Магнитный Microbead окклюзия Модель для индуцируют офтальмогипертензией-зависимых Глаукома у мышей

Резюме

Здесь мы приводим протокол для индукции глазной гипертензии, в мышиных глаз, что приводит к потере ганглиозных клеток сетчатки, как наблюдалось при глаукоме. Магнитные микросферы инъецируют в переднюю камеру и притягиваются к угол передней камеры глазного яблока с помощью магнита, чтобы блокировать отток внутриглазной жидкости.

Аннотация

Применение грызунах моделей глаукомы было важно понять молекулярные механизмы, лежащие в основе патофизиологии этого многофакторного нейродегенеративных заболеваний. С появлением многочисленных трансгенных линий мышей, растет интерес к индуцируемых мышиных моделях глазной гипертензии. Здесь мы представляем окклюзия модель глаукомы основана на введении магнитных микросфер в переднюю камеру глаза с использованием модифицированного микроиглы с фацетной скоса. Магнитные микросферы привлекают к радужно-роговичный угол, используя переносной магнит, чтобы заблокировать дренаж водянистой влаги из передней камеры. Это разрушение в водной динамики приводит к устойчивой высоте внутриглазного давления, что впоследствии приводит к потере ганглиозных клеток сетчатки, как это наблюдалось у пациентов с глаукомой человека. Модель Microbead окклюзия представлена ​​в этой рукописи проста по сравнению с другими моделями индуцируемых глаукомы и также высокоэффективным и воспроизводимым. Важно отметить, что изменения, представленные здесь минимизировать общие вопросы, которые часто возникают в моделях прикуса. Во-первых, использование скошенной стеклянной микроиглы предотвращает обратный поток микрогранул и гарантирует, что минимальное повреждение происходит в роговице во время инъекции, тем самым уменьшая эффекты связаны с травмами. Во- вторых, использование магнитных микрогранул обеспечивает способность привлекать большинство бусинки к радужно - роговичный угол, эффективно уменьшая количество шариков , плавающих в передней камере , избегая контакта с другими структурами (например., Радужной оболочки, хрусталика). И, наконец, использование портативного магнита обеспечивает гибкость при работе с маленьким ушком мыши, чтобы эффективно направлять магнитные микрогранулы и убедиться, что существует мало рефлюкс микрошариков из глаза, когда микроиглы снимается. Таким образом, Microbead окклюзия мышиная модель, представленная здесь является мощным исследовательским инструментом для изучения изменений нейродегенеративные, которые происходят во время возникновения и прогрессирования Глаукома.

Введение

Глаукома является прогрессивным и необратимым ослепление состояние , которое будет влиять на примерно 80 миллионов человек во всем мире к 2020 году ^1. У пациентов с глаукомой, потеря зрения вызвана селективным смерти ганглиозных клеток сетчатки (РГК), выходные нейроны , которые передают визуальную информацию от сетчатка в мозг. Глаукома является возрастная нейродегенеративным заболеванием со многими факторами риска, из которых наиболее распространенным является повышенное внутриглазное давление (ВГД). Действительно, ВГД является единственным изменяемым фактором риска при глаукоме и современные методы лечения сосредоточиться исключительно на управлении глазное давление. Тем не менее, многочисленные генетические, клеточные и экологические факторы влияют на возникновение и прогрессирование этого заболевания. Таким образом, понимание различных механизмов, которые в конечном счете способствуют гибели нейронов имеет важное значение для разработки эффективных методов лечения глаукомы.

Животные модели глаукомы имеют важное значение для изучения патофизиологии заболевания и выявления и проверкиперспективные терапевтические средства. Повышение доступности трансгенных линий мышей, включая штаммы условных нокаутных и мышей, несущих генетически кодируемые флуоресцентные трассирующие продвинул необходимость индуцируемых мышиных моделей с глаукомой. Несколько моделей на грызунах глаукомы были разработаны в течение многих лет (обзор в ^2,3). Во многих из этих моделей, глаукома индуцируется путем разрушения водной динамики юмор, в результате возвышения ВГД. Окклюзия модели, в которых микросферы или другие вещества , которые вводят в переднюю камеру глаза , чтобы блокировать водный дренаж, приобрели популярность в последние годы отчасти из - за их относительной легкости повышения ВГД ^4-14.

Microbead окклюзия модель глаукомы, впервые осуществленный в приматах ^12, кролики ⁸ и крыс ^4,9,11, недавно был адаптирован для использования в мышах ^5,6,10. В этих исследованиях внутрикамерное инъекция полистирола микрошарики, отдельно или вкомбинация с вязкоупругого материала, привело к повышение ВГД приводит к последующему RGC смерти ^6,10. Тем не менее, рефлюкс, когда игла выводится из глаза и выбивании микрогранул от угла передней камеры глаза являются общими проблемами, которые возникают в ходе процедуры. Чтобы свести к минимуму эти недостатки, магниты были использованы для привлечения магнитных микрогранул к передней камеры глаза угла глаза ^4,9.

Протокол , описанный здесь , представляет собой модифицированную процедура , основанная на предыдущих исследованиях ^9,10 , что использует магнитные микрогранулы и ручной магнит , приспособленный к глазу мыши (рисунок 1). Несколько важных модификаций были введены в нашем протоколе для обеспечения эффективного и воспроизводимое увеличение ВГД у мышей. Во-первых, введение микрошариков осуществляется с помощью тщательно подготовленного стекла микроиглы с фацетной скоса. Полученные гладкие поверхности микроиглы, а также его заостренный кончик обеспечивает минимальное повреждениенанесен как он прокалывает роговую оболочку. Использование этой стеклянной микроиглы также приводит к повышению контроля, когда наконечник микроиглы поступает в переднюю камеру, тем самым снижая риск повреждения близлежащих структур, таких, как радужки и хрусталика. Кроме того, крошечные поражение инъекции облегчает роговицы самовосстановления и уменьшает нежелательные эффекты связаны с травмами.

Во-вторых, введение магнитных микрогранул и использование портативного магнита позволяет точно контролировать, чтобы привлечь бусинки к угол передней камеры глазного яблока в маленьком глазу мыши. Магнитные микросферы, которые были использованы 4,5 мкм в диаметре, поскольку этот размер Microbead не забивают подготовленное отверстие микроиглы и важно, когда вводили эти микросферы эффективно блокировали дренаж водянистой влаги. Такой подход не только уменьшает рефлюкс инжектированных микрогранул, но также гарантирует, что максимальное количество микрогранул накапливается в целевой области, чтобы эффективно блокировать внутриглазной жидкости дренаж. Furthermore, эта стратегия также уменьшает количество шариков, плавающих в передней камере, избегая контакта с другими структурами, такими как радужки и хрусталика, а также предотвращение прохода в заднюю камеру. В совокупности эти изменения убедитесь, что операция инъекции Microbead выполняется с относительной легкостью и своевременно, что приводит к высокой воспроизводимостью, эффективной и устойчивой индукции глазной гипертензии у мышей.

протокол

Следующая процедура была выполнена в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными для использования экспериментальных животных и Заявление по использованию животных в офтальмологических и визуального исследований из Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO).

1. Получение микроиглы для Передней внутрикамерное инъекций

1. С помощью съемника, генерировать микроиглы из боросиликатного стеклянного капилляра
2. Под микроскопом, используют острое лезвие, чтобы тщательно создать отверстие в кончике микроиглы. Полученное отверстие должно иметь эллиптическую форму с большой и малой оси диаметром приблизительно 190 мкм и 70 мкм, соответственно. Измерьте площадь подготовленное отверстие микроиглы путем первых получения изображений с помощью линейки помещенной под микроскопом с последующей количественной оценке с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
3. В системе микропипетка снятия фаски, поместите микроиглы на 20 degreе угол относительно фаски пластины таким образом, чтобы отверстие микроиглы прикасается пластины. Скос в течение примерно 10 мин, пока края плоские и гладкие. Добавьте несколько капель дистиллированной воды, чтобы помочь в этом процессе.
4. Поверните микроиглы, чтобы скосить два ребра, окружающие отверстие, пока кончик не станет четким.
5. Очистите весь мусор и вода из микроиглы отверстия наконечника, используя аэрозольный метелкой.
6. Тщательно осмотрите готовую микроиглы под микроскопом. Отбросить микроиглы с переломами, чтобы свести к минимуму риск нарушения микроиглы во время операции.
7. Стерилизацию микроиглы путем промывки сначала с этанолом, а затем стерильным сбалансированным солевым раствором (BSS).

2. Получение магнитного Microbead раствора

Примечание: Магнитные микросферы, используемые в данном исследовании, покрыты эпоксидными группами. Во избежание каких-либо неблагоприятных эффектов, таких как слипание гранул и нежелательных молекулярных взаимодействий, эти эпоксидные группы должнысначала удалить из микрогранул перед тем как приступить к операции инъекции.

1. Удаление эпоксидных групп из магнитных шариков
   1. Готовят раствор 0,02 М гидроксида натрия (NaOH, МВт 39,997 г / моль) в 10-кратном трис-буфера (MW 121,14 г / моль).
   2. Аккуратно вихревой запас магнитного раствора микрогранулами (диаметр 4,5 мкм, 4 × 10 ⁸ бусин / мл) до тех пор , пока шарики равномерно суспендируют в растворе.
   3. Быстро пипеткой 1 мл раствора магнитного бусинка в 50 мл 0,02 М раствора NaOH в 10х буфера Трис.
   4. Поворот в течение 24 ч при комнатной температуре, чтобы удалить Эпоксидные группы из шариков.
   5. Собирают бусинки, закрепив магнит к нижней части трубы. Сориентируйте трубу горизонтально, чтобы гарантировать, что все гранулы притягиваются к магниту. Поворот в течение 4 ч при комнатной температуре.
   6. С помощью микропипетки, осторожно удалите супернатант, не нарушая гранул из бисера.
   7. Аккуратно вихревой осадок в 50 мл 10х ТRIS буфер до тех пор, пока шарики будут хорошо подвешен.
   8. Повторите шаги 2.1.4 2.1.6.
2. Концентрация и Ресуспендирование магнитных микрогранул в стерильном сбалансированный солевой раствор

Примечание: Необходимо концентрировать запас магнитного раствора шарик в стерильном сбалансированный солевой раствор (BSS) , чтобы достичь конечной концентрации 1,6 × 10 ⁶ бусин / мкл , так что 2,4 х 10 ⁶ бусин может быть введен в переднюю камеру в конечный объем 1,5 мкл, который подходит для маленького глаза мыши.

1. Вымойте бисером в 5 мл сверхчистой воды лабораторного класса, осторожно встряхивая в течение 2 мин.
2. Собирают бусинки, привлекая их к нижней части трубки с помощью магнита.
3. С помощью микропипетки, осторожно удалите воду, не нарушая гранул из бисера.
4. Повторите шаги больше 2.2.1 2.2.3 три раза.
5. В ламинарном потоке, мыть шарики с 500 мкл ПБС по pipettinг вверх и вниз. Выполните оставшиеся шаги в этом разделе в стерильных условиях в ламинарном потоке.
6. Собирают бусинки, привлекая их к нижней части трубки с помощью магнита.
7. С помощью микропипетки, осторожно удалите ПБС, не нарушая гранул из бисера.
8. Повторите шаги еще 2.2.5 2.2.7 три раза.
9. Ресуспендируют пипеткой бусинки вверх и вниз по 250 мкл ПБС.
10. Убедитесь в том, что решение шарик хорошо гомогенизируют. Затем быстро аликвоту 25 мкл суспензии в стерильные 0,5 мл пробирки. Конечная концентрация раствора сток бусинка 1,6 х 10 ⁶ бусин / мкл.
11. Хранить при температуре 4 ° С.

3. Индукция офтальмогипертензией

Примечание: Раздел 3 работа двух человек. В том случае, если какое-либо действие, чтобы выполняться конкретным лицом, соответствующее лицо установлено. В общем, человек 1 обрабатывает мышь под микроскопом в то время как Человек 2 гesponsible для манипулирования микрошприцом насосом. Общая продолжительность хирургической процедуры должна быть не менее 10 мин (шаги 3,9 до 3,17).

