A Magnetic Microbead Occlusion Modèle à Provoquer Ocular Hypertension dépendante Glaucome chez la souris

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour induire une hypertension oculaire dans l'oeil murin qui se traduit par la perte des cellules ganglionnaires de la rétine comme observé dans le glaucome. microbilles magnétiques sont injectés dans la chambre antérieure et attirés par l'angle irido utilisant un aimant pour bloquer l'écoulement de l'humeur aqueuse.

Résumé

L'utilisation de modèles de rongeurs de glaucome a été essentiel de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la physiopathologie de cette maladie neurodégénérative multifactorielle. Avec l'avènement de nombreuses lignées de souris transgéniques, il existe un intérêt croissant dans les modèles murins inductible de l'hypertension oculaire. Ici, nous présentons un modèle d'occlusion de glaucome basé sur l'injection de microbilles magnétiques dans la chambre antérieure de l'oeil en utilisant une micro-aiguille modifié avec un biseau facettes. Les microbilles magnétiques sont attirés par l'angle irido utilisant un aimant de poche pour bloquer l'écoulement de l'humeur aqueuse de la chambre antérieure. Cette perturbation de la dynamique aqueux se traduit par une élévation constante de la pression intra-oculaire, ce qui conduit par la suite à la perte des cellules ganglionnaires de la rétine, comme on l'observe chez les patients atteints de glaucome humain. Le modèle microbilles d'occlusion présenté dans ce manuscrit est simple, comparé à d'autres modèles inductibles de glaucome et aussi fortementefficace et reproductible. Fait important, les modifications présentées ici de minimiser les problèmes communs qui se posent souvent dans les modèles d'occlusion. Tout d'abord, l'utilisation d'une micro-aiguille en verre biseauté empêche le retour de microbilles et assure un minimum de dommages à la cornée se produit lors de l'injection, ce qui réduit ainsi les effets liés aux blessures. Deuxièmement, l'utilisation de microbilles magnétiques assure la capacité d'attirer la plupart des perles à l'angle irido - cornéen, ce qui réduit efficacement le nombre de perles flottantes dans la chambre antérieure en évitant le contact avec d' autres structures (par exemple., Iris, lentilles). Enfin, l'utilisation d'un aimant de poche permet une flexibilité lors de la manipulation de l'œil de la souris petite pour diriger efficacement les microbilles magnétiques et veiller à ce qu'il y ait peu de reflux des microbilles de l'œil lorsque la microaiguille est retiré. En résumé, le modèle de souris d'occlusion de microbilles présenté ici est un puissant outil d'enquête pour étudier les changements neurodégénératifs qui se produisent au cours de l'apparition et la progression de glaucoma.

Introduction

Le glaucome est une maladie progressive et irréversible aveuglante qui touchera environ 80 millions de personnes dans le monde d'ici 2020 ^1. Chez les patients atteints de glaucome, la perte de vision est causée par la mort sélective des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), les neurones de sortie qui transmettent l' information visuelle de la rétine au cerveau. Le glaucome est une maladie neurodégénérative liée à l'âge avec de nombreux facteurs de risque dont le plus commun est la pression intraoculaire élevée (PIO). En effet, la PIO est le seul facteur de risque modifiable dans le glaucome et les traitements actuels se concentrent uniquement sur la gestion de la pression oculaire. Cependant, les facteurs génétiques, cellulaires et environnementaux multiples affectent l'apparition et la progression de cette maladie. Par conséquent, la compréhension des différents mécanismes qui contribuent finalement à la mort neuronale est essentiel de développer des traitements efficaces pour le glaucome.

