Construction de feuilles d'hydrogel modulaire pour micropatterned macro-échelle 3D Cellular architecture

Résumé

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Résumé

Hydrogels peuvent être modelés à la micro-échelle en utilisant des technologies microfluidiques ou micromodelage de fournir une vivo -comme géométrie en trois dimensions (3D) des tissus. Les constructions 3D résultant base d'hydrogel-cellulaires ont été introduits comme une alternative à l'expérimentation animale pour les études biologiques de pointe, essais pharmacologiques et les applications de transplantation d'organes. Bien que les particules et fibres à base hydrogel peuvent être facilement fabriqués, il est difficile de les manipuler pour la reconstruction tissulaire. Dans cette vidéo, nous décrivons un procédé de fabrication de feuilles d'hydrogel d'alginate microélectrodes, ainsi que leur assemblage pour former un système de culture cellulaire 3D macro-échelle avec un microenvironnement cellulaire contrôlée. Utilisation d'une forme de brouillard de l'agent gélifiant de calcium, de minces feuilles d'hydrogel peuvent être facilement générées avec une épaisseur dans la plage de 100 - 200 pm, et avec micropatterns précises. Les cellules peuvent ensuite être cultivées à l'orientation géométrique des feuilles d'hydrogel dansconditions autonome. En outre, les feuilles d'hydrogel peuvent être facilement manipulées en utilisant une micropipette avec une extrémité de bout en coupe, et peuvent être assemblés en structures multicouches en les empilant l'aide d'un polydiméthylsiloxane à motifs (PDMS) de trame. Ces feuilles d'hydrogel modulaires, qui peuvent être fabriqués en utilisant un procédé facile, ont des applications potentielles des essais in vitro de médicaments et les études biologiques, y compris les études fonctionnelles des micro- et macrostructure et la reconstruction des tissus.

Introduction

Les hydrogels sont particulièrement prometteurs biomatériaux, et devraient être importantes en biologie fondamentale, essais pharmacologiques et de la médecine. ¹ Biofabrication de constructions cellulaires à base hydrogel a été suggéré de réduire l'utilisation de l'expérimentation animale, ^2,3 remplacer des tissus transplantables, ⁴ et améliorer tests cellulaires. ^5,6 contenant de l'eau-hydrocarbures) (matériaux viscoélastiques (gels) permettent à un grand nombre de cellules à encapsuler et maintenu dans une structure d'échafaudage pour contrôler le microenvironnement cellulaire 3D. En combinaison avec la direction des technologies microfluidiques ou micromodelage, la géométrie des constructions d'hydrogel peut être contrôlée avec précision à l'échelle cellulaire. A ce jour, une variété de formes d'hydrogels, notamment des particules, ^{7 - 9, 10} fibres ^{- 12} et des feuilles, des ^{13 - 15} ont été utilisés comme unités de construction dans bottom-up approcourbatures à la fabrication de la macro-échelle des architectures multi-cellulaires.

Les deux particules et fibres à base hydrogel ont été facilement et rapidement fabriqués pour des applications comme les environnements cellulaires micro-échelle, avec des commandes fluidiques utilisant des dispositifs microfluidiques. Cependant, comme les unités de base de tissus d'ingénierie, ce serait compliqué pour les réorganiser et d'élargir leur volume comme des constructions macro-échelle. ¹⁶ Il est plus difficile de parvenir à des constructions macro-échelle que de produire des modules de base de taille micronique. Unités de constructions à base d'hydrogel-feuille peuvent être utilisés pour augmenter le volume des échafaudages via un processus d'assemblage simple. Par voie de conséquence, des couches empilées de feuilles d'hydrogel fournissent non seulement une augmentation volumétrique, mais aussi une extension géométrique dans un espace 3D.

Nous avons précédemment rapporté un procédé de fabrication de feuilles d'hydrogel microélectrodes, ^{de 13 à 15} ainsi que leur assemblage en multi-layarchitectures cellulaires Ered. La technique permet micromodelage complexe et de la conception modulaire des constructions cellulaires par l'intermédiaire d'un processus d'empilement de structures multicouches. Grâce à la fabrication de feuilles empilées d'hydrogel modulaires, qui sont microélectrodes, un système de culture cellulaire 3D avec un microenvironnement cellulaire macro-échelle contrôlée peut être réalisée. Ce protocole de vidéo décrit un procédé simple mais puissant de fabrication qui peut être utilisé pour construire des feuilles d'hydrogel modulaires, basé sur la lignée cellulaire de carcinome de foie humain (HepG2). Nous démontrons ici manipulation simple de ces feuilles d'hydrogel modulaires motifs, et leur assemblage dans une structure multi-couches.

Protocole

1. Préparation des moules microélectrodes et Hydrogels

1. Produire des motifs à petite échelle souhaités en utilisant SU-8 sur la surface d'une tranche de silicium par l'intermédiaire d'un en deux étapes de photolithographie ^15,17 technique standard pour la coulée des moules en PDMS. L'exemple représenté utilise un maillage du foie lobule-like (Figure 1).
2. Peser PDMS et d'une solution d'agent de durcissement avec un rapport de 1: 5 (à savoir, 12,5 g de PDMS et 2,5 g d'agent de durcissement).
3. Mélanger les 15 g de la solution soigneusement, dégazer les bulles dans une chambre à vide, puis la solution mixte se répandre sur une surface à motif fin de la tranche de silicium de manière homogène dans un plat feuille de coulée.
4. Placer la tranche de silicium sur une plaque chauffée à 65 ° C pendant 90 min sur une surface plane pour traiter les PDMS.
5. Retirer les PDMS durcis de la boîte de coulée et la plaque de silicium.
6. Coupez les bords des PDMS et le placer sur une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre avecmicroélectrodes le côté vers le haut.
7. Laver les PDMS durcis microélectrodes sur la boîte de Pétri en utilisant 70% d'éthanol et d'eau distillée pour la stérilisation primaire. Ensuite, séchez-les complètement pendant 10 min dans un four à 65 ° C.
8. Dissoudre et mélanger O / N 3 g de tensioactif non-ionique en poudre a dans 100 ml d'eau distillée, la création d'un 3% (p / v) de solution de revêtement.
9. Placer les moules en PDMS microélectrodes un filtre à plasma et les nettoyer pendant 1 min (85 W, 0,73 mbar) pour créer une surface hydrophile, afin de faciliter l'addition de liquides aqueux. Ensuite, enduire la surface des PDMS avec la solution 100 ml de tensioactif pendant au moins 3 h (ORO / N) à l'aide d'une bascule de laboratoire.
10. Laver la solution d'agent tensio-actif des moules PDMS et les sécher complètement dans un four à 65 ° C pendant 10 min. Ensuite, chaque moule microélectrodes stériliser par exposition à un rayonnement ultraviolet (UV) pendant 30 min.

2. Préparer la suspension de cellules dans un hydrogel Précurseur

1. Àpréparer précurseur d'hydrogel, dissoudre 0,1 g de poudre d'alginate de sodium dans 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), la création d'une 1% (p / v) d'alginate précurseur. Pour dissoudre la poudre complètement, incuber et les mélanger O / N.
2. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um reliée à une seringue de 1 ml.
3. Culture des cellules HepG2 dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine sur une boîte de culture tissulaire classique jusqu'à ce que 70% - 80% de confluence dans un incubateur humidifié à _5% de CO2 à 37 ° C .
4. Laver les cellules une fois à l'aide de PBS, puis les trypsiniser en ajoutant 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA pendant 4 min dans _un incubateur à CO2 humidifié à 5% à 37 ° C. Centrifuger les cellules récoltées à partir de la boîte de culture à 250 g pendant 3 min et remettre en suspension en utilisant 1 ml de PBS ci-après élimination du surnageant.
5. Comptez le nombre de cellules réparties simples dans PBS en utilisant une cellule automatiséecompteur.
6. Après centrifugation à 250 g pendant 3 min et l'enlèvement du PBS, ajouter 1 ml de 1% (p / v) de solution d'alginate de sodium pour le culot cellulaire restant et mélanger doucement en utilisant les pipetage. La densité d'ensemencement des cellules finale doit être de 5 x 10 ⁶ - 10 ⁷ cellules / ml. Incuber la suspension de cellules / hydrogel dans un incubateur humidifié à 5% de CO ₂ à 37 ° C.

3. Chargement et la réticulation de Cell / hydrogel Suspension

1. Dissoudre 1,47 g de chlorure de calcium dihydraté dans 100 ml d'ddH _{2 O} pour produire un réactif de reticulation (par exemple, 100 mM de CaCl ₂ · 2H ₂ O dans ddH ₂ O).
2. Rincez l'intérieur d'un humidificateur avec transducteur ultrasonique en utilisant 70% d'éthanol, et le remplir avec 200 ml de réactif de réticulation. L'humidificateur est de 110 mm de large, 300 mm de long et 170 mm de profondeur (par exemple, 110 mm x 300 mm x 170 mm (L x H x D)).
3. Placez les PDMS micropatternedmoules dans un nettoyeur à plasma et les nettoyer pendant 1 min à 85 W pour créer une surface hydrophile.
4. Charger régulièrement 7,2 pi de la suspension de cellules / hydrogel bien mélangé au bord de la micromotif dans le moule. L'exemple représenté utilise un maillage du foie lobule-like (Figure 1). Le volume de la suspension dépend du modèle topographique.
5. Pour atteindre la gélification de la suspension de cellules / hydrogel, allumer l'humidificateur et vérifiez que l'humidificateur produit une brume du réactif de réticulation. Pulvériser le réactif de reticulation sur le précurseur d'hydrogel pendant 5 min, recouvrant la surface topographique des moules PDMS dans une plage de 5 cm.
   Note: distances plus longues et plus courte de 5 cm pourraient provoquer la gélification incomplète et inégale, respectivement. Assurez-vous que l'humidificateur a un taux de pulvérisation de 250 ml / h, 20 ml de production de brouillard du réactif de reticulation à 5 min.
6. Après le processus de réticulation, éteignez l'humidificateur et remplir le mo PDMSlds avec PBS.