1. Выполните процедуры, описанные в 6 мышей взрослых C57BL /. Домовых мышей в стандартной среде с доступом к пище и воде без ограничений. В данной работе, использовать женский мышей C57BL / 6 от 3 до 4,5-месячного возраста. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для мужчин, так и у мышей разного возраста, а также других линий мышей, в том числе трансгенных и нокаутных мышей.
2. Измерьте базовое ВГД у бодрствующих мышей до анестезии и микрогранулами инъекции с использованием калиброванного отскока тонометр. Нанесите одну каплю пропаракаина гидрохлорида на роговице.
   1. Аккуратно сдерживаться мышь, удерживая кожу между ушами. Поместите мышь на настольном, так что животное комфортно и глаза доступны. Держите тонометр перпендикулярно к поверхности роговицы и принять по меньшей мере, три набора из десяти последовательных измерений для каждого глаза, чтобы получитьВГД в среднем. Измерение ВГД у бодрствующих мышей является предпочтительным, чтобы обойти связанных с анестезией эффекты на ВГД. В качестве альтернативы, ВГД может быть измерено в обезболивание у мышей после стадии 3.4.
3. Подготовить запас мыши коктейль анестезии смесь, состоящую из 20 мг / мл кетамина, 2 мг / мл ксилазина и 0,4 мг / мл ацепромазина.
4. Индукции анестезии у мышей при внутрибрюшинном введении коктейль смеси (1 мкл / г массы тела). Применение инъекционного анестетика коктейль предпочтительнее газовых анестетиков (например, изофлуран) , поскольку он обеспечивает гибкость при обращении с головой мыши , как животное не подключен к маске для ингаляции. Кроме того, чем дольше период восстановления требуется с инъекционной анестетика гарантирует, что микрогранулы оседают на угол передней камеры глазного яблока без вытеснять обратно в переднюю камеру.
5. Администрируйте 0,05 мг на кг массы тела бупренорфина подкожно.
6. Рассматривать глаз с Tropicamide еуе падение, чтобы вызвать расширение зрачков. Из-за небольшого размера мышиного передней камеры, ученик должен быть расширен, чтобы легко визуализировать позиционирование и продвижение микроиглы во время инъекции.
7. Применение мази на контралатеральной глаза (неоперированного), чтобы избежать высыхания роговицы во время процедуры.
8. Прикрепите чистую микроиглы к инъекционной сборки микрошприц насоса. Заменить микроиглы после каждой операции, чтобы избежать загрязнения перекрестного животного.
9. Человек 1: Передача обезболивание мыши на операционной платформе. Под микроскопом, убедитесь, что ученик полностью раскрыта и что глазные мышцы расслаблены, так что нет никакого движения глаз. Отсутствие движений глаз обеспечивает стабильность в процессе инъекции. Аккуратно протрите капли тропикамид глаз от глаз с помощью впитывающих тампонов.
10. Человек 2: Смешать магнитное решение Microbead пипетированием вверх и вниз.
11. Используя микрошприцом насос, сразу же загрузить MICRoneedle (полученного в разделе 1) с 1,5 мкл усредненного магнитного раствора микрогранулами (2,4 × 10 ⁶ гранул). Убедитесь, что воздушные пузырьки отсутствуют на кончике микроиглы. После загрузки микроиглы, выполните шаги 3.12 до 3.13 как можно быстрее, так что магнитное решение Microbead остается в однородной суспензии.
12. Поместите загруженный микроиглы под углом 45 °, помещенный кпереди по отношению к лимбу. Человек 1: поддержка глаз с помощью пластиковых щипцов. Убедитесь, что угол между микроиглы и пластиковых щипцов составляет приблизительно 90 °.
13. Человек 2: с загруженным микроиглы, аккуратно проколоть роговицу, так что наконечник микроиглы поступает в переднюю камеру. Убедитесь, что загруженный микроиглы остается на 45 ° углом по отношению к лимбу во время пункции. Избегать контакта с линзой или радужной оболочки глаза. Убедитесь в том, что микроиглы не входит в заднюю камеру. Человек 1: продолжать поддерживать глазс использованием пластиковых щипцов.
14. Человек 1: Без перемещения головки мыши, поместите магнит рядом с глазом, напротив наконечника микроиглы, чтобы привлечь магнитных шариков в переднюю камеру и свести к минимуму контакт шариков с внутренней поверхностью роговицы. Человек 2: С помощью микрошприцом насоса, вводят 1,5 мкл раствора магнитного бусинка в переднюю камеру. Раствор Microbead вводят в течение периода от 15 до 30 сек. Человек 1: Продолжайте удерживать магнит, противоположный кончик микроиглы в течение всего времени инъекции.
15. Человек 2: После того, как полный объем шариков был введен, медленно вывести микроиглы из глаза. Человек 1: Для того, чтобы избежать образования флегмы микрогранул, продолжают привлекать магнитных шариков в направлении передней камеры, удерживая магнит рядом с глазом в течение еще 30 до 60 сек.
16. Человек 1: Используя магнит, притягивают к бусинки радужно-роговичный угол. Убедитесь в том, что гранулы образуют равномерно распределенную кольцопо окружности передней камеры. Во время этого этапа, не привлекать к себе бусинки к роговице, поскольку они имеют тенденцию прилипать к внутренней поверхности роговицы при контакте.
17. Рассматривать оперированного глаза с антибиотиком в виде глазных капель, чтобы свести к минимуму риск инфекции.
18. Разрешить мыши, чтобы оправиться от тепла площадку до полного бодрствования (~ 3 до 4 ч). Поместите мышь, чтобы управлять глаз был обращен вверх. Такое позиционирование позволит предотвратить накопление инжектированных бусинок к внутренней поверхности роговицы гравитацией. Кроме того, это положение будет уменьшать потенциал для инфекции, как оперированного глаза, не будет контактировать с любым постельных принадлежностей и / или других материалов, которые могут присутствовать в клетке. В том случае, если животное показывает никаких признаков бедствия, введение дополнительных доз бупренорфина по мере необходимости.
19. Разрешить мышей, чтобы оправиться от процедуры в течение по крайней мере 2-х дней до проведения измерений ВГД. Мера ВГД, как это описано в разделе 3.2. Монитор ВГД по крайней мере один раз в неделю или чаще, по мере необходимости, и в то же время дня, чтобы свести к минимуму циркадные связанных с колебаниями.
20. Для измерения ВГД, используйте контралатеральной глаз от оперируемого мыши в качестве внутреннего контроля. В качестве альтернативы, использовать измерения из неповрежденных, неоперированной или имитацией работает мышей, как наивных управления.

4. Оценка ретинальных ганглиозных клеток Сома и Axon выживания

1. Заливать мышей, подвергнутых внутриглазной гипертензии путем внутрисердечной инъекции 0,1 М фосфатного буферного раствора (PBS) с последующим сразу ледяным 4% параформальдегида (PFA).
2. Заливать нетронутым, неоперированной мышей, как описано в 4.1 и использовать их в качестве неповрежденных элементов управления. Использование контрлатеральных глаз от управляемых мышей не рекомендуется для оценки выживаемости ГКС , так как изменения в контралатеральной глаз после травмы было зарегистрировано ^15,16 и могут посрамить интерпретации данных. В качестве альтернативы, используйте имитацией в действие глаза вводят 1.5 Мкл ПБС в качестве контроля.
3. Используя microscissors, тщательно вырезать соединительной ткани вокруг глаза, чтобы изолировать его от глазницы. Отделить зрительного нерва из глаза путем разрезания его на уровне головки зрительного нерва.
4. С помощью 30 G иглы, сделать отверстие в роговице, чтобы обеспечить проникновение закрепляющего раствора в глаза. Поместите глаз в 4% PFA и инкубировать в течение 1 часа при 4 ° С для дополнительной фиксации.
5. Поместите зрительный нерв в растворе, содержащем 2% PFA и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М какодилатный натрия (MW: 214 г / моль) и инкубировать O / N при 4 ° С для дополнительной фиксации.

