Clonage fonctionnelle en utilisant un<em&gt; Xenopus</em&gt; Système d&#39;expression de l&#39;ovocyte

Résumé

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Résumé

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Introduction

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par l'Université de Virginie institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

Remarque: La figure 1 montre une vue d'ensemble schématique des modes opératoires expérimentaux.

1. Préparation d'ovocytes

1. X. Pré-prime laevis femelles avec 150 U de jument gravide gonadotrophine sérique (PMSG) environ une semaine à l'avance de l'isolement de l'ovocyte. Injecter 1 ml 150 U / ml PMSG dans dorsale lymphatique sac avec 1 cc seringue stérile avec aiguille 29 G.
2. Préparer des solutions pour l'injection d'ovocytes et le Cap-dosage ovocyte animal.
   1. Préparer Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ exempt OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, 2,5 mM de KCl, 1,5 mM Na _{2 HPO 4,} HEPES 50 mM pH 7,2.
   2. Préparer OR2: OR2- plus 1 _mM de CaCl2 et 1 _mM de _MgCl2.
   3. Préparer OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml de BSA, 100 ug / ml de gentamycine à pH 7,8.
   4. Pré1x pare MBS: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,7 _mM de CaCl2, 1 mM de MgSO _4, 5 mM de HEPES (pH 7,8), 2,5 mM de NaHCO _3.
   5. Préparer 3% de Ficoll en 1x MBS.
   6. Préparer NAM 1x: 110 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO _{3) 2,} 1 mM de MgSO _4, 0,1 mM d'EDTA, 1 mM de NaHCO _3, 2 mM de Na _{3 PO 4} à pH 7,4.
3. Anesthésier la femelle dans une solution à 0,03% de sel de méthanesulfonate d'éthyle 3-aminobenzoate (MS222) à 0,1x MBS (première dissoudre 0,3 g dans 10 ml MS222 95% d'éthanol, puis diluer à 1 L 0,1x MBS) en plaçant grenouille solution pour 10 - 15 min ou jusqu'à ce que ne répond pas.
   1. Vérifiez que l'anesthésie est complète en tournant grenouille anesthésié sur le dos pour vous assurer qu'il ne répond pas (incomplètement grenouilles anesthésiés déplacer membres ou du corps au verso).
4. Isoler des fragments de l'ovaire par voie chirurgicale en faisant une incision abdominale à travers la peau et la paroi du corps de lame de scalpel, l'isolement du tissu ovarien avec une pinceet ciseaux. Placez fragments ovariens dans OR2-. Fermez la paroi du corps avec une suture 3-0 en soie sur une aiguille courbe de 24 mm et fermer la peau séparément avec les mêmes points de suture. Permettre la récupération des femmes dans 1 g / L aquarium sel dans l'eau.
5. En utilisant des pinces fines, tissu ovarien lacrymogènes dans les petites (10 - 20) pièces ovocytes et transfert à OR2- frais.
6. Defolliculate fragments ovariens dans 2,0 mg / ml de collagénase A en agitant doucement par OR2- sur agitateur pendant 1 heure, le transfert de la collagénase fraîche et en agitant pendant une heure supplémentaire.
7. Laver ovocytes 10 fois dans OR2 [contenant Ca ⁺⁺ / Mg ^++] en rejetant les petits ovocytes.
8. Laver ovocytes dans OCM deux fois et transférer à nouveau OCM. Isoler ovocytes Etape VI selon la taille de l'inspection visuelle des ovocytes immatures et le jeter (plus petits): Etape VI ovocytes sont plus grandes que ovocytes immatures avec même pigmentation dans l'hémisphère des animaux et sont d'environ 1,2-1,4 mm de diamètre.
9. Maintenir ovocytes à 18 - 20 ° C in OCM avant l'injection. Remarque: Les boîtes de Petri enrobées d'agarose-peuvent être utilisés pour réduire le collage des ovocytes à plat.

