Construção de Fichas de hidrogel modular para micropadronadas Macro-escalado 3D Cellular Arquitetura

Resumo

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Resumo

Os hidrogéis podem ser modelado na micro-escala utilizando tecnologias de microfluidos ou micropatterning para proporcionar uma geometria de tecido vivo -like (3D) tridimensional. As construções resultantes celulares baseados em hidrogel 3D foram introduzidos como uma alternativa para as experiências com animais para estudos biológicos avançados, os ensaios farmacológicos e as aplicações de transplantes de órgãos. Embora as partículas e fibras à base de hidrogel pode ser facilmente fabricado, é difícil para manipulá-los para a reconstrução de tecidos. Neste vídeo, nós descrevemos um método de fabrico de folhas de hidrogel de alginato micropatterned, juntamente com a sua montagem para formar um sistema de cultura celular 3D macro-escala com um microambiente celular controlada. Utilizando uma forma de névoa do agente gelificante de cálcio, folhas finas de hidrogel são facilmente gerado com uma espessura na gama de 100 - 200 um, e com micropadrões precisas. As células podem ser cultivadas, em seguida, com a orientação geométrica das folhas de hidrogel emcondições independentes. Além disso, as folhas de hidrogel pode ser prontamente manipulada utilizando uma micropipeta com uma ponta de corte final, e podem ser montados em estruturas de camadas múltiplas por empilhá-los utilizando um polidimetilsiloxano modelado (PDMS) moldura. Estas folhas de hidrogel modular, que pode ser fabricado usando um processo fácil, têm potenciais aplicações de ensaios in vitro e estudos biológicos de drogas, incluindo estudos funcionais de micro- e macro-estrutura e a reconstrução de tecidos.

Introdução

Os hidrogéis são particularmente promissores biomateriais, e espera-se ser importante na biologia de base, os ensaios farmacológicos e medicina. ¹ Biofabrication celulares de construções à base de hidrogel foi sugerido para reduzir o uso de experiências com animais, ^2,3 substituir tecidos transplantáveis, ⁴ e melhorar ensaios baseados em células. ^{5,6-di-hidro-} (contendo água) materiais viscoelásticos (geles) permitir que um grande número de células a ser encapsulado e mantida em uma estrutura de andaime para controlar o microambiente celular 3D. Em combinação com a orientação de tecnologias de microfluidos ou micropatterning, a geometria das construções de hidrogel pode ser controlada com precisão à escala celular. Até à data, uma variedade de formas, incluindo hidrogéis de partículas, ^{7 - 9,} fibras ^{10 - 12} folhas, e ^{13 - 15} foram utilizados como unidades de construção na ascendente aprodores para a fabricação de macro-escala arquitecturas multicelulares.

Ambas as partículas e fibras à base de hidrogel ter sido facilmente e rapidamente fabricados para aplicações como ambientes celulares micro-escala, com controles fluídicos usando dispositivos microfluídicos. No entanto, como as unidades básicas de tecidos artificiais, seria complicado para reorganizá-las e para ampliar seu volume de construções de macro-escala. ¹⁶ É mais difícil de alcançar construções macro-dimensionado do que produzir módulos básicos de tamanho mícron-. Unidades do tipo folha de construções à base de hidrogel podem ser utilizadas para aumentar o volume de andaimes por meio de um processo de montagem simples. Consequentemente, as camadas de folhas empilhadas hidrogel proporcionar não só um aumento volumétrico, mas também uma extensão geométrica no espaço 3D.

Temos anteriormente relatado um método de fabrico de folhas de hidrogel micropatterned, ^{13 - 15,} juntamente com a sua montagem em multi-layarquiteturas celulares recer. A técnica permite micropatterning complexo e design modular de construções de celulares através de um processo de empilhamento de estruturas multi-camadas. Através do fabrico de folhas de hidrogel modulares empilhados, os quais são micropadronadas, um sistema de cultura de células em 3D com um microambiente celular de macro-escala controlada pode ser realizada. Este protocolo de vídeo descreve um método de fabrico simples mas eficiente que pode ser utilizado para a construção de folhas de hidrogel modulares, com base na linha de células de carcinoma de fígado humano (HepG2). Nós demonstramos aqui simples manipulação dessas folhas hidrogel modulares padronizados, e sua montagem em uma estrutura multi-camadas.