5. Количественное RGC Сома Плотность на плоских смонтированные Сетчатка

Примечание: Следующая процедура адаптирован из протокола по Надаля-Николя и др ¹⁷ и определяет количественную оценку ГКС с использованием антитела против мозгоспецифических гомеобоксный / POU домен белка 3A (Brn3a) на сетчатке плоских креплениях.. Альтернативные метODS для нанесения этикеток ГКС также могут быть использованы в том числе и иммуногистохимии с антителом против РНК-связывающего белка с множественной сплайсинга (RBPMS) или ретроградным мечением Fluorogold или DiI.

1. Под микроскопом рассекает, снимите переднюю часть глаза, сделав надрез вдоль всего лимба, пока роговица не отрывается легко. Удалить роговица и хрусталик. Осторожно снимите сетчатку от глаз, делая разрезы вдоль зубчатый край и зрительного нерва.
2. Подготовка к сетчатке глаза плоским крепление, сделав четыре маленьких равноотстоящих надрезов от периферии сетчатки к зрительному нерву, чтобы четко определить четыре квадранта сетчатки глаза. Используя маленькую кисть, аккуратно удалите все оставшиеся стекловидного тела от сетчатки. Удаление столько стекловидного тела, насколько это возможно имеет решающее значение для получения чистой и сильной иммуногистохимического сигнал.
3. Аккуратно перенести сетчатку в 48-луночных плоскодонных планшет для культивирования, содержащей 0,5% Тритон Х-100 в PBS, так что сетчаткасвободно плавающие. Убедитесь, что слой ганглиозных клеток обращен вверх.
4. Место культуры пластины при температуре -70 ° С в течение 15 мин. После оттаивания сетчатку, дальнейшее проницаемыми промывкой два раза в свежем 2% Тритон Х-100 в PBS.
5. Развести антитела Brn3a до 0,3 - 0,5 мкг / мл ФБР, содержащим 2% Тритон Х-100 и 2% нормальной сыворотки осла. Выдержите в сетчатку в растворе первичного антитела Brn3a путем осторожного встряхивания O / N при 4 ° С. Сетчатки должна быть полностью погружена в 150 до 200 мкл раствора в любое время.
6. Развести осла против IgG козьего вторичные антитела к 2 мкг / мл ФБР, содержащим 2% Тритон Х-100 и инкубировать сетчатку в этом растворе в течение 2 ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Сетчатка должен быть полностью погружен в раствор антител в любое время. Накройте культуры пластины с алюминиевой фольгой для оставшихся шагов для предотвращения фотообесцвечивания.
7. Используя щетку, тщательно передать сетчатку к слайду, так что ткань лежит плоская, как позскорее. Воздух сухой в течение 10 мин. Установите с помощью анти-выцветанию монтажную среду.
8. Изучите сетчатку с плоским монтирует под флуоресцентным микроскопом. Количественно число положительных Brn3a РГК в трех непересекающихся областей в квадранте сетчатки глаза , как описано. ¹⁸

6. Количественное RGC Аксоны на зрительном нерве сечений

1. Собирают зрительного нерва , начиная с шага 4.5 и инкубировать в 2% осмия (OSO _4, МВт 254,23 г / моль) в течение 2 часов.
   Внимание: Из-за своей высокой токсичности, четырехокись осмия должны быть обработаны в вытяжном шкафу с соответствующей лабораторной одежде.
2. Обезвоживают зрительного нерва, погрузив его в возрастающих концентрациях этанола (50%, 70%, 90%, 95% и 100%) в течение 15 минут каждый.
3. Подготовьте эпоксидную смолу, используя следующий рецепт: 15,72 мл Код-812, 6,45 мл додеценил янтарного ангидрида, 7,83 мл надиковый метилового ангидрида, 0,45 мл DMP-30.
4. Последовательная инкубировать зрительный нерв в растворах в составеиз следующих соотношений эпоксидной смолы к окиси пропилена (MW 58,08 г / моль): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25 и 1: 0. Зрительный нерв инкубируют в каждом растворе при комнатной температуре в течение O / N периода.
5. Выдержите зрительных нервов, внедренных в 100% эпоксидной смолы (последний шаг от 6,4) при 60 ° С в течение еще 48 часов.
6. Создавать полу-тонкие оптические поперечные сечения нерва (0,75 мкм) с использованием микротома.
7. Пятно зрительных нервов поперечные сечения с 1% толуидиновым синим.
8. Количественно аксоны РГК в пяти непересекающихся областях каждой секции зрительного нерва , как описано ^19.