4. Traitement des feuilles simples hydrogel modulaire

1. Détachez chaque feuille d'hydrogel durcie des moules microélectrodes via pipetage PBS doucement autour de la feuille d'hydrogel à l'aide d'une pipette de 200 pi.
2. Pick-up chaque feuille d'hydrogel flottante utilisant un 1000 ul pointe de la pipette end end coupe. Chaque feuille d'hydrogel de maille lobule-comme le foie a des dimensions de 8 mm x 8,7 mm, et être 100 - 200 um d'épaisseur.
3. Transfert d'une seule couche de la feuille d'hydrogel dans 1 ml de DMEM dans une plaque à 12 puits, et la culture des cellules in vitro de manière flottante à l'aide de l'hydrogel construire en tant que composant de l'unité dans la plaque à 12 puits pendant une semaine dans un 5 _% de CO 2 incubateur humidifié à 37 ° C. Remplacez le milieu de culture tous les autres jours.

5. Les Fiches hydrogel Assemblée des multi-couches

1. Répétez les étapes 1.1 à 1.5 pour produire un cadre de PDMS avec des dimensions de 18 mm x 18 mm x 4 mm (L xH x D), et qui contient des structures de 170 um haute pilier à la surface inférieure. Utiliser 42 g du mélange de PDMS et d'agent de durcissement, avec le même rapport que dans l'étape 1.2. Placez un moule en polycarbonate spécialisée sur la plaquette de silicium pour le cadre PDMS afin de créer un cadre intérieur avec des dimensions de 8 mm x 9 mm x 2 mm (L x H x D).
2. Stériliser le cadre PDMS et 180 um-pores papiers filtres de nylon immergé dans l'eau distillée et des pinces dans un autoclave pendant 15 min à 121 ° C.
3. Placez le cadre PDMS stérilisée sur un quart d'un morceau de papier filtre en nylon (avec un diamètre de 5 cm) dans une boîte de Pétri de diamètre 60 mm.
4. Transférer une feuille d'hydrogel modulaire à l'intérieur du cadre PDMS en utilisant un 1000 ul pointe de la pipette final-cut. Les feuilles d'hydrogel utilisées pour l'assemblage doivent être cultivées pendant au moins un jour après qu'ils ont été fabriqués.
5. Alignez le bord de chaque feuille d'hydrogel modulaire avec le cadre PDMS en utilisant un 200 pi pointe de la pipette vide.
6. Répéter les étapes 5.4 et 5.5 en utilisant des feuilles d'hydrogel modulaires pour former une pile de 4 - 6 couches.
7. Retirer le milieu de culture par écoulement à travers lui les structures de pilier à la partie inférieure du cadre PDMS. Ajouter ensuite 2 ul de solution d'alginate (2% p / v) à un coin de la construction multicouche.
8. Pulvériser un brouillard du réactif de réticulation pendant 30 secondes sur le produit d'assemblage multi-couches pour fixer les bords de chaque couche avec ceux d'une autre. Utilisez 2 ml de brume du réactif de réticulation (à un taux de pulvérisation de 250 ml / h).
9. Rincer la construction multi-couches doucement avec 400 ul DMEM et enlever le cadre PDMS avec des pincettes.
10. Détachez la construction multi-couches du papier filtre en essuyant doucement avec une cellule de levage après l'addition de 4 ml de DMEM.
11. Transférer la construction à couches multiples pour une plaque à 6 puits contenant 3 ml de milieu DMEM en utilisant un papier filtre, et la culture des cellules in vitro de manière flottante, avec la construction d'hydrogel en tant queun échafaudage cellulaire multi-échelle dans la plaque de 6 puits plus d'une semaine dans un incubateur humidifié à 5% de CO ₂ à 37 ° C. Remplacez le milieu de culture tous les autres jours.

Résultats

Nous avons décrit la fabrication et la manipulation des feuilles d'hydrogel autoportante cellulaires. Comme le montre la Figure 1, nous avons fabriqué des moules PDMS microélectrodes, et un hydrogel contenant les cellules a été chargé sur la surface hydrophile de ces moules et réticulée en utilisant un humidificateur pour générer un brouillard d'aérosol de l'agent gélifiant. Suite à la publication des moules, les cellules HepG2 ont été cultivé...

Discussion

Ce protocole fournit une méthode simple de fabrication de feuilles d'hydrogel modulaires, et de les assembler pour former des échafaudages cellulaires 3D.

Pour construire des structures d'alginate à motifs claires dans un court laps de temps, nous devrions identifier un processus de réticulation qui peut créer des structures suffisamment rigides pour maintenir les micropatterns complexes du moule, ainsi que de maintenir la viabilité des cellules et le métabolisme. Nous avons d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Powdered nonionic surfactant
Alginic acid sodium salt, low viscosity	Alfa Aesar	B25266
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Ultrasonic humidifier	MediHeim	MH-2800	Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr
Nylon net filter hydrofilic, 180 μm	EMD Millipore	NY8H04700
Polycarbonate mold			Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern