Функциональная Клонирование Использование<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов выражение системы

Резюме

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Аннотация

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Введение

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Университета Вирджинии Уходу за животными и использованию комитета.

Примечание: на фиг.1 показан схематический обзор экспериментальных процедур.

1. Подготовка ооцитов

1. Предварительно премьер Х. Laevis самок с 150 U беременных Маре Сыворотка гонадотропин (PMSG) примерно за одну неделю до начала изоляции ооцитов. Вводите 1 мл 150 U / мл PMSG в спинной лимфатический мешок с 1 см стерильного шприца с иглой 29 G.
2. Готовят растворы для инъекций ооцитов и ооцитов животного крышки анализа.
   1. Подготовка Ca ⁺⁺ / ^Mg ++ -бесплатный OR 2 (OR2-): 82 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,5 мМ _Na 2 HPO _{4, 50} мМ HEPES рН 7,2.
   2. Подготовка OR 2: OR2- плюс 1 мМ CaCl _{2 и} 1 мМ MgCl _2.
   3. Подготовьте OCM: 60% Лейбовиц L15, 0,4 мг / мл BSA, 100 мкг / мл гентамицина, рН 7,8.
   4. Заранеечистить 1x MBS: 88 мм NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl _2, 1 мМ MgSO _4, 5 мМ HEPES (рН 7,8), 2,5 мМ NaHCO _3.
   5. Подготовьте 3% Ficoll в 1x MBS.
   6. Приготовьте 1х NAM: 110 мм NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ Са (NO _{3) 2,} 1 мМ MgSO _4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaHCO _3, Na 2 мМ _{3 PO} 4, рН 7,4.
3. Обезболить самку в 0,03% раствора этил 3-аминобензойной кислоты соли метансульфокислоты (MS222) в 0.1x MBS (первый растворить 0,3 г MS222 в 10 мл 95% -ного этанола, а затем разбавленной в 1 л 0,1 x MBS), поместив лягушки в растворе для 10 - 15 мин или до отвечать на запросы.
   1. Убедитесь, что анестезия является полным поворотом наркозом лягушку на спину, чтобы убедиться, что он не реагирует (полностью анестезию лягушки двигаться конечности или повернуть тело на).
4. Хирургическим изолировать яичников фрагменты, сделав надрез в животе через кожу и стенки тела с лезвие скальпеля, изолируя ткани яичника с щипцамии ножницы. Поместите яичников фрагменты в OR2-. Закройте стенки тела с 3-0 шелковой нити на 24 мм изогнутой иглы и закрыть кожу отдельно с теми же швами. Разрешить восстановление женского в 1 г / л аквариумной соли в воде.
5. Использование тонких щипцов, слезоточивый ткани яичника в малых (10 - 20 ооцитов) штук и передачи свежей OR2-.
6. Defolliculate яичников фрагменты в 2,0 мг / мл коллагеназы А в OR2- перемешиванием осторожно шейкере в течение 1 ч, перенос на свежий коллагеназы и перемешивания в течение одного часа.
7. Вымойте ооцитов в 10 раз OR2 [содержащие Са ⁺⁺ / Mg ^++], отбрасывая мелкие ооциты.
8. Вымойте ооцитов в ОПК в два раза и перенести на свежий ОПК. Изолировать Стадия VI ооциты по размеру при визуальном осмотре и отбросить незрелых (меньше) ооцитов: Стадия VI ооциты больше незрелых ооцитов с еще пигментации в животном полушарии и примерно 1,2-1,4 мм в диаметре.
9. Поддержание ооцитов на 18 - 20 ° C Iн ОЦМ перед инъекцией. Примечание: в агарозном покрытием чашки Петри могут быть использованы для минимизации прилипания ооцитов блюдо.

2. Инъекции библиотечных стенограммы

1. Подготовьте направленного библиотека кДНК ^15, используя РНК извлеченного на соответствующем этапе развития (например, нервная пластинка этап ¹⁴ 10). Покупка библиотеки кДНК или построить одну использованием коммерческого набора в соответствии с информацией в четыре этапа ниже.
   1. Изолировать примерно 5 мкг мРНК, используя продукт для обогащения поли (А) + РНК (табл материалов) и в соответствии с инструкциями изготовителя. Примечание: транскрипты, которые будут использоваться для получения библиотеки кДНК могут быть ограничены индуцирующего ткани (например, нервной пластинки, после микродиссекции желаемой ткани), или может быть из цельного эмбрионов на определенной стадии.
   2. Продукция кДНК с коммерческого набора, следуя указаниям изготовителя.
   3. Перевязывать примерно 20 нг кДНК в VectoR входит в коммерческого набора или другого подходящего вектора. Соответствующий плазмидный вектор включает последовательности мРНК для стабильности, такие как 5 'бета-глобина и 3 поли (А) последовательностей (шт.2 +, pTnT, pCS105).
   4. Transform перевязка в компетентные бактериальных клеток с использованием рекомендованный протокол поставщика для преобразования теплового шока.
      Примечание: В качестве альтернативы, сборник открытой рамки считывания (ORFeome) клонов коммерчески доступен и может быть использован для создания транскриптов для инъекций.
2. Подготовьте 10 бассейнов плазмид от 10 ³ до 10 ⁴ сложности ⁽¹⁰ 4 до 10 ⁵ Общий сложности). Это представляет 10 пластин с 1000 - 10000 колоний каждого.
   1. Тарелка библиотека культуры на 10 15 см LB-ампициллин пластинах, растут 12 - 18 ч при 37 ° С, и собирать колонии друг от нежным давлением со стеклянной разбрасыватель в 7 мл LB.
   2. Подготовьте глицерине от 0,5 мл (добавить в 0,2 мл стерильной глицерина и хранят при -20 &# 730; С), и использовать оставшиеся 6,5 мл подготовить ДНК со стандартной коммерчески доступной ДНК минипрепаративную комплект следующим направлениям производителя.
3. Линеаризации объединенного плазмидной ДНК (1,0 - 2,0 мкг) с соответствующим ферментом рестрикции переварить ¹⁶ при 37 ° С в течение 1 - 1,5 ч. Изолировать линеаризованной ДНК с экстракцией фенолом / хлороформом с последующим осаждением этанолом и ресуспендирования в воде согласно спецификациям набора РНК-полимеразы, используемой. Обобщить смысл РНК с коммерческого набора РНК-полимеразы следующим направлениям производителя.
4. Подготовка иглы для микроинъекции (используя иглы съемник с стеклянной капиллярной трубки) приблизительно 20 мкм диаметром; измерения иглы советы по сложным микроскопом с калиброванной окулярного микрометра. Примечание: Настройки съемник иглы должны быть определены эмпирически для получения иглу с помощью тоненького кончика, что, когда порвал с тонким пинцетом дает нужный размер наконечника.
5. Приготовьтесь (нажать глину вравномерным слоем на дне тарелки) глины выстроились 35 х 10 мм чашки Петри с параллельными канавками, чтобы держать ооцитов в месте во время микроинъекции; производить канавки с молл зонда или пипетки Пастера плавленого на кончике в пламени. В качестве альтернативы глины, подготовки агарозном блюда делает углубления с эластомерной плесени ^17. Передача ооцитов с широким отверстием пипетки до 3% Ficoll в 1X MBS (примерно 2 мл) в строках в глиняных картонных блюд.
6. Использование microinjector, заполните иглу с 1 нг / нл РНК и настроить баланс, чтобы произвести небольшое положительное давление (для предотвращения составления цитоплазме ооцита).
7. Вводите ооциты с примерно 20 нл РНК в экваториальной области. Разрешить 1 час для инъекции ооцитов, чтобы остаться в Ficoll-MBS, а затем перенести мягко 1x MBS. Инкубировать в течение 8 - 24 часов при 20 ° С до животного крышки анализа.

3. Животное Кап Анализ

1. Подготовьте 3 / 4x NAM и получить тонкий пинцет, цикл волос, изогнутые фрагменты покровное, глиняные картонных DISГЭС с чашеобразных углублений провести ооцитов. Сделать изогнутые фрагменты покровного по разваливается покровные стекла на мелкие фрагменты (примерно 1 - 2 мм х 2 - 4 мм) и не проходя через пламя до краев ногтей и свисать, создавая изогнутую часть.
2. Оплодотворите X. Laevis яйца ^{18 через} в пробирке или природного спаривания и культуры гаструлы (10 - 11 ч после оплодотворения при комнатной температуре) в 0.1x MBS до сортировать по сцене; собирать середине гаструла (этап 11 - 11,5) ¹⁰ эмбрионов.
3. Эмбрионы перевод в чашке Петри примерно наполовину с 3/4-кратным ДН. Использование двух пар тонких щипцов, удалить оплодотворения (желточный) мембрану из гаструлы.
4. Передача ооцитов 3 / 4x ДН (примерно 2 мл) в глиняных картонных блюд и иммобилизации в отдельных впечатлений в глине, производя впечатления для размещения индивидуальных эмбрионов в канавки были описаны выше.
5. Эмбрионы передачи в глиняных картонных блюд и сократить шапки животных от гastrulae с помощью двух пар тонких щипцов. Позаботьтесь, чтобы изолировать животное колпачок эктодермы только и не экваториальный ткани ^18.
6. Поместите животное колпачок на животных полушарии каждого ооцита с внутренней поверхностью, контактирующей животного крышкой ооцит. Удержание рекомбинантов вместе с применением изогнутого стекла покровное фрагмент и применения понижающее давление на стекло, уплощение эктодермы, как покровное контактов глину (колпачки животное может оставаться открытой с внутренним слоем воздействию поверхности ооцита на 6 - 8 ч или больше ).
   Примечание: В качестве альтернативы, поместите животное колпачок в глиняном отступа с его внутренней поверхности вверх и разместить яйцеклетки на крышке; обеспечить рекомбинантный с небольшими расширениями глины.
7. Культура в 20 ° С до контрольных эмбрионов не достигают желаемого почву для анализа.
8. Отдельная рекомбинантный путем удаления покровное / глины и выделения эктодермы щипцами и петлей для волос.
9. Fix эктодермальные фрагменты в течение 1 часа в MEMFA (3,8%формальдегида в MEM [М MOPS 0,1 рН 7,4, 2 мМ EGTA, 1 мМ и _MgSO 4]).
10. Фрагменты передачи (и эмбрионы управления) от MEMFA в этаноле и хранят при -20 ° С.

4. Анализ ответов в эктодермы по гибридизация (ISH)

1. Готовят растворы для ISH.
   1. Подготовка 1X PBS: 0,01 М фосфатный буферный солевой раствор NaCl, 0,138 М, рН 7,4
   2. Подготовьте PBS-Tween (PTW): 1X PBS, 0,1% Tween-20
   3. Приготовьте раствор 100X Денхарта: 2% BSA, 2% поливинилпирролидон, 2% фиколл
   4. Подготовка гибридизации буфер: 50% формамида, 5x SSC, 1 мг / мл РНК дрожжей Torula, 1 мкг / мл гепарина, раствора 1x Денхарта, 0,1% Твин-20, 0,1% CHAPS, 10 мМ ЭДТА, _DEPC-H 2 O
   5. Подготовьте малеиновой кислоты буфера (МАВ): 100 мм малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, рН 7,5
   6. Подготовка МАБ + блок: МАБ, 2% блокирующий реагент (тепла до 60 ° С, чтобы растворить)
   7. Подготовка щелочной фосфатазы (AP) буфера: 100 мМ ТрисрН 9,5, 50 мМ MgCl _2, 100 мМ NaCl, 0,1% Твин, дН _{2 O}
2. Подготовка РНК зонд.
   1. Использование коммерческого набора РНК-полимеразы и рыть-NTP смесь, добавить 1,5 мл трубки (50 мкл реакции): 25,5 мкл _DEPC-H 2 O, 10 мкл 5X транскрипции буфера, 2,5 мкл 10х DIG-NTP смесь, 5 мкл 100 мМ ДТТ, 2 мкл Rnasin, 2 мкл ДНК-матрице линеаризованной (~ 1 мкг / мкл), 3 мкл РНК-полимеразы и инкубируют 37 ° С в течение 90 мин.
   2. Добавить 2 мкл РНК-полимеразы и инкубировать 37 ° C в течение 60 мин.
   3. Проверка 2 мкл реакции на 1% агарозном геле.
   4. Добавить 1 мкл RQ1 РНКазы ДНКазы и инкубировать 37 ° C в течение 20 мин.
   5. Осадок зонд путем добавления 50 мкл _DEPC-H 2 O, 25 мкл 10 М ацетата аммония и 313 мкл этанола. Хранить при -20 ° С в течение ночи (O / N) затем восстановить РНК центрифугированием при 13800 х г в течение 20 мин. Промыть 500 мкл 75% этанола, кратко спина, удалитьэтанол и позволяют гранулы высохнуть на воздухе. Добавить 50 мкл _DEPC-H 2 O.
   6. Добавить гибридизации буфер до конечной концентрации ~ 0,5 мкг / мкл.
3. Подготовка ткани для гибридизации. Если не указано иное, заполнения флаконов на вершину с каждым изменением Решение, описанное (приблизительно 4 мл).
   1. Удалить этанола из флаконов и эмбрионов передачи в 75% этанола / PTW, то 50% этанол / PTW в течение 10 мин каждый, горизонтально на качалке.
   2. Вымойте три раза в PTW в течение 5 мин каждый на качалке.
   3. Трансфер до 10 мкг / мкл протеиназы К лечения в PTW; рок трубки вертикально 15 мин.
   4. Промыть два раза 10 минут каждый в 0,1 М триэтаноламин рН 7,8 - рок труб по вертикали.
   5. Добавить 12,5 мкл уксусного ангидрида в пробирки и рок вертикально 5 мин. Повторите с дополнительной уксусного ангидрида 12,5 мкл в течение 5 мин.
   6. Стирать в PTW 5 мин на рокера вертикально.
   7. Refix в 4% параформальдегид 20 мин на качалке. Тепло Гибридизация буфера60 ° C.
   8. Вымойте три раза в PTW в течение 5 мин каждый на качалке.
   9. Удалить все, но ~ 1 мл PTW из каждой пробирки и добавить 250 мкл Hyb буфера; нежно вихревой трубы, чтобы перемешать. Рок трубы вертикально 5 мин.
   10. Замените 60 ° Hyb буфера (0,5 мл) и перемешивают осторожно в 60 ˚C 10 мин. Замените свежим Hyb буфера и агитировать на 60 ˚C два 4 ч.
   11. Тепло зонд (1 мл на 0,5 мкг / мкл в буфере Hyb) до 60 ° С (3 мин). Удалить Hyb буфера и добавить зонд труб. Перемешайте осторожно O / N на 60 ° C.
4. Подготовка ткани для антитела.
   1. Теплый Hyb буфера и 2x SSC + 0,1% Tween-20 решения 60 °.
   2. Заменить зонд решение с Hyb буфера (сохранить зондов при -20 ° С в течение 2 - 3 раза повторного). Мыть в 60 ° С в течение 10 мин.
   3. Вымойте три раза при 60 ° С в 2х SSC-Tween (20 мин каждый при перемешивании).
   4. Вымойте три раза при 60 ° С в 0,2 x SSC-Tween (20 мин каждый при перемешивании).
   5. Вымойте два раза в МАБ (RT) в течение 15 мин каждый горизонтально на качалке.
   6. Добавить 1 мл МАБ + блок. Вымойте 2 ч вертикально на качалке.
   7. Трансфер в 1 мл МАБ + блока, содержащего 1/2000 Anti-дигоксигенин-AP. Rock вертикально в 4 CO / N.
5. Подготовка ткани для цвета реагента.
   1. Заменить раствор антител с МАБ; мыть три раза в МАБ 5 мин каждый горизонтально на качалке.
   2. Вымойте три раза в МАБ 1 час каждый горизонтально на качалке.
   3. Вымойте два раза в AP буфера 10 мин каждый горизонтально на качалке.
   4. Передача ткани многократного а пластиковый лоток, удалить AP буфером и BM Фиолетовый реагента (~ 1 мл). Разрешить протекания реакции в темно-5 мин до O / N.
   5. При необходимости окрашивания достигается, трансфер ткани флаконов PTW. Вымойте два раза 10 минут в каждом PTW на качалке.
   6. Fix в растворе Буэна в 4 CO / N на качалке.
   7. Промойте Буэна с тремя 70% этанола / 30% PTW моет при комнатной температуре. Действуйте тО захвата изображения с помощью эпи-освещение и микроскопа монтажа камеры, отбеливание, при необходимости, ^{18 лет.}

5. Сиб Выбор и клонирование

1. Выберите бассейн с высокой активностью (наибольший резонанс в ткани эктодермы).
2. Титрование (разбавить LB для соответствующей плотности) в глицерине для бассейна с высокой активностью и пластины из десяти новых пластин с примерно одной десятой колонии от предыдущей стадии (с использованием раздел 2 в протоколе выше).
3. Уменьшить размер пула, пока деятельность не прослеживается в одной колонии.
4. Получение ДНК-последовательность, с использованием стандартных праймеров в векторе.

Результаты

В ответ на экспрессию мРНК введенного в ооцитах, отвечая животных колпачок ткань анализировали на экспрессию Otx2 от гибридизация (рисунок 2 и таблица 1); Otx2 выражается в предполагаемый линзы эктодермы (PLE) от закрытия нервной трубки через...

Обсуждение

Способ, описанный здесь, для функционального клонирования генов, способных индуцировать ответ в компетентный эктодермы может быть использован, чтобы идентифицировать широкий спектр продуктов генов. Этот метод расширяет прошлой работе путем объединения ткани вызывающие анализы мето...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library