Результаты

Нагнетание магнитных микрогранул в переднюю камеру взрослых мышей, описанных в данном протоколе привели к надежным и воспроизводимым возвышения ВГД. Через неделю после процедуры, ВГД увеличилась с 10 ± 0,6 мм рт.ст. (среднее ± SEM), средний базовый уровень ВГД в глазах контрлатеральных, до 19 ± 0,5 мм рт.ст. при гипертонической глаза (т Студенческий -test; *** р <0,001, п = 12, Таблица 1, Рисунок 2). ВГД стабилизировалась после этого и оставался повышенным в среднем 20 мм ртутного столба в течение не менее 6 недель, самый длинный временной точке, рассмотренной в данном исследовании. Средний пик ВГД в Microbead инъецированных глазах в возрасте 2, 3 и 6 недель после операции была 25 мм рт. Подавляющее большинство обработанных мышей разработали устойчивый высокий ВГД, поэтому этот протокол не требует вторую инъекцию микрогранул.

Для оценки времени процесса потери RGC в этой модели RGC сома былипервый количественно иммунным с Brn3a, в RGC-специфического маркера ^17. Число Brn3a-позитивных клеток количественно определяли на плоских монтажа сетчаток на 1, 2, 3 и 6 недель после индукции глазной гипертензии. Хотя значительное повышение ВГД был обнаружен еще в 1 неделю после инъекции микрогранулами, не наблюдалось существенной потери RGC сомы в течение первых 2 недель после процедуры (рисунок 3). Существенная смерть ГКС (22%), тем не менее, было очевидно в течение 3 недель (2,430 ± 67 мм / РСК ^2, среднее значение ± SEM, n = 12) и через 6 недель (2350 ± 74 ГКС / мм ^2, п = 10) пост- индукция глазной гипертензии, по сравнению с интактными глазами управления от неоперированного мышей (3,141 ± 49 РГК / мм ^2, п = 23) (ANOVA, р <0,001).

Дисфункция и дегенерация аксонов RGC является кардинальным признаком глаукомы. Поэтому аксонов потери был рассмотрен на 3 и 6 недель после инъекции микрогранулами поКоличественное определение RGC аксонов зрительного нерва в поперечных срезах , окрашенных толуидиновым синим (рисунок 4). Значительная потеря RGC аксонов (25%) наблюдался в 3-х недель (28,401 ± 702 аксонов нерва /, среднее значение ± SEM, п = 5) и 6 недель (29,426 ± 948 аксоны нерва /, п = 6) после инъекции микрошарики по сравнению с интактными зрительных нервов от неоперированного глаз (39467 ± 137 / аксонов нерва, п = 4) (ANOVA, р <0,001). В совокупности эти данные показывают, что введение магнитных микрогранул в мышь передней камеры приводит к воспроизводимым и поддерживаемое повышение ВГД, которое приводит к RGC сомы и аксонов дегенерации.

Время после операции OHT		N	Среднее ВГД (мм рт.ст.) ± SEM			Пик IOP (мм рт.ст.)
			противоположный	глаукома	диfference	противоположный	глаукома
1 неделя		12	10 ± 0,4	19 ± 0,5	9 ± 0,6	12 ± 0,4	22 ± 0,6
2 недели		13	11 ± 0,5	20 ± 0,8	9 ± 0,5	12 ± 0,9	25 ± 0,7
3 недели		10	11 ± 0,8	20 ± 0,7	10 ± 0,9	13 ± 0,2	25 ± 0,9
6 недель		12	12 ± 0,5	20 ± 0,6	9 ± 0,7	13 ± 0,5	24 ± 0,6

Таблица 1. Повышение внутриглазного давления в мышиной магнитном Microbead Occlusiна модели. бодрствующих самки С57 BL / 6 мышей, ВГД измеряли с помощью калиброванного отскока тонометром. Управляется глаза отображается увеличение ВГД обнаруженную на одну неделю после операции, которая остается повышенным в течение по крайней мере шести недель после процедуры.

Рисунок 1. Workflow из этапов в мышиной магнитной Microbead Occlusion Модель Глаукома. Шаг за шагом план всех процедур , выполняемых до, во время и после операции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Увеличение внутриглазного давления в мышиной Магнитная Microbead Occlusion модели. В просыпаютсяженщины-С57 BL / 6 мышей, ВГД измеряли с помощью калиброванного отскока тонометром. ИППО из Microbead-впрыскивается глаза были значительно повышены на одну неделю после операции (ANOVA, р <0,001). ИППО оставалась значительно выше по сравнению с контралатеральной глаз вводили мышам в течение не менее 6 недель (ANOVA, p <0,001). (Неповрежденными: п = 12; 1 неделя: п = 12, 2 недели: N = 13, 3 недели: N = 10, 6 недель: п = 12). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. сетчатке ганглиозных клеток Смерть в мышином магнитных Microbead окклюзия модели. РГК визуализировали иммунным плоских монтажа сетчатке с использованием Brn3a в интактных контрольных сетчаток (А) и глаукомой сетчатке через 3 и 6 недель после инъекции микрогранулами , чтобы побудитьглазной гипертензии (ОНТ) (В, С). Шкала баров: 20 мкм. (Д) Количественный анализ подтвердил , что инъекция Microbead привело к значительным потерям сомы RGC через 3 и 6 недель после того, как процедура по сравнению с контрольными глазами. Плотность RGC сомы в неповрежденной, без глаукоме C57 / мышей BL6 показан в качестве эталонных (белых полос, 100% выживаемости). Величины выражены как среднее ± SEM (интактный: N = 23; 1 неделя: N = 6, 2 недели: N = 6, 3 недели: N = 12, 6 недель: n = 10, дисперсионный анализ, *** р < 0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. дегенерация аксонов в мышиной аксонов Магнитная Microbead окклюзия модель. RGC визуализировали окрашиванием зрительного нерва сечениям с толуидиновым синим винтактный контроль (А) и глаукоме сетчаток через 3 и 6 недель после инъекции , чтобы побудить микрогранулами глазной гипертензии (ОНТ) (В, С). Шкала баров: 10 мкм. (Д) Количественный анализ подтвердил , что инъекция Microbead приводит к значительной потере аксонов RGC через 3 и 6 недель после того, как процедура по сравнению с контрольными глазами. Плотность RGC аксонов в неповрежденной, без глаукоме C57 / мышей BL6 показан в качестве эталонных (белых полос, 100% выживаемости). Значения выражены как среднее ± SEM (неповрежденными: п = 4; 3 недели: N = 5, 6 недель: N = 6, ANOVA, *** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры ,

Обсуждение

Видео техника, представленная здесь представлены подробные шаг за шагом инструкции о том, как выполнить внутрикамерного инъекцию магнитных микрогранул эффективно и воспроизводимо вызывают повышение ВГД у мышей. Эта процедура приводит к устойчивому увеличению ВГД, которое не требует дополнительных инъекций и способствует обнаруживаемого RGC сому и потерю аксонов в течение первых 3-х недель глазной гипертензии induction.Elevated ВГД является основным фактором риска для развития глаукомы у людей. Таким образом, это является ценным мышиный глазной гипертензии-зависимой глаукомой модель, которая имеет потенциал для широкого круга применений.

Общим недостатком, связанным с инъекцией микрошариков в переднюю камеру относится к бусинка рефлюкса через месте инъекции, когда иглу вынимают, что часто приводит лишь к частичной обструкцией оттоку и повышенной изменчивости. Для решения этой проблемы, были реализованы несколько важных изменений. Елки т, тщательная подготовка чистой, острой стеклянной микроиглы с фацетной скос имеет важное значение для успешной инъекции микросфер. Правильно подготовленный микроиглы обеспечивает контролируемое и плавное проникновение роговицы с минимальным приложением давления к деликатной поверхности глазного яблока. Небольшой прокол роговицы предотвращает обратный поток микрогранул. Кроме того, штраф микроиглы снижает риск повреждения близлежащих структур, таких как радужки и хрусталика, что может привести к воспалению без заболеваний, связанных. Во-вторых, применение портативного магнита к стратегическим районам глазными во время и после инъекции является еще одним важным аспектом этой методики. Во время инъекции, магнит используется для рисования магнитные микрогранулы в переднюю камеру предотвращения рефлюкса микрошариков, когда микроиглы снимается. После инъекции магнит затем используется, чтобы направить микрогранулы к радужно-роговичный угол, чтобы блокировать отток водный юмор.

палатка "> Еще одна проблема часто встречается в моделях Microbead прикуса является то , что повторные инъекции шарик часто необходимы для достижения устойчивого ВГД до уровня ^10,11. Это может быть результатом микрошариков выбивании из угла передней камеры глаза с течением времени. Сочетание карманного магнита, как описано выше, и позиционирование мыши после операции значительно улучшает результат. парентерального введения противотуберкулезных анестезирующих средств, которые обеспечивают гибкость, чтобы перемещать головку во время процедуры и требуют более длительного послеоперационного периода восстановления благоприятствуют. Размещение мышь с оперированного глаза вверх в течение нескольких часов после операции способствует урегулированию микрогранул на радужно-роговичный угол и уменьшает риск выбивании обратно в переднюю камеру.

Обеспечение того, чтобы число инжектированных шариков является относительно последовательным является еще одним важным шагом на пути к минимуму вариаций между животными. Поскольку микросферы оседают на Ьottom трубки, необходимо в полной мере гомогенизации раствора Microbead и вывести соответствующий объем в микроиглы своевременно. Инъекция меньшего количества шариков в переднюю камеру может привести к неполному блокированию водянистой влаге дренажных сооружений, что может привести к плохой или переменной высоты ВГД. Следует отметить, что хотя конечной целью инъекции микрогранулами, чтобы поднять ВГД, следует соблюдать осторожность при проведении измерений ВГД от бодрствования мышей выше пиковых значений в этом исследовании (~ 25 мм рт.ст.). Чрезвычайно высокие IOPs увеличивают риск ишемического повреждения, а также может вызвать боль животному. Повышение ВГД следует рассматривать как один из многих факторов, чтобы оценить успех операции. Таким образом, результаты процедуры должна быть оценена на основе нескольких параметров, в том числе повышение ВГД, RGC смерть сомы и потери аксонов.

