Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

Riepilogo

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Abstract

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Introduzione

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dalla University of Virginia Istituzionale Animal Care and Use Committee.

Nota: la figura 1 mostra una panoramica schematica delle procedure sperimentali.

1. Preparazione di ovociti

1. Pre-prime X. laevis femmine con 150 U di Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) circa una settimana di anticipo di isolamento degli ovociti. Iniettare 1 ml 150 U / ml PMSG in dorsale linfa sac con 1 cc siringa sterile con 29 ago G.
2. Preparare le soluzioni per l'iniezione degli ovociti e degli ovociti animale cap test.
   1. Preparare ^Ca ++ / Mg ^++-free OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mm Na ₂ HPO _4, 50 mM HEPES pH 7,2.
   2. Preparare OR2: OR2- più 1 mM CaCl ₂ e 1 mm MgCl _2.
   3. Preparare OCM: il 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml di BSA, 100 mg / ml Gentamicina, pH 7,8.
   4. Prepare MBS 1x: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mm CaCl _2, 1 mM MgSO _4, 5 mM HEPES (pH 7.8), 2.5 NaHCO _{mm 3.}
   5. Preparare 3% Ficoll in 1x MBS.
   6. Preparare NAM 1x: 110 mM NaCl, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO _{3) 2,} 1 mM MgSO _4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO _3, 2 mM Na ₃ PO _4, pH 7.4.
3. Anestetizzare la femmina in una soluzione 0,03% di Ethyl sale metansolfonato 3-amminobenzoato (MS222) in 0.1x MBS (prima sciogliere 0,3 g MS222 in 10 ml di etanolo 95%, poi diluite in 1 L 0.1x MBS) ponendo rana in soluzione per 10-15 minuti o fino a quando non risponde.
   1. Verificare che l'anestesia è completa ruotando rana anestetizzato sulla schiena per assicurarsi che non risponde (non completamente rane anestetizzati muovere gli arti o girare corpo sopra).
4. Chirurgicamente isolare frammenti ovarici facendo un'incisione addominale attraverso la pelle e la parete del corpo con bisturi, isolando tessuto ovarico con una pinzae forbici. Mettere i frammenti ovarici in OR2-. Chiudere la parete del corpo con una sutura di seta 3-0 su un ago curvo 24 mm e chiudere la pelle separatamente con gli stessi punti di sutura. Permettere il recupero della femmina in 1 g / L salata serbatoio in acqua.
5. Utilizzando una pinza sottile, il tessuto ovarico lacrima in piccole (10 - 20 ovociti) pezzi e trasferimento OR2- fresco.
6. Frammenti ovarici Defolliculate a 2,0 mg / ml di collagenasi A OR2- agitando delicatamente su agitatore per 1 ora, il trasferimento di collagenasi fresco e agitazione per un'ora supplementare.
7. Lavare ovociti 10 volte in OR2 [contenenti ^Ca ++ / Mg ^++], scartando ovociti più piccoli.
8. Lavare gli ovociti in OCM due volte e trasferimento a fresco OCM. Isolare ovociti Fase VI per dimensione su ispezione visiva e scartare immaturi (più piccoli) ovociti: ovociti Fase VI sono più grandi di ovociti immaturi anche con pigmentazione nell'emisfero animale e sono circa 1,2-1,4 mm di diametro.
9. Mantenere ovociti a 18 - 20 ° C in OCM prima dell'iniezione. Nota: capsule di Petri Agarosio-rivestiti possono essere utilizzati per ridurre al minimo incollaggio di ovociti a servire.