Les modèles animaux de glaucome sont essentielles pour étudier la physiopathologie de la maladie et d'identifier et de testerthérapeutiques prometteuses. La disponibilité croissante des lignées de souris transgéniques, y compris des souches et des souris knock-out conditionnel portant traceurs fluorescents génétiquement encodés a propulsé la nécessité pour les modèles de glaucome murins inductibles. Plusieurs modèles de rongeurs de glaucome ont été développés au fil des ans (examinés dans ^2,3). Dans un grand nombre de ces modèles, le glaucome est induite en perturbant la dynamique de l'humeur aqueuse, ce qui entraîne l'élévation de la PIO. Modèles Occlusion, dans lequel les microbilles ou d' autres substances sont injectées dans la chambre antérieure de l'oeil pour bloquer le drainage aqueux, ont gagné en popularité au cours des dernières années , en partie en raison de leur relative facilité d'augmenter la PIO ^4-14.

Le modèle de microbilles d'occlusion du glaucome, d' abord réalisée chez les primates ^12, les lapins et les rats ^{8, 4,9,11,} a récemment été adapté pour être utilisé chez les souris ^5,6,10. Dans ces études, l'injection intracamérulaire de microbilles de polystyrène, seul ou encombinaison avec un matériau visco - élastique, a entraîné PIO conduisant à la mort subséquente RGC ^6,10. Cependant, le reflux lorsque l'aiguille est retirée de l'oeil et le délogement de microbilles de l'angle irido-cornéen sont des problèmes communs qui se posent lors de la procédure. Pour minimiser ces inconvénients, les aimants ont été utilisés pour attirer les microbilles magnétiques à l'angle irido - cornéen de l'oeil ^4,9.

Le protocole décrit ici est un mode opératoire modifié basé sur des études antérieures ^9,10 qui utilise des microbilles magnétiques et un aimant de poche adapté à l'oeil de la souris (figure 1). Plusieurs modifications importantes ont été introduites dans notre protocole pour assurer l'augmentation de la PIO efficace et reproductible chez la souris. En premier lieu, l'injection de microbilles est effectuée en utilisant une micro-aiguille en verre soigneusement préparé avec un biseau facettes. Les surfaces lisses résultant de la microaiguille ainsi que sa pointe aiguisée assure que le minimum de dommages estinfligé comme il perfore la cornée. L'utilisation de ce micro-aiguille de verre se traduit également par un contrôle accru lorsque la pointe de micro-aiguille pénètre dans la chambre antérieure, réduisant ainsi le risque de structures à proximité dommageables tels que l'iris et le cristallin. En outre, la lésion d'injection minuscule facilite la cornée auto-réparation et réduit les effets liés aux blessures non désirées.

En second lieu, l'injection de microbilles magnétiques, et l'utilisation d'un aimant terminal mobile permettent un contrôle précis afin d'attirer les billes vers l'angle irido dans le petit oeil de la souris. microbilles magnétiques qui sont 4,5 um de diamètre ont été utilisées parce que cette taille de microbilles n'a pas obstruer l'ouverture de microaiguilles préparé et surtout, une fois injecté, ces microbilles efficacement bloqué le drainage de l'humeur aqueuse. Cette approche réduit non seulement le reflux des microbilles injectés, mais assure également que le nombre maximum de microbilles accumule dans la zone cible pour bloquer efficacement le drainage de l'humeur aqueuse. Furthermore, cette stratégie permet également de réduire le nombre de billes flottant dans la chambre antérieure en évitant le contact avec d'autres structures, telles que l'iris et le cristallin, et empêchant le passage à la chambre postérieure. Collectivement, ces modifications assurent que l'opération d'injection de microbilles est réalisée avec une relative facilité et en temps opportun, entraînant une induction très reproductible, efficace et durable de l'hypertension oculaire chez la souris.

Protocole

La procédure suivante a été réalisée en conformité avec les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux pour l'utilisation des animaux d'expérimentation et de la Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et de la recherche visuelle de l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO).