Protocolo

1. Preparação da micropadronadas Moldes e hidrogéis

1. Produzir os padrões de micro-escala desejada usando SU-8 fotorresistente na superfície de uma pastilha de silício através de um de dois passos ^15,17 fotolitografia técnica padrão para a fundição de moldes de PDMS. O exemplo ilustrado utiliza um padrão de malha lóbulo semelhante fígado (Figura 1).
2. Pesar PDMS e uma solução de agente de cura com uma proporção de 1: 5 (isto é, 12,5 g de PDMS e 2,5 g de agente de cura).
3. Misturar a 15 g da solução exaustivamente, desgaseificar as bolhas numa câmara de vácuo, e depois espalhar a solução misturada sobre uma superfície micropadronadas da bolacha de silício uniformemente dentro de um prato de moldagem de folha.
4. Coloque a bolacha de silício sobre uma placa aquecida a 65 ° C durante 90 minutos sobre uma superfície plana para curar o PDMS.
5. Remover o PDMS curado a partir da placa de moldagem e a bolacha de silício.
6. Corte as bordas do PDMS e colocá-lo sobre uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro comDo lado de cima micropadronadas.
7. Lavar o PDMS curados micropadronadas na placa de petri usando etanol a 70% e água destilada para a esterilização primário. Em seguida, secá-las completamente durante 10 min numa estufa a 65 ° C.
8. Dissolve-se e mistura-O / N 3 g de um agente tensioactivo não iónico em pó em 100 ml de água destilada, a criação de um 3% (w / v) de solução de revestimento.
9. Colocar os moldes PDMS micropatterned em um aspirador de plasma e limpá-los durante 1 min (85 W, 0,73 mbar) para criar uma superfície hidrófila, a fim de facilitar a adição de líquidos aquosos. Em seguida, o revestimento da superfície do PDMS com a solução de 100 ml de agente tensioactivo, pelo menos, 3 h (ORO / N) utilizando um balancim laboratório.
10. Lava-se a solução de agente tensioactivo a partir dos moldes de PDMS e secá-las completamente num forno a 65 ° C durante 10 min. Em seguida, cada um dos moldes micropadronadas esterilizar por exposição a radiação ultravioleta (UV) ao longo de 30 min.

2. Preparar a suspensão de células num hidrogel Precursor

1. Parapreparar hidrogel precursor, dissolver 0,1 g de alginato de sódio em pó em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), a criação de um 1% (w / v) de alginato de precursor. Para dissolver completamente o pó, incubar e misturá-los O / N.
2. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um ligado a uma seringa de 1 ml.
3. Cultura das células HepG2 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina em um prato de cultura de tecidos convencional até 70% - 80% de confluência numa incubadora humidificada com _5% de CO2 a 37 ° C .
4. Lavar as células uma vez utilizando PBS, e em seguida, trypsinize-los por adição de 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA durante 4 minutos numa atmosfera de 5% de CO ₂ a 37 incubadora humidificada ° C. Centrifugar as células colhidas a partir da placa de cultura a 250 xg durante 3 min e ressuspender utilizando 1 mL de PBS, após a remoção do sobrenadante.
5. Contar o número de células individuais distribuídos em PBS utilizando uma célula automatizadobalcão.
6. Após a centrifugação a 250 xg durante 3 minutos e remoção do PBS, adicionar 1 ml de 1% (w / v) da solução de alginato de sódio para o sedimento celular remanescente e misturá-las suavemente utilizando pipetagem. A densidade de sementeira final das células deve ser de 5 x 10 ⁶ - 10 ⁷ células / ml. Incubar a suspensão de células / hidrogel numa incubadora humidificada 5% CO ₂ a 37 ° C.

3. Carregamento e Cross-linking de celular / Hidrogel Suspensão

1. Dissolve-se 1,47 g de cloreto de cálcio desidratado em 100 ml de _ddH2O para produzir um reagente de ligação cruzada (isto é, 100 _mM CaCl2 · 2H _{2 O em ddH2O).}
2. Lave o interior de um umidificador com transdutor ultra-sônico usando 70% de etanol, e encha-o com 200 ml de reagente de reticulação. O umidificador é de 110 mm de largura, 300 mm de comprimento e 170 mm de profundidade (ou seja, 110 mm x 300 mm x 170 mm (W x H x D)).
3. Coloque os PDMS micropatternedmoldes em um aspirador de plasma e limpá-los durante 1 min a 85 W para criar uma superfície hidrófila.
4. Firmemente carregar 7,2 ul da suspensão de células / hidrogel bem misturado na borda do micropadrão no molde. O exemplo ilustrado utiliza um padrão de malha lóbulo semelhante fígado (Figura 1). O volume da suspensão depende do padrão topográfico.
5. Para conseguir a gelificação da suspensão de células / hidrogel, ligar o humidificador e verificar que o humidificador produz uma névoa do reagente de reticulação. Pulverizar o reagente de ligação cruzada para o precursor de hidrogel durante 5 min, cobrindo a superfície topográfica dos moldes PDMS no intervalo de 5 cm.
   Nota: distâncias mais longas e mais curtas do que 5 cm poderia provocar a gelificação incompleta e desigual, respectivamente. Assegure-se que o humidificador tem uma taxa de pulverização de 250 ml / h, produzindo 20 ml de névoa do reagente de reticulação em 5 min.
6. Após o processo de cross-linking, desligue o humidificador e encher o mo PDMSLDS com PBS.