2. Iniezione di Biblioteca Trascrizioni

1. Preparare una libreria di cDNA direzionale ¹⁵ utilizzando RNA estratto in una fase adeguato di sviluppo (per esempio, lo stadio piastra neurale ¹⁴ 10). Acquistare una libreria di cDNA o costruirne uno utilizzando un kit commerciale per la panoramica nelle quattro fasi che seguono.
   1. Isolare circa 5 mg di mRNA utilizzando un prodotto per arricchire di poli (A) + RNA (vedi Tabella dei Materiali) e seguendo le istruzioni del produttore. Nota: Le trascrizioni da utilizzare per produrre la libreria di cDNA può essere limitata ad un tessuto induzione (come la piastra neurale, dopo microdissezione del tessuto desiderato), o possono essere da embrioni interi in una fase particolare.
   2. Produrre cDNA con un kit commerciale, seguendo le indicazioni del produttore.
   3. Legare circa 20 ng cDNA in un vectoR incluso con il kit commerciale o di un altro vettore adatto. Un appropriato vettore plasmidico comprende sequenze di mRNA stabilità come 5 'β-globina e 3 poly (A) + sequenze (pCS2, pTnT, pCS105).
   4. Trasforma legatura in cellule batteriche competenti mediante protocollo raccomandato del fornitore per la trasformazione shock termico.
      Nota: In alternativa, una raccolta di cornice di lettura aperta (ORFeome) cloni è disponibile in commercio e può essere utilizzato per generare trascrizioni per iniezione.
2. Preparare 10 piscine di plasmidi di 10 ³ al 10 ⁴ complessità (10 ⁴ al 10 ⁵ complessità totale). Questo rappresenta 10 tavole con 1.000 - 10.000 colonie ciascuno.
   1. Biblioteca piastra di coltura su 10 piatti da 15 cm LB-ampicillina, crescere 12-18 ore a 37 ° C, e raccogliere le colonie da ogni da una leggera pressione con una spatola di vetro a 7 ml LB.
   2. Preparare un stock di glicerolo da 0,5 ml (aggiungere 0,2 ml glicerolo sterile e conservare a -20 &# 730; C), e utilizzare i restanti 6,5 ml per preparare il DNA con uno standard disponibile in commercio kit miniprep DNA seguendo le indicazioni del produttore.
3. Linearizzare pool DNA plasmide (1,0-2,0 mg) con adeguate enzima di restrizione digerire ¹⁶ a 37 ° C: 1 - 1,5 ore. Isolare il DNA linearizzato con estrazione con fenolo / cloroformio seguita dalla precipitazione con etanolo e risospensione in acqua secondo le specifiche del kit RNA polimerasi utilizzata. Sintetizzare RNA con un kit RNA polimerasi commerciale seguendo le indicazioni del produttore.
4. Preparare aghi per microiniezione (usando un estrattore ago con tubi capillari di vetro) di circa 20 micron di diametro; misurare punte degli aghi su un microscopio composto con un micrometro oculare calibrata. Nota: le impostazioni estrattore ago deve essere empiricamente determinato a produrre un ago con punta fine in modo tale che in caso di rottura con una pinza sottile produce il formato di punta desiderata.
5. Preparare (spingere argilla instrato uniforme sul fondo del piatto) argilla alberati 35 x 10 mm piatti di Petri con scanalature parallele di tenere ovociti in atto durante la microiniezione; produrre scanalature con una sonda centro commerciale o pipetta Pasteur fuso alla punta di fiamma. In alternativa argilla, preparare piatti agarosio rendendo rientranze con uno stampo elastomero ^17. Ovociti di trasferimento con una pipetta ampio tunnel al 3% Ficoll a 1X MBS (circa 2 ml) in file nei piatti di creta-allineati.
6. Utilizzando microinjector, riempire ago con 1 ng / RNA nl e regolare l'equilibrio di produrre una leggera pressione positiva (per evitare stesura di ovociti citoplasma).
7. Iniettare ovociti con circa 20 RNA nl nella regione equatoriale. Lasciare 1 ora per ovociti iniettati di rimanere in Ficoll-MBS, quindi trasferire delicatamente per 1x MBS. Incubare per 8-24 ore a 20 ° C prima dell'analisi protezione animale.

3. Animal Cap Assay

1. Preparare 3 / 4x NAM e ottenere una pinza sottile, ciclo dei capelli, frammenti coprioggetto curve, dis argilla alberatihes con rientranze a forma di coppa per tenere ovociti. Fai frammenti coprioggetto curve da sbriciolarsi vetrini in piccoli frammenti (circa 1-2 mm x 2-4 mm) e passando attraverso la fiamma fino a quando i bordi polacco e languore, la produzione di un pezzo curvo.
2. Fertilizzare X. laevis uova ¹⁸ attraverso in vitro o l'accoppiamento naturale e la cultura di gastrula fasi (10 - 11 ore dopo la fecondazione a RT) a 0.1x MBS prima l'ordinamento per fase; raccogliere metà gastrula (fase 11-11,5) ¹⁰ embrioni.
3. Trasferimento degli embrioni a una capsula di Petri circa mezzo pieno con 3 / 4x NAM. Utilizzando due coppie di una pinza sottile, rimuovere la fecondazione (vitellina) membrana dal gastrulae.
4. Trasferimento ovociti a 3 / 4x NAM (circa 2 ml) in piatti di terracotta alberati e immobilizzare in singole impressioni in argilla, producendo impressioni per accogliere singoli embrioni solchi sono stati descritti sopra.
5. Trasferimento degli embrioni ai piatti d'argilla alberati e tagliato le protezioni animali fuori gastrulae utilizzando due coppie di pinza sottile. Fare attenzione a isolare animale tappo ectoderma e non tessuti equatoriali ^18.
6. Inserire un tappo animale nell'emisfero animali di ciascun ovocita con la superficie interna del tappo animale contattando l'ovocita. Tenere ricombinanti insieme applicando frammento coprioggetto vetro curvo e applicando pressione verso il basso sul vetro, appiattimento ectoderma come i contatti coprioggetto l'argilla (tappi animale può rimanere aperto con lo strato interno esposta alla superficie del ovocita per 6 - 8 ore o più ).
   Nota: In alternativa, inserire la protezione animale in una rientranza di argilla con la sua superficie interna rivolta verso l'alto e inserire un ovocita sul tappo; fissare il ricombinante con piccole estensioni di argilla.
7. Cultura a 20 ° C fino a quando gli embrioni di controllo portata desiderata palco per il dosaggio.
8. Ricombinante separata rimuovendo vetrino / argilla ed isolando ectoderma con una pinza e un ciclo di capelli.
9. Fissare frammenti ectodermica per 1 ora a MEMFA (3,8%formaldeide in MEM [0,1 M pH 7,4 MOPS, 2 mM EGTA, e 1 mM MgSO _4]).
10. Frammenti di trasferimento (ed embrioni di controllo) da MEMFA in etanolo e conservare a -20 ° C.