2. Injection d'Bibliothèque Transcriptions

1. Préparer une banque d'ADNc directionnelle ¹⁵ en utilisant l'ARN extrait à un stade approprié de développement (par exemple, stade de la plaque neurale 14 ^10). Achetez une banque d'ADNc ou de construire un utilisant un kit commercial par la liste dans les quatre étapes ci-dessous.
   1. Isoler environ 5 pg de l'ARNm en utilisant un produit pour enrichir en poly (A) + ARN (voir le tableau des matériaux) et en suivant les instructions du fabricant. Remarque: Les relevés de notes à être utilisés pour produire la banque d'ADNc peut être limitée à un tissu induire (comme la plaque neurale, après microdissection des tissus désiré), ou peuvent être à partir d'embryons entiers à un stade particulier.
   2. Produire de l'ADNc avec un kit commercial, suivant les instructions du fabricant.
   3. Ligaturer environ 20 ng d'ADNc dans un vector inclus avec le kit commercial ou d'un autre vecteur approprié. Un vecteur plasmidique approprié comprend des séquences de stabilité de l'ARNm tel que 5 'et β-globine 3 poly (A) + pCS2 (séquences, pTnT, pCS105).
   4. Transformez ligature dans des cellules bactériennes compétentes en utilisant le protocole recommandé de fournisseur pour la transformation de choc thermique.
      Remarque: Alternativement, une collection de cadre de lecture ouvert (ORFéome) clones est disponible dans le commerce et peut être utilisé pour générer des transcriptions pour injection.
2. Préparer 10 pools de plasmides sur 10 ^trois à ^quatre complexité dix (10 ^quatre à dix complexité de ^cinq au total). Cela représente 10 plaques avec 1.000 - 10.000 colonies chacun.
   1. Bibliothèque de plaque de culture sur 10 plaques de 15 cm LB-ampicilline, grandir 12 - 18 h à 37 ° C, et de recueillir des colonies de chaque par une légère pression avec un épandeur de verre dans 7 ml LB.
   2. Préparer un stock de glycérol de 0,5 ml (ajouter à 0,2 ml de glycérol stérile et conserver à -20 &# 730; C), et d'utiliser les 6,5 ml restants pour préparer l'ADN avec un standard du commerce kit ADN miniprep en suivant les instructions du fabricant.
3. Linéariser l'ADN plasmidique groupé (1.0 - 2.0 ug) avec restriction appropriée enzyme digérer ¹⁶ à 37 ° C pour les 1 - 1,5 h. Isoler l'ADN linéarisé par extraction au phénol / chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol et remise en suspension dans de l'eau selon les spécifications de la trousse d'ARN polymérase utilisée. Synthétiser l'ARN sens avec un kit d'ARN polymérase commerciale suivant les instructions du fabricant.
4. Préparer aiguilles pour la micro-injection (à l'aide d'un extracteur d'aiguille avec un tube capillaire en verre) d'environ 20 um de diamètre; mesurer pointes d'aiguille sur un microscope composé avec un micromètre oculaire calibré. Remarque: Les paramètres de traction aiguille doit être déterminée empiriquement pour produire une aiguille avec une pointe fine telle que lorsque rompu avec une pince fine donne la taille de la pointe souhaitée.
5. Préparer (pousser argile danscouche uniforme sur le fond du plat) argile bordée 35 x 10 mm boîtes de Pétri avec des rainures parallèles pour tenir ovocytes en place lors de la micro-injection; produire des rainures avec une sonde de centre commercial ou pipette Pasteur fusionné à la pointe de la flamme. Comme alternative à l'argile, de préparer des plats agarose faisant indentations avec un moule en élastomère ^17. Ovocytes de transfert avec une pipette de gros calibre à 3% de Ficoll dans 1X MBS (environ 2 ml) en rangées dans les plats d'argile bordée.
6. Utilisation microinjecteur, remplissez aiguille avec 1 ng / nl ARN et de régler la balance pour produire une légère pression positive (pour empêcher l'élaboration de cytoplasme de l'ovocyte).
7. Injecter ovocytes avec environ 20 nl d'ARN dans la région équatoriale. Comptez 1 h pour les ovocytes injectés de rester dans Ficoll-MBS, puis transférer doucement pour 1x MBS. Incuber pendant 8-24 heures à 20 ° C avant l'essai de coiffe animale.

