Fissare la camera di cellule endoteliali del sangue su una ruota in movimento (40 cm di diametro) posto in un bagno d'acqua a 37 ° C. Ruotare ciascuna camera sulla ruota a 0,5 xg per 30 min.
7. Dopo l'incubazione, smontare la camera di cellule endoteliali del sangue. Lavare i vetrini di coltura cellulare in PBS pH 7.4 e fissare le cellule in ghiaccio freddo 1% paraformaldeide (PFA) fo 10 min. Trasferire 1 ml di sangue da ciascuna camera di provette da microcentrifuga contenente 30 ml 0.34 MK ₃ EDTA per raggiungere una concentrazione finale di 10 mM K ₃ EDTA e mescolare delicatamente le provette. Tenere le provette in ghiaccio.
8. Centrifugare le provette a 4560 xg per 10 min a 4 ° C. Trasferire il plasma sanguigno a nuove provette da microcentrifuga e conservare in -70 ° C fino a quando ulteriori analisi.

4. Analisi del sangue endoteliale Interazioni

1. Eseguire immunofluorescenza con il mouse CD16 anti-umano seguita da capra secondario anti-topo Alexa 488 e falloidina-TexasRed. Eseguire ogni fase di colorazione per 1 ora a temperatura ambiente e lavare i vetrini in PBS pH 7,4 tra ogni passo. Controcolorare i nuclei con DAPI per 10 min a temperatura ambiente. Analizzare emocomponenti legati alle cellule endoteliali mediante microscopia a fluorescenza in combinazione con analisi di immagine utilizzando adatto software di analisi di immagini come CellProfiler.
2. Quantify le reazioni nel vano di sangue con trombina-antitrombina (TAT) ELISA come da istruzioni dei campioni di plasma del produttore.
3. L'uso di adeguati strumenti statistici, ad es., Un t test per dati non appaiati, per analizzare i dati.

Risultati

La necessità di CHS rivestimento

Per misurare reazioni in sangue intero specifici a quelle sviluppate da cellule endoteliali, tutti i materiali utilizzati per la camera di cellule endoteliali sangue devono essere dotate di un rivestimento CHS prima dell'uso. Figura 2A (sinistra) mostra una camera non rivestito dopo 30 min di contatto del sangue con un coagulo ben visibile presente. Trattare la camera con CHS (Figura 2A, destra) invece protegge il sangue dall'attivazione incontrollata, assicurando che i risultati sono dovuti alle interazioni cellula-sangue endoteliali.

L'effetto del volume di sangue alla Camera

L'attivazione della coagulazione è più probabile nel sangue stagnante come la probabilità di interazione tra fattori della coagulazione attivati ​​aumenta. Nel modello camera di cellule endoteliali del sangue, il sangue viene tenuto in movimento a causa della circolazione di una bolla d'aria all'interno della camera. In order per determinare l'effetto di variazioni del volume di sangue, e quindi anche dimensioni delle bolle d'aria, una camera CHS rivestito è stato collegato ad un vetrino rivestito CHS che è stato testato con 1,5 ml o 1,75 ml di sangue intero per 30 min. Il volume di sangue senza alcun movimento dalla bolla d'aria è di 2,5 volte superiore se 1,75 ml di sangue viene aggiunto alla camera rispetto a quando 1,5 ml di sangue viene utilizzato (Figura 2B). I TAT-valori misurati suggerito un aumento TAT-formazione con un aumento del volume del sangue (Figura 2D). Quando HUVEC (Figura 2C) sono state incubate sia con 1,5 o 1,75 ml di sangue intero, nessuna differenza è stata osservata tra i due gruppi, suggerendo che le cellule endoteliali possono modulare l'attivazione della coagulazione (Figura 2D).

L'effetto del TNF sulla reclutamento dei globuli e attivazione della coagulazione

Al fine di studiare l'effetto di TNF sulla reclutamento dei leucociti, HUVEC erano deliziaed con 20 ng / ml TNF 4 ore prima di contatto con il sangue. Contatto sangue - sia con 1,5 ml o 1,75 ml di sangue - è stato continuato per 30 minuti dopo di che i vetrini di coltura sono state colorate per CD16 (Figura 2F), ripreso e il numero di cellule CD16 ⁺ è stato quantificato. Il reclutamento di cellule CD16 ⁺ è aumentato in modo significativo con il trattamento con TNF (Figura 2E) 100-256 CD16 ⁺ cellule / mm ² (p <0,0001) con 1,5 ml di sangue e 172-378 (P <0,0001) con 1,75 ml di sangue. La formazione di complessi TAT è stata misurata nei campioni plasmatici corrispondenti del sangue incubati con cellule sia TNFa trattati o non trattati (figura 2G). Cellule TNFa stimolato indotto un raddoppio approssimativo di complessi TAT rispetto alle cellule non trattate.

Ficoure 2: Funzionalità del modello di camera di cellule endoteliali del sangue. (A) Camere con o senza CHS sono stati incubati con sangue intero. Senza CHS, un coagulo si è formato dopo 30 min. Misura della trombina-antitrombina (TAT) complessi, un indicatore indiretto della coagulazione del sangue, in incubate senza CHS era> 6.000 mg / ml. (B) Il volume di sangue non mantenuto in movimento dalla bolla d'aria in rotazione varierà con diversi volumi di sangue. Con l'aggiunta di 1,5 ml di sangue, questo volume sarà 0,3 ml, mentre aumenterà a 0,74 ml con l'aggiunta di 1,75 ml. (C) HUVEC ripreso con microscopia a contrasto di fase mostra tipica morfologia delle cellule endoteliali di un monostrato confluente prima valori TAT per camere completamente CHS rivestiti contatto con il sangue. (D) mostrano una leggera differenza quando vengono aggiunti diversi volumi di sangue. L'aggiunta di 1,5 ml di sangue provocato 35 ± 11 mg / ml (n = 7) in confronto a 1,75 ml, che portano a 8577; 70 mg / ml TAT (n = 8). Questa differenza non è più presente quando HUVEC sono incubati con gli stessi volumi di sangue; 66 ± 55 mcg / ml per 1,5 ml (n = 5) e 66 ± 29 mcg / ml per 1,75 ml (n = 7). (E) Quantificazione del numero di cellule CD16 ⁺ presenti su entrambi non stimolato o TNFa stimolato HUVEC dopo contatto con il sangue. Il numero di cellule CD16 ⁺ è significativamente aumentata con TNF stimolato cellule incubate sia con 1,5 ml (basale: 100 ± 40 cellule / mm; TNF: 256 ± 121 cellule / mm) o 1,75 ml (basale: 172 ± 67 cellule / mm; TNF: 378 ± 185 cellule / mm) di sangue intero (F) Immagini rappresentative della non stimolato e TNFa stimolato HUVEC colorate per falloidina (rosso), CD16 (verde) e DAPI (blu).. Barra di scala = 250 micron (G) La formazione di complessi TAT è approssimativamente raddoppiata TNFa stimolato cellule rispetto alle cellule non trattate incubate con il sangue (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 volte più TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 volte più TAT, n = 4). Tutti i valori sono presentati come media ± deviazione standard; valori di p sono stati calcolati mediante test t spaiati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Molteplici interazioni tra il sangue e parete del serbatoio sono normalmente mantenute in stato di quiescenza a causa della natura non adesivo e anti-trombotica dell'endotelio. ⁷ In condizioni patologiche che coinvolgono l'infiammazione, l'endotelio viene attivato con un conseguente aumento dell'espressione del recettore di adesione ⁸ e una ridotta capacità di inibire l'emostasi. ⁹ Attivazione dei sistemi a cascata nel sangue, a sua volta amplifica la trombogenicità dell'endotelio causando ulteriore trombosi e il reclutamento dei leucociti. ¹⁰ Per ottenere una migliore comprensione di questa delicata interazione tra cellule endoteliali e sangue intero, abbiamo sviluppato un nuovo metodo in vitro in cui cellule endoteliali coltivate sono posti a contatto con sangue intero. A nostra conoscenza, la nostra messa a punto è il primo a mostrare le cellule endoteliali incubate con tutto il sangue umano con nulla o molto poco anticoagulante per periodi di tempo più lunghi.

nt "> La sensibilità di questo sistema è abilitato per venipuntura sistema aperto in combinazione con uno strato protettivo di eparina immobilizzata su tutte le superfici poste a contatto con il sangue. L'uso di un sistema aperto durante il prelievo del sangue riduce l'attivazione dei sistemi a cascata durante venipuntura pur consentendo l'uso di una quantità autodeterminata di anticoagulante. tubi evacuati sangue disponibili in commercio possono, tuttavia, essere usati a seconda dei punti di estremità destinate dello studio. La concentrazione finale di anticoagulante aggiunto ai tubi sistemi chiusi più disponibili in commercio possono inibire sensibili e altrimenti difficili da studiare, interazioni nel setup. ⁶ Una superficie eparina protettiva elimina ulteriore attivazione del sangue attraverso il contatto di superficie con superfici diverse dalle cellule endoteliali. ⁵ Infatti, l'incubazione di sangue intero addizionato con una piccola quantità di eparina non frazionata in Camera senza la protezione di CHS provocato formazione del coagulo.

La bolla d'aria all'interno della camera permette miscelazione del sangue durante l'incubazione con le cellule endoteliali. Per valutare l'effetto della dimensione delle bolle d'aria, sono stati utilizzati due differenti volumi di sangue. In questo modello, abbiamo misurato i livelli di TAT simili indipendentemente dalle dimensioni delle bolle d'aria nelle camere incubate con HUVEC. TAT era, tuttavia, è aumentata con una dimensione più piccola bolla d'aria nelle camere completamente CHS trattata. Questo, in conformità precedentemente descritte le proprietà delle cellule endoteliali ^11, indica un effetto regolatore sulla maggiore attivazione della coagulazione fornite dalle cellule endoteliali che manca nella camera CHS inerte. La bolla d'aria nel sistema crea un flusso alla rotazione della camera. La dimensione della bolla influenzerà le forze all'interno di questo sistema di rotazione. Ciò è dimostrato dai nostri risultati nella Figura 2D fosse una bolla più piccola crea valori TAT più alti rappresentano una forza ridotta sul cioè sangue, il flusso di sangueentro la camera è minore e quindi l'attivazione del sistema a cascata avviene in misura maggiore. Va ricordato che in questo sistema stiamo creando un flusso rotante che sarà diversa velocità attraverso la camera con la più alta velocità lungo le pareti e il basso al centro. Questo non è ovviamente un ambiente ottimale per quanto riguarda il flusso e sforzo di taglio per le cellule endoteliali, ma ancora abbiamo un sistema che produce risultati stabili e ripetibili. Ulteriori condizioni ottimali includerebbero circolanti flusso laminare in assenza di turbolenze. Questo, tuttavia, non è possibile nel modello rappresentato qui e alla nostra conoscenza un tale sistema non è ad oggi disponibili. Anche se, ci sono diversi sistemi microfluidici disponibili in commercio che non sono combinabili con sangue intero senza o con bassi livelli di anticoagulante aggiunto al sistema così sicuro da consentire un'adeguata valutazione sensibile delle interazioni tra tutti i componenti presenti nel sangue e nelle cellule endoteliali.

Inoltre, c'è stato un aumento di 2 volte nel reclutamento di cellule del sangue verso TNFa attivato HUVEC in combinazione con una formazione raddoppiato di TAT indipendentemente dal volume del sangue. Ciò verifica stabilità del sistema modello e mostra anche la possibilità di utilizzare un endotelio attivato in combinazione con sangue intero. Future su, la camera di cellule endoteliali di sangue può essere usato per studiare il reclutamento di cellule del sangue verso le cellule endoteliali attivate da una varietà di marcatori espressi sulle cellule in varie condizioni e fasi di attivazione. Inoltre, il modello può essere utilizzato in combinazione con agenti farmacologici per valutare gli effetti sulle condizioni infiammatorie.

In sintesi, si mostra il grande vantaggio di combinare un modello da camera con cellule del sangue e vascolari umane per creare un essere umano completo sistema in vitro per eseguire importanti indagini di malattia vascolare.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)	PromoCell	C-12200	Any other type of primary human endothelial cell may be used.
Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)	PromoCell	C-22120
Gelatin	Sigma-Aldrich	G-2500	Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.
TAT ELISA	Enzyme Research Lab.	TAT-EIA-C
Mouse anti-human CD16	DAKO	F7011	Dilution 1:100
Goat anti-mouse Alexa 488	Molecular Probes	A11001	Dilution 1:500
Phalloidin-Texas Red	Molecular Probes	A22287	Dilution 1:200
DAPI	Molecular Probes	D1306	Dilution 10 μg/ml
EDTA	Sigma	E-6758
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco Life Tecnologies	25200-056
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437
1 well cell culture slides	BD Falcon	354101
Blood Chambers	NA	NA	Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS
Clamps	Office Depot	2052204
Corline Heparin Surface (CHS)	Corline Systems AB	945-00
Hypodermic needle	Terumo	NN-1850R	Size: 18 G x 5 mm
Unfractionated Heparin (UFH)	Leo Pharma	585679
K3EDTA	Alfa Aesar	1709958	Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O
PFA	Sigma-Aldrich	P-6148
Fluorescence microscope	Nikon	80i
Light microscope	Nikon	TS100
Image analysis software	Broad Institute	CellProfiler	Available for free at www.cellprofiler.org