4. Analisi di risposta in Ectoderma l'ibridazione in situ (ISH)

1. Preparare soluzioni per ISH.
   1. Preparare 1x PBS: 0,01 M tampone fosfato, NaCl 0,138 M, pH 7,4
   2. Preparare PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% di Tween-20
   3. Preparare la soluzione di 100x Denhart: 2% di BSA, 2% Polivinilpirrolidone, 2% Ficoll
   4. Preparare Hybridization Buffer: 50% formammide, 5x SSC, 1 mg / ml torula RNA, 1 mg / ml di eparina, soluzione 1x Denhart, 0.1% Tween-20, 0,1% CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC-H ₂ O
   5. Preparare maleico Acid Buffer (MAB): 100 mM acido maleico, NaCl 150 mM, pH 7,5
   6. Preparare MAB + blocco: MAB, 2% reagente bloccante (calore a 60 ° C per sciogliere)
   7. Preparare della fosfatasi alcalina (AP) Buffer: Tris mm 100pH 9.5, 50 mM MgCl _2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH ₂ O
2. Preparare la sonda RNA.
   1. Utilizzando un kit di RNA polimerasi commerciale e scavare-NTP mix, aggiungere in una provetta da 1,5 ml (50 reazione microlitri): 25,5 ml DEPC-H _{2 O,} 10 microlitri 5X Transcription Buffer, 2,5 microlitri 10x scavo-NTP mix, 5 ml 100 mM DTT, 2 microlitri RNasin, 2 ml DNA stampo linearizzato (~ 1 mg / mL), 3 ml di RNA polimerasi e incubare 37 ° C per 90 min.
   2. Aggiungere 2 ml di RNA polimerasi e incubare 37 ° C per 60 min.
   3. Controllare 2 ml di reazione su 1% gel.
   4. Aggiungere 1 ml RQ1 RNase-Free DNase e incubare 37 ° C per 20 minuti.
   5. Precipitare il probe aggiungendo 50 microlitri DEPC-H ₂ O, 25 microlitri 10 M ammonio acetato e 313 ml di etanolo. Conservare a -20 ° C durante la notte (O / N) poi recuperare RNA per centrifugazione a 13.800 xg per 20 min. Lavare con 500 ml 75% di etanolo, girare brevemente, rimuovereetanolo e lasciare asciugare all'aria pellet. Aggiungere 50 ml DEPC-H ₂ O.
   6. Aggiungi Tampone di ibridazione a una concentrazione finale di ~ 0.5 mg / mL.
3. Preparare dei tessuti per l'ibridazione. Se non diversamente specificato, riempire fiale in cima ad ogni cambio di soluzioni descritte (circa 4 ml).
   1. Rimuovere l'etanolo da fiale e trasferimento di embrioni in 75% di etanolo / PTW, quindi il 50% di etanolo / PTW per 10 minuti ciascuna, orizzontalmente sulla sedia a dondolo.
   2. Lavare tre volte in PTW per 5 minuti ciascuno su sedia a dondolo.
   3. Trasferimento a 10 mg / mL trattamento Proteinase K in PTW; Tubi di roccia verticale 15 min.
   4. Sciacquare due volte 10 minuti ciascuno a 0,1 M Triethanolamine pH 7,8 - tubi di roccia verticale.
   5. Aggiungere 12,5 ml di anidride acetica ai tubi e roccia verticale 5 min. Ripetere con l'aggiunta di 12,5 ml di anidride acetica per 5 min.
   6. Lavare in PTW 5 minuti verticalmente sulla sedia a dondolo.
   7. REFIX in 4% paraformaldeide 20 min a bilanciere. Calore Tampone di Ibridazionea 60 ° C.
   8. Lavare tre volte in PTW per 5 minuti ciascuno su sedia a dondolo.
   9. Rimuovere tutti ma ~ 1 ml di PTW da ciascuna provetta e aggiungere 250 microlitri Hyb Buffer; agitare delicatamente i tubi per mescolare. Tubi di roccia verticale 5 min.
   10. Sostituire con 60 ° C Hyb Buffer (0,5 ml) e agitare delicatamente a 60 ° C 10 min. Sostituire con fresco Hyb tampone e agitare a 60 ° C per 4 ore due.
   11. Sonda termica (1 ml a 0,5 mg / mL in Hyb tampone) a 60 ° C (3 min). Rimuovere Hyb Buffer e aggiungere la sonda ai tubi. Agitare delicatamente O / N a 60 ° C.
4. Preparare dei tessuti per l'anticorpo.
   1. Caldo Hyb Buffer e 2x SSC + 0,1% Tween-20 soluzioni a 60 ° C.
   2. Sostituire soluzione della sonda con Hyb Buffer (salvare le sonde a -20 C per 2 - 3x riutilizzo). Lavare a 60 ° C per 10 min.
   3. Lavare tre volte a 60 ° C in 2x SSC-Tween (20 minuti ciascuno con agitazione).
   4. Lavare tre volte a 60 ° C a 0.2x SSC-Tween (20 minuti ciascuno con agitazione).
   5. Lavare due volte in MAB (RT) per 15 min per riga sull'attuatore.
   6. Aggiungere 1 ml MAB + blocco. Lavare 2 ore in verticale sulla sedia a dondolo.
   7. Trasferimento a 1 ml MAB + blocco contenente un anti-digossigenina-AP 1 / 2.000. Roccia verticale a 4 Co / N.
5. Preparare dei tessuti per reagente colore.
   1. Sostituire soluzione di anticorpi con MAB; lavare tre volte in MAB 5 min per riga sull'attuatore.
   2. Lavare tre volte in MAB 1 ora ciascuno orizzontalmente sull'attuatore.
   3. Lavare due volte in AP Buffer 10 minuti ogni orizzontalmente sulla sedia a dondolo.
   4. Trasferimento tessuto multi-pozzo vassoio di plastica, rimuovere AP tampone e aggiungere BM viola reagente (~ 1 ml). Lasciare reazione di procedere nel buio 5 minuti a O / N.
   5. Al raggiungimento del caso colorazione, trasferire il tessuto di fiale di PTW. Lavare due volte 10 min ciascuno in PTW sulla sedia a dondolo.
   6. Fissare in soluzione di Bouin a 4 CO / N sulla sedia a dondolo.
   7. Lavare Bouin con tre il 70% di etanolo / 30% lavaggi PTW a temperatura ambiente. Procedere to l'acquisizione di immagini con epi-illuminazione e una videocamera a microscopio, candeggio, se necessario ^18.