Хотя протокол, описанный здесь, приводит в большинстве успешных микрошариковLY оседание под углом, потенциальным недостатком этой модели является то, что эти шарики, которые остаются плавающие в передней камере может помешать живого изображения сетчатки глаза через роговицу, а также электрофизиологические или поведенческих анализов, которые требуют эффективного прохождения света. Еще один важный аспект необходимо учитывать при использовании этой модели Microbead окклюзия является то, что степень подъема ВГД и последующего перерождения RGC изменяется в зависимости от возраста и генетического фона оперируемой мыши [4]. Таким образом, степень возвышения IOP и сроки дегенерации RGC должны быть определены для каждой конкретной трансгенной линии мыши и / или возрастной диапазон.

Особенностью данной модели является то, что повышенные результаты ВГД в постепенной потере смерти RGC в течение первых трех недель после инъекции микрогранулами и значительной гибели RGC обнаруживается через 3 недели после процедуры. Следовательно, эта модель позволяет изучение ранних и / или тонкие изменения, которые происходят в этом гisease, до изобличению RGC сому и потерю аксонов. Значительное увеличение гибели RGC не наблюдалось между 3 и 6 недель после индукции глазной гипертензии. На самом деле, ГКС сома и аксон потери оставались стабильными при ~ 22 - 25%, от 3 до 6 недель, несмотря на успешное и устойчивое повышение ВГД в этих временных точках. Более длительный срок поступательному ВГД может потребоваться для дополнительной потери RGC произойти в C57BL / 6 мышей, которые , как представляется, более устойчивы к повреждениям RGC по сравнению с другими штаммами мыши. ⁵ Дополнительные модификации протокола , представленного здесь, включая корректировку размера шарика и дополнительные инъекции, которые могут потребоваться для изучения потери RGC в более поздние моменты времени. Таким образом, наш протокол идеально подходит для исследований, ориентированных на ранних патофизиологических изменений, которые коррелируют со скромными RGC нейродегенеративные, которые имеют отношение к возникновению и ранней прогрессии в человеческой глаукомы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Puller	Narishige	PC-10
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW150F-4	Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm
Stereo Microscope	Zeiss	MZ9.5	Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.
Footswitch	Linemaster	T-91-SE
Stainless Steel Blade	Feather	No. 11
Microelectrode Beveler	Science Products	BV-10
Aerosol Duster	Fisher	23-022-523
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Dynabeads M-450 Epoxy	Life Technologies	14011	Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4°C.
Mini-Tube Rotators	Fisher Scientific	05-450-127
3 Handheld Magnets	Geomag		0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.
25 mL serological pipet	Costar	4489
Pipet	Drummond	4-000-101
Biological Containment Hood	Biostad	377355
Balanced salt solution (BSS)	Alcon	0065-0800-25
P1000 Micropipet	Gilson	F123602
Microtube 1.5 mL	Sarstedt	72.690
P200 Micropipet	Gilson	F123601
0.2 mL PCR tube	Sarstedt	72737.002
Ketamine			Controlled substance
Xylazine	Bayer Healthcare
Acepromazine	Vetoquinol
U-100 Insulin Syringe	Becton Dickinson and Company	329461
Balance	Ohaus	CS 200
Buprenorphine			Controlled substance
Tropicamide ophthalmic solution	Alcon	0998-0355-15	1% Mydriacyl
Manual Microsyringe Pump with Digital Display	World Precision Instruments	DMP
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Platform	Fisher Scientific	14-673-52	8 x 8 inch
Absorbent swabs	Kettenbach	30601
P20 Micropipet	Gilson	F123600
Plastic forcep	Euroband	1001	Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye
Fluoroquinolone ophthalmic solution	Alcon		Vigamox
Heating pad	Sunbeam	E12107-834
Tonometer	iCare	TV02	TONOLAB rebound tonometer
Paraformaldehyde, Para	Fisher Scientific	T353-500
Dissection tools
Small brush
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G7651
Sodium Cacodylate, tryhydrate	Canemco and Marivec	124-65-2
Brn-3a antibody (C-20)	Santa Cruz Biotechnology	sc-31984
Tissue Culture Plate, 48 well	Falcon	353078
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Life Technologies	A-11058
Aluminum foil
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Slow fade Gold antifade reagent	Life Technologies	S36936
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5E
Osmium tetroxide 2% aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	3294949
Embed-812	Electron Microscopy Sciences	14900
Dodecenyl succinic anhydride	Electron Microscopy Sciences	13710
Nadic methyl anhydride	Electron Microscopy Sciences	19000
DMP-30	Electron Microscopy Sciences	13600
Propylene oxide	Sigma-Aldrich	110205-1L
Embedding mold-Dykstra	Electron Microscopy Sciences	70907
Porter-Blum ultra-microtome	Sorvall	MT-2
Toluidine blue O (Certified Biological Stain)	Fisher-Scientific	T161-25