4. Transporte de folhas soltas Modular de hidrogel

1. Retire cada folha hidrogel endurecido a partir dos moldes micropatterned via pipetando PBS suavemente em torno da folha de hidrogel com uma pipeta de ponta de 200 mL.
2. Pegue cada folha hidrogel flutuante usando um 1000 ul final da ponteira de corte final. Cada malha folha hidrogel lóbulo-como fígado tem dimensões de 8 mm x 8,7 milímetros, e ser 100-200 mm de espessura.
3. Transferir uma única camada de folha de hidrogel em 1 ml de DMEM numa placa de 12 poços, e a cultura das células in vitro, de uma forma flutuante utilizando o hidrogel de construir como um componente de unidade na placa de 12 poços durante uma semana num 5 % de CO ₂ humidificado incubadora a 37 ° C. Trocar o meio de cultura todos os dias.

5. Fichas de hidrogel Assembléia de multi-camadas

1. Repita os passos 1.1 a 1.5 para produzir uma armação de PDMS com as dimensões de 18 mm x 18 mm x 4 mm (W xH x D), e que contém estruturas de 170 mícrons de alta pilar na superfície inferior. Use 42 g da mistura de PDMS e agente de cura, com a mesma proporção que no passo 1.2. Coloque um molde de policarbonato especializada no wafer de silício para o quadro de PDMS para criar um quadro interior com dimensões de 8 milímetros x 9 mm x 2 mm (W x H x D).
2. Esteriliza-se o quadro de PDMS e 180 mícrons de poros papéis de filtro de nylon submerso em água destilada e pinças numa autoclave durante 15 min a 121 ° C.
3. Colocar o PDMS quadro esterilizado para um quarto de um pedaço de papel de filtro de nylon (com um diâmetro de 5 cm) de um 60-mm de diâmetro prato de petri.
4. Transferir uma folha de hidrogel modular para o interior da armação de PDMS usando uma pipeta de ponta de 1.000 ul de corte final. As folhas de hidrogel utilizados para a montagem deve ser cultivadas por pelo menos um dia depois de terem sido fabricados.
5. Alinhe a borda de cada folha hidrogel modular com o quadro PDMS usando um vazio de 200 ul ponteira.
6. Repita os passos 5.4 e 5.5 usando folhas de hidrogel modulares para formar uma pilha de 4 - 6 camadas.
7. Remover o meio de cultura por ele flui para fora através das estruturas de pilar na parte inferior da armação de PDMS. Em seguida, adicionar 2 ml de solução de alginato a 2% (w / v) a um canto da construção de multi-camada.
8. Pulverizar uma névoa do reagente de reticulação durante 30 seg para a construção de multi-camadas para ligar as pontas de cada uma das camadas com as de outro. Utilizar 2 ml de névoa de o reagente de ligação cruzada (a uma taxa de pulverização de 250 ml / hr).
9. Lavar a construção de multi-camadas suavemente com 400 mL DMEM e retire a armação PDMS usando uma pinça.
10. Retire a construção de multi-camadas de papel de filtro limpando suavemente com uma célula levantador após a adição de 4 ml de DMEM.
11. Transferir a multi-camadas para construção de uma placa de 6 cavidades contendo 3 mL de DMEM utilizando papel de filtro, e as células de cultura in vitro de uma forma flutuante, com o hidrogel como construirum andaime celular multi-escala na placa de 6 poços durante uma semana numa incubadora humidificada 5% CO ₂ a 37 ° C. Trocar o meio de cultura todos os dias.

Resultados

Nós descrevemos a fabricação e manipulação de autônomo folhas hidrogel celulares. Como mostrado na Figura 1, nos moldes fabricados micropatterned PDMS, e hidrogel contendo as células foi carregada na superfície hidrofílica destas moldes e reticulada usando um humidificador para gerar uma névoa de aerossol de agente gelificante. Após libertação dos moldes, as células HepG2 foram cultivadas em folhas independentes de hidrogel com diferentes p...

Discussão

Este protocolo proporciona um método simples de fabricar folhas de hidrogel modulares, e montá-los para formar suportes celulares 3D.

Para construir estruturas claras de alginato modelado num curto espaço de tempo, que deverá identificar um processo de ligação cruzada que pode criar estruturas suficientemente rígida para manter os micropadrões complexas do molde, bem como a manter a viabilidade celular e metabolismo. Desenvolvemos um processo de reticulação, incluindo uma transiç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Powdered nonionic surfactant
Alginic acid sodium salt, low viscosity	Alfa Aesar	B25266
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Ultrasonic humidifier	MediHeim	MH-2800	Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr
Nylon net filter hydrofilic, 180 μm	EMD Millipore	NY8H04700
Polycarbonate mold			Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern