Строительство модульных гидрогеля листов для Micropatterned Макро-масштабного 3D Cellular архитектуры

Резюме

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Аннотация

Гидрогели можно рисунком на микро-масштабе с использованием микрожидкостных или micropatterning технологии, чтобы обеспечить в естественных условиях -подобных геометрию трехмерного (3D) тканей. Полученные 3D гидрогель на основе сотовой конструкции были введены в качестве альтернативы экспериментах на животных для продвинутых биологических исследований, фармакологических тестах при трансплантации органов и приложений. Хотя частицы гидрогеля на основе и волокна могут быть легко изготовлены, трудно манипулировать ими по восстановлению тканей. В этом видео мы опишем способ изготовления для micropatterned альгинат гидрогелей листов, вместе с их сборки, чтобы сформировать макро-масштабе системы 3D культуры клеток с управляемой сотовой микросреды. Использование тумана форму кальция желирующего агента, тонкие листы гидрогелевые легко получены с толщиной в диапазоне от 100 - 200 мкм, и с точными micropatterns. Клетки затем можно культивировать с геометрической руководством гидрогелевых листов вавтономные условия. Кроме того, гидрогель листы могут быть легко манипулировать с помощью микропипетки на конец вырезом наконечника, и могут быть собраны в многослойных структурах путем укладки их использовании рисунком полидиметилсилоксан (PDMS) кадра. Эти модульные гидрогелевые листы, которые могут быть изготовлены с использованием процесса, легкое иметь потенциальное применение в пробирке анализов лекарственных средств и биологических исследований, в том числе функциональных исследований микро- и макроструктуры и реконструкции ткани.

Введение

Гидрогели особенно перспективным биоматериалов, и, как ожидается, будет важно в фундаментальной биологии, фармакологических анализов и медицины. ¹ Biofabrication гидрогеля на основе клеточных конструкций было предложено сократить использование экспериментов на животных, ^2,3 заменить для трансплантации тканей, ⁴ и улучшить клеточных анализах. ^5,6 Водосодержащие (гидро-) вязкоупругие материалы (гели) позволяют большое количество клеток, которое необходимо инкапсулировать, и поддерживается в конструкции строительных лесов, чтобы контролировать клеточную микросреду 3D. В сочетании с руководством микрожидкостных или micropatterning технологий, геометри гидрогелевых конструкций можно точно контролировать на клеточном уровне. На сегодняшний день, разнообразие форм гидрогелей, в том числе частиц, ^{7 - 9} волокна, ^{10 - 12} и ¹³ листов, ^{- 15} были использованы в качестве строительных блоков в восходящей утверждения предметовболит в изготовлении макроуровне многоклеточных архитектур.

Оба частицы гидрогеля на основе волокна и были легко и быстро изготавливаются для применения как микро-масштабе сотовой среде, с использованием струйных управления микрожидкостных устройств. Тем не менее, в качестве основных единиц инженерных тканей, он будет сложно изменить их и увеличить их объем, как макро-масштабных конструкций. ¹⁶ Это труднее достичь макро-масштабе конструкции, чем производить микронных основные модули. Листового единиц гидрогеля на основе конструкций могут быть использованы для увеличения объема каркасов с помощью простого процесса сборки. Последовательно, укладываются слоями гидрогеля листов обеспечивают не только объемный рост, а также геометрическую расширение в 3D-пространстве.

Ранее мы уже сообщали способ изготовления micropatterned гидрогелевые листы, ^{13 - 15} вместе с их сборки в мульти-LayERed сотовой архитектуры. Метод позволяет сложную micropatterning и модульную конструкцию сотовых конструкций с помощью укладки процессе многослойных структур. Через изготовления уложенных листов модульных гидрогелевых, которые micropatterned, 3D системе культуры клеток с регулируемой макромасштабной сотовой микроокружения может быть реализован. Этот протокол описывает видео простой, но эффективный способ изготовления, которые могут быть использованы для построения модульных листов гидрогель, основанный на печени человека клеточной линии карциномы HepG2 (). Мы демонстрируем здесь, простой манипуляции этих узорчатых модульных гидрогеля листов, и их сборку в многоуровневой структуре.

протокол

1. Подготовка Micropatterned Пресс-формы и Гидрогели

1. Получения желаемого микроскопических моделей с использованием SU-8 фоторезиста на поверхности кремниевой пластины с помощью стандартного двухступенчатого техники фотолитографии ^15,17 для литья PDMS формы. В примере, показанном использует печени дольки, как сетчатый рисунок (рисунок 1).
2. Взвесить PDMS и раствор средства отверждения при соотношении 1: 5 (т.е. 12,5 г PDMS и 2,5 г отвердителя).
3. Смешайте 15 г раствора тщательно дегазировать пузырьков в вакуумной камере, а затем распространилась смешанный раствора на поверхности micropatterned кремниевой пластины равномерно в течение литья фольги блюдо.
4. Поместите кремниевой пластины на нагретую пластину 65 ° С в течение 90 мин на плоской поверхности, чтобы вылечить PDMS.
5. Удалить отвержденных PDMS из литейного блюдо и кремниевой пластины.
6. Отрежьте края PDMS и поместить его на 100 мм диаметра чашки Петри сmicropatterned стороной вверх.
7. Промыть micropatterned отвержденных PDMS на чашке Петри с использованием 70% этанола и дистиллированной воды для первичного стерилизации. Затем высушить их полностью в течение 10 мин в сушильном шкафу при 65 ° С.
8. Растворите и смешайте O / N 3 г порошкообразного неионогенного ПАВ в 100 мл дистиллированной воды, создавая 3% (вес / объем) раствора для нанесения покрытия.
9. Поместите micropatterned PDMS формы в плазме пылесоса и очистить их в течение 1 мин (85 Вт, 0,73 мбар), чтобы создать гидрофильную поверхность, чтобы облегчить добавление водных жидкостей. Затем покройте поверхность PDMS с 100 мл раствора ПАВ, по крайней мере 3 часа (Oro / N) с использованием лабораторного рокер.
10. Промыть раствор ПАВ из форм PDMS и высушить их полностью в печи при 65 ° С в течение 10 мин. Затем стерилизовать каждый micropatterned формы под воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения в течение 30 мин.

2. Подготовка клеточной суспензии в гидрогеле предшественника

1. Дляподготовки гидрогеля предшественника, растворить 0,1 г альгината натрия порошка в 10 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), создавая 1% (вес / объем) альгинат предшественника. Для полного растворения порошка, инкубировать и смешать их O / N.
2. Фильтр решение через 0,22 мкм фильтр, подключенный к 1 мл шприца.
3. Культура клеток HepG2 у модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина на обычном блюдо культуры ткани до 70% - 80% слияния в 5% _СО 2 увлажненном инкубаторе при 37 ° С ,
4. Промыть клетки один раз с помощью PBS, а затем Trypsinize их добавлением 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 4 мин в _5% CO 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Центрифуга клетки, полученные из культуральной чашке при 250 х г в течение 3 мин и ресуспендируют с помощью 1 мл PBS с последующим удалением супернатанта.
5. Подсчитайте количество одиночных клеток, распределенных в PBS с использованием автоматизированной ячейкуСчетчик.
6. После центрифугирования при 250 мкг в течение 3 мин и удалением PBS, добавить 1 мл 1% (вес / объем) раствора альгината натрия в оставшейся клеточного осадка и смешать их осторожно с помощью пипетки. Конечный плотности посева клеток должно быть 5 х 10 ⁶ - 10 ⁷ клеток / мл. Инкубируйте клеток / гидрогель суспензии в 5% _СО 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С.

3. Загрузка и Сшивание Cell / гидрогеля Подвеска

1. Растворить 1,47 г хлорида кальция обезвоживают в 100 мл DDH _{2 O} для получения сшивающего агента (т.е. 100 мМ CaCl ₂ · 2H _{2 O} в DDH ₂ O).
2. Промойте внутреннюю часть увлажнителя с помощью ультразвукового преобразователя 70% этанола, и заполнить его с 200 мл сшивающего реагента. Увлажнитель широкий 110 мм, длиной 300 мм и глубиной 170 мм (т.е., 110 мм х 300 мм х 170 мм (Ш х В х Г)).
3. Поместите micropatterned PDMSФормы в чистой плазмы и очистить их в течение 1 мин при 85 Вт, чтобы создать гидрофильную поверхность.
4. Стабильно загрузки 7,2 мкл хорошо перемешанной клеток / гидрогель суспензии при краю micropattern в форме. В примере, показанном использует печени дольки, как сетчатый рисунок (рисунок 1). Объем суспензии зависит от топографической рисунком.
5. Для достижения гелеобразование клеток / гидрогель суспензии, включить увлажнитель и убедитесь, что увлажнитель производит туман сшивающего реагента. Спрей сшивающий реагент в гидрогель предшественника в течение 5 мин, охватывающий топографическую поверхность пресс-формы PDMS в пределах 5 см.
   Примечание: Расстояния дольше и короче, чем 5 см может привести к неполному и неравномерное гелеобразование, соответственно. Убедитесь, что увлажнитель имеет скорости распыления 250 мл / ч, производя 20 мл тумане сшивающего реагента в течение 5 мин.
6. После процесса сшивки, выключите увлажнитель и заполнить мес PDMSLDS с PBS.