3. Animal Cap Assay

1. Préparer 3 / 4x NAM et obtenir des pinces fines, boucle de cheveux, des fragments de lamelle incurvée, dis d'argile bordéehes avec indentations en forme de coupe de tenir ovocytes. Assurez fragments lamelle courbes par briser des lamelles de verre en petits fragments (environ 1 - 2 mm x 2 - 4 mm) et passant par flamme jusqu'à ce que les bords polonais et statisme, la production d'une pièce courbe.
2. Fertiliser X. laevis oeufs ¹⁸ in vitro ou par accouplement naturel et de la culture à Gastrula stades (10 - 11 h après la fécondation à la température ambiante) à 0,1x MBS avant le tri par étape; recueillir mi-gastrula (stade de 11 à 11,5) ¹⁰ embryons.
3. Embryons de transfert à une boîte de Pétri environ à moitié plein avec 3 / 4x Nam. L'utilisation de deux paires de pinces fines, retirez la fécondation (vitelline) membrane de gastrulas.
4. Transfert ovocytes à 3 / 4x NAM (environ 2 ml) dans les plats d'argile bordée et d'immobiliser des impressions individuelles dans l'argile, la production d'impressions pour accueillir embryons individuels que des rainures ont été décrits ci-dessus.
5. Embryons de transfert aux plats d'argile bordée et coupés calottes animales hors gastrulae utilisant deux paires de pinces fines. Prenez soin d'isoler l'animal bouchon ectoderme seulement et pas les tissus équatoriale ^18.
6. Placez un bouchon d'animaux sur l'hémisphère animal de chaque ovocyte avec la surface intérieure de la coiffe des animaux en contact avec l'ovocyte. Maintenir recombinants ensemble en appliquant fragment de lamelle de verre incurvée et en appliquant une pression vers le bas sur le verre, aplatissant l'ectoderme que les contacts de la lamelle de l'argile (calottes animales peut rester ouvert avec la couche intérieure exposée à la surface de l'ovocyte pour 6-8 heures ou plus ).
   Remarque: vous pouvez placer le capuchon de l'animal dans une indentation d'argile avec sa surface intérieure orientée vers le haut et placez un ovocyte sur le bouchon; sécuriser le recombinant avec de petites extensions d'argile.
7. Culture à 20 ° C jusqu'à ce que les embryons de contrôle atteignent les désire étape pour le dosage.
8. Recombinant séparée en enlevant lamelle / argile et l'isolement de l'ectoderme avec une pince et une boucle de cheveux.
9. Fixer fragments ectodermiques pendant 1 h dans MEMFA (3,8%formaldehyde dans du MEM [0,1 M de MOPS, pH 7,4, 2 mM d'EGTA, 1 mM de MgSO et _4]).
10. Fragments de transfert (et d'embryons de contrôle) de MEMFA en éthanol et conserver à -20 ° C.