5. Sib Selezione e clonazione

1. Selezionare piscina con la più alta attività (grande risposta nel tessuto ectodermica).
2. Titolare (diluire con LB alla densità del caso) la stock di glicerolo per la piscina con la più alta attività e piastra fuori dieci nuovi piatti con circa un decimo delle colonie dal passo precedente (utilizzando la sezione 2 del protocollo sopra).
3. Ridurre le dimensioni della piscina fino a quando l'attività viene fatta risalire ad un'unica colonia.
4. Ottenere sequenza di DNA con primer standard, nel vettore.

Risultati

In risposta alla espressione di mRNA iniettato in oociti, rispondendo tessuto protezione animale è stato analizzato per l'espressione di Otx2 mediante ibridazione in situ (Figura 2 e Tabella 1); Otx2 si esprime nella ectoderma lente presuntivo (PLE) da chiusura del tubo neurale attraverso la lente placode ispessimento ^19. Tuttavia, poiché Otx2 si esprime anche nella ectoderma neurale anteriore, così come non-neurale e...

Discussione

Il metodo descritto qui per il clonaggio funzionale di geni capaci di indurre una risposta in ectoderma competente può essere utilizzato per identificare una vasta gamma di prodotti genici. Questo metodo si espande sul lavoro passato, combinando analisi dei tessuti che inducono con tecniche di clonazione espressione. Utilizziamo le vie metaboliche della oocita Xenopus come fonte di produzione di indurre fattori, direttamente o indirettamente, dopo l'iniezione di RNA. Questo, in combinazione con l'uso d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library