1. Préparation de la micro-aiguille pour injection intracamérulaire Anterior

1. Avec un extracteur, de générer une micro-aiguille à partir d'un capillaire en verre au borosilicate
2. Sous un microscope, utiliser une lame tranchante pour créer soigneusement une ouverture à la pointe de la microaiguille. L'ouverture résultante doit avoir une forme elliptique avec un grand diamètre et de petit axe d'environ 190 pm et 70 pm, respectivement. Mesurer la surface de la microaiguille ouverture préparée par une première acquisition d'images avec une règle placée sous le microscope, suivie par une quantification en utilisant un logiciel d'analyse d'images.
3. Dans le système micropipette de biseautage, placez la microaiguille à un degre 20e angle par rapport à la plaque de biseautage de sorte que l'ouverture de la micro-aiguille est en contact avec la plaque. Bevel pendant environ 10 min jusqu'à ce que les bords sont à plat et lisse. Ajouter quelques gouttes d'eau distillée pour faciliter le processus.
4. Tournez la microaiguille de biseauter les deux bords entourant l'ouverture jusqu'à ce que la pointe est forte.
5. Nettoyez tous les débris et l'eau de l'ouverture de la pointe microaiguille en utilisant un chiffon en aérosol.
6. Examinez soigneusement la microaiguille finie sous un microscope. microaiguilles Jeter avec des fractures pour minimiser le risque de rupture de la micro-aiguille lors de la chirurgie.
7. Stériliser la microaiguille par rinçage avec de l'éthanol d'abord, puis avec une solution saline équilibrée stérile (BSS).

2. Préparation de la solution de microbilles magnétiques

Remarque: Les microbilles magnétiques utilisés dans cette étude sont revêtues avec des groupes époxy. Pour éviter les effets indésirables, tels que l'agglutination des billes et des interactions moléculaires indésirables, ces groupes époxy doitd'abord être retiré de microbilles avant de procéder à l'opération d'injection.

1. Enlèvement des groupes époxy de billes magnétiques
   1. Préparer une solution de 0,02 M d'hydroxyde de sodium (NaOH, poids moléculaire 39.997 g / mol) dans un tampon Tris 10X (poids moléculaire 121,14 g / mol).
   2. Vortex doucement le stock de solution de microbille magnétique (4,5 um de diamètre, 4 x 10 ⁸ billes / ml) jusqu'à ce que les billes sont uniformément en suspension dans la solution.
   3. pipeter rapidement 1 ml de solution de bille magnétique dans 50 ml de NaOH 0,02 M dans un tampon 10x Tris.
   4. Tourner pendant 24 heures à température ambiante pour éliminer les groupes époxy des billes.
   5. Collecter les perles en fixant un aimant au fond du tube. Orienter le tube horizontalement pour faire en sorte que toutes les perles sont attirées vers l'aimant. Tourner pour un 4 heures supplémentaires à la température ambiante.
   6. Avec une micropipette, retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot de billes.
   7. vortexer doucement le culot dans 50 ml de 10x Tris tampon jusqu'à ce que les billes sont bien suspendues.
   8. Répétez les étapes 2.1.4 à 2.1.6.
2. La concentration et la remise en suspension des microbilles magnétiques dans une solution saline équilibrée stérile

Remarque: Il est nécessaire de concentrer l'action de la solution de billes magnétiques dans une solution saline équilibrée stérile (BSS) pour atteindre une concentration finale de 1,6 x 10 ⁶ billes / ul de telle sorte que 2,4 x 10 ⁶ billes peuvent être injectées dans la chambre antérieure dans une volume final de 1,5 pi, qui est approprié pour le petit oeil de la souris.

1. Laver les billes dans 5 ml d'eau ultra-pure qualité laboratoire faisant tourbillonner doucement pendant 2 min.
2. Recueillir les billes en les attirant vers le fond du tube avec un aimant.
3. Avec une micropipette, retirez avec précaution l'eau sans perturber le culot de billes.
4. Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.3 trois fois plus.
5. Dans une hotte à flux laminaire, laver les billes avec 500 pl de SRS par pipetting haut et vers le bas. Suivez les étapes restantes de cette section dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