4. Analyse de la réponse dans Ectoderme par hybridation in situ (ISH)

1. Préparer des solutions pour ISH.
   1. Préparer 1x PBS: 0,01 M tampon phosphate salin, NaCl 0,138 M, pH 7,4
   2. Préparer PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20
   3. Préparer la solution de 100x Denhart: BSA 2%, 2% Polyvinylpyrrolidone, 2% de Ficoll
   4. Préparer tampon d'hybridation: 50% de formamide, 5x SSC, 1 mg / ml torula ARN de levure, 1 ug / ml d'héparine, la solution de 1 x Denhart, 0,1% de Tween-20, 0,1% de CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC H ₂ O
   5. Préparer le tampon acide maléique (MAB): acide maléique 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5
   6. Préparer MAB + bloc: MAB, 2% de réactif de blocage (la chaleur à 60 ° C pour dissoudre)
   7. Préparer la phosphatase alcaline (AP) tampon: Tris 100 mMpH 9,5, 50 _mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween, dH ₂ O
2. Préparer l'ARN Probe.
   1. L'utilisation d'un kit d'ARN polymérase commerciale et de creuser-NTP mélange, ajouter à un tube de 1,5 ml (50 de réaction pi): 25,5 pi DEPC H _{2 O,} 10 pl Transcription Buffer 5X, 2,5 ul 10x dig-NTP Mix, 5 pl 100 mM TNT, 2 pl RNAsin, 2 pl linéarisé matrice d'ADN (~ 1 ug / ul), 3 pi ARN polymérase et incuber 37 ° C pendant 90 min.
   2. Ajouter 2 ul ARN polymérase et incuber 37 ° C pendant 60 min.
   3. Vérifiez 2 pi de réaction sur gel d'agarose 1%.
   4. Ajouter 1 ul de DNase RQ1 RNase-Free et incuber 37 ° C pendant 20 min.
   5. Précipiter la sonde en ajoutant 50 ul DEPC-H ₂ O, 25 ul d'acétate d'ammonium 10 M et 313 ul d'éthanol. Conserver à -20 ° C pendant la nuit (O / N), puis récupérer l'ARN par centrifugation à 13 800 g pendant 20 min. Laver avec 500 ul 75% d'éthanol, centrifuger brièvement, retirezéthanol et permettre culot sécher à l'air. Ajouter 50 ul DEPC H ₂ O.
   6. Ajouter tampon d'hybridation à une concentration finale de ~ 0,5 pg / pl.
3. Préparer tissus pour l'hybridation. Sauf indication contraire, remplir les flacons vers le haut à chaque changement de solution décrites (environ 4 ml).
   1. Retirer éthanol à partir de flacons et de transfert d'embryons dans 75% d'éthanol / PTW, puis 50% d'éthanol / PTW chacune pendant 10 minutes, à l'horizontale sur rocker.
   2. Laver trois fois dans PTW pendant 5 min sur chaque bascule.
   3. Transfert à 10 ug / ul de traitement à la protéinase K dans PTW; tubes de roche à la verticale de 15 min.
   4. Rincer deux fois 10 minutes dans chacune des 0,1 M pH 7,8 Triéthanolamine - Rock tubes verticalement.
   5. Ajouter 12,5 pi d'anhydride acétique à des tubes et de la roche verticale 5 min. Répéter l'opération avec 12,5 pi anhydride acétique supplémentaire pour 5 min.
   6. Laver à PTW 5 min verticalement sur rocker.
   7. Refixer dans 4% de paraformaldehyde 20 min à bascule. Chaleur tampon d'hybridationà 60 ° C.
   8. Laver trois fois dans PTW pendant 5 min sur chaque bascule.
   9. Retirez tous mais ~ 1 ml de PTW de chaque tube et ajouter 250 Buffer Hyb ul; agiter doucement tubes pour mélanger. Tubes Rock verticalement 5 min.
   10. Remplacez-le par 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) et agiter doucement à 60 ° C 10 min. Remplacer avec le tampon Hyb frais et agiter à 60 ° C de deux à 4 h.
   11. Sonde thermique (1 ml à 0,5 ug / ul dans du tampon Hyb) à 60 ° C (3 min). Retirer Hyb Buffer et ajoutez sonde pour tubes. Agiter doucement O / N à 60 ° C.
4. Préparer tissus pour anticorps.
   1. Tampons Hyb chaleureux et 2x SSC + 0,1% de Tween-20 solutions à 60 ° C.
   2. Remplacer solution de sonde avec Hyb Buffer (sauf sondes à -20 ° C pendant 2 - 3x réutilisation). Lavage à 60 ° C pendant 10 min.
   3. Laver trois fois à 60 ° C dans 2x SSC-Tween (20 min chacun avec agitation).
   4. Laver trois fois à 60 ° C dans 0,2x SSC-Tween (20 min chacun avec agitation).
   5. Laver deux fois dans MAB (RT) pendant 15 min sur chaque bascule à l'horizontale.
   6. Ajouter 1 ml MAB + bloc. Lavez 2 h verticalement sur rocker.
   7. Transfert à 1 ml MAB + bloc contenant un anti-digoxygénine-AP 1 / 2.000. Roche verticalement à 4 CO / N.
5. Préparer tissus pour Réactif couleur.
   1. Remplacer solution d'anticorps avec le MAB; laver trois fois en 5 min MAB horizontalement sur chaque bascule.
   2. Laver trois fois dans MAB 1 h chaque horizontalement sur rocker.
   3. Laver deux fois dans du tampon AP 10 min chaque bascule à l'horizontale sur.
   4. Transfert tissu à multiples puits plateau en plastique, retirez AP tampon et ajoutez BM réactif Violet (~ 1 ml). Laisser réaction de se dérouler dans l'obscurité 5 min à O / N.
   5. Lorsque coloration appropriée est atteint, transférer le tissu dans des flacons de PTW. Laver deux fois 10 minutes dans chacune des deux-roues motorisés sur rocker.
   6. Fixer dans la solution de Bouin à 4 CO / N sur rocker.
   7. Laver Bouin avec trois éthanol à 70% / 30% lavages PTW à TA. Procéder to capture d'image en utilisant épi-illumination et une caméra de microscope monté, le blanchiment si nécessaire ^18.

5. Sib sélection et clonage

1. Sélectionnez piscine avec l'activité la plus élevée (plus de réponse dans le tissu ectodermique).
2. Titrer (diluer avec LB à une densité adéquate) le stock de glycérol pour la piscine avec l'activité la plus élevée et de la plaque sur dix nouvelles plaques avec environ un dixième des colonies de l'étape précédente (en utilisant l'article 2 dans le protocole ci-dessus).
3. Réduire la taille de la piscine jusqu'à ce que l'activité est imputable à une seule colonie.
4. Obtenir la séquence d'ADN en utilisant des amorces classiques dans le vecteur.

Résultats

En réponse à l'expression de l'ARNm injecté dans des ovocytes, tissu de coiffe animale répondant a été analysé pour déterminer l'expression de otx2 par hybridation in situ (Figure 2 et tableau 1); otx2 est exprimé dans la lentille présomptif ectoderme (PLE) de fermeture du tube neural grâce à lentille placode épaississement ^19. Cependant, depuis otx2 est également exprimé dans l'ectode...

Discussion

Le procédé décrit ici pour le clonage fonctionnel de gènes capables d'induire une réponse dans l'ectoderme compétent peut être utilisée pour identifier une vaste gamme de produits de gènes. Cette méthode se développe sur le travail passé en combinant des analyses de tissus induisant avec des techniques d'expression de clonage. Nous utilisons les voies métaboliques de l'ovocyte de Xenopus en tant que source de production de facteurs induisant, directement ou indirectement, suite à l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library