4. Обращение Одноместный модульный гидрогеля листов

1. Снять каждый закаленной гидрогеля лист из micropatterned форм с помощью пипетки PBS мягко вокруг гидрогеля листа с помощью пипетки 200 мкл.
2. Возьмите каждый гидрогеля лист плавающей используя 1000 мкл пипетки конец концевой вырезать. Каждый печени дольки, как сетка гидрогеля лист имеет размеры 8 мм х 8,7 мм, и 100 - толщиной 200 мкм.
3. Передача одного слоя гидрогеля листа в 1 мл DMEM в 12-луночный планшет и культивирования клеток в пробирке в плавающем способом с использованием гидрогель построить как единичный компонент в 12-луночный планшет в течение недели в 5 % СО ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Замените культуральной среды каждый день.

5. Ассамблея многослойные листы гидрогеля

1. Повторите шаги 1.1 до 1.5, чтобы произвести PDMS кадр с размерами 18 мм х 18 мм х 4 мм (Ш хВ х Г), и который содержит 170 мкм высокого столба структуры на нижней поверхности. Использование 42 г смеси PDMS и отвердителя, с тем же соотношением, что и в шаге 1.2. Поместите специализированный поликарбоната плесень на кремниевой пластине для PDMS кадр создать интерьер кадр с размерами 8 мм х 9 мм х 2 мм (Ш х В х Г).
2. Стерилизацию кадр PDMS и 180 мкм нейлоновый фильтр пор бумаги погруженный в дистиллированную воду и пинцетом в автоклаве в течение 15 мин при 121 ° С.
3. Поместите стерилизовать PDMS рамы, на четверть куска нейлона фильтровальную бумагу (с диаметром 5 см) в 60-мм чашек Петри диаметром.
4. Передача модульную гидрогеля лист в интерьере PDMS кадра с использованием 1 000 мкл пипетки конечного сократить. Гидрогель листов, используемых для сборки должны быть культивировали в течение по крайней мере день после того, как были сфабрикованы.
5. Совместите край каждого модульного гидрогеля листа с использованием PDMS кадра пустой 200 мкл пипетки,
6. Повторите шаги 5.4 и 5.5 с использованием модульных гидрогелевые листы, чтобы сформировать пачку 4 - 6 слоев.
7. Удалить культуральной среды течет его через столб структур на дне PDMS кадра. Затем добавляют 2 мкл раствора альгината (2% вес / об) в углу многослойной конструкции.
8. Спрей тумана сшивающий реагент в течение 30 сек на многослойной конструкции для крепления краев каждого слоя с теми другой. Использование 2 мл туман сшивающего реагента (при скорости распыления 250 мл / ч).
9. Промойте многоуровневую конструкцию осторожно 400 мкл DMEM и снимите PDMS кадр с помощью пинцета.
10. Снять многоуровневую конструкцию из фильтровальной бумаги, осторожно протирая клетки подъемника после добавления 4 мл DMEM.
11. Перевести многослойной построить на 6-луночного планшета, содержащего 3 мл DMEM с помощью фильтровальной бумаги, и культуру клеток в пробирке в плавающей манере, с гидрогеля построить вмногомасштабный сотовой каркас А в 6-луночный планшет в течение недели в 5% _СО 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Замените культуральной среды каждый день.

Результаты

Мы описали изготовление и манипуляции стоящая клеточные гидрогелевые листы. Как показано на рисунке 1, были изготовлены micropatterned PDMS формы, и клетки-содержащие гидрогель наносили на гидрофильной поверхности этих форм и сшитый с помощью увлажнителя дл...

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает простой способ изготовления модульных гидрогелевые листы, и собирая их, чтобы сформировать 3D клеточных каркасов.

Для построения четких узорчатые альгинатных структур в течение короткого времени, мы должны определить процесс сшивки, которые ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Powdered nonionic surfactant
Alginic acid sodium salt, low viscosity	Alfa Aesar	B25266
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Ultrasonic humidifier	MediHeim	MH-2800	Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr
Nylon net filter hydrofilic, 180 μm	EMD Millipore	NY8H04700
Polycarbonate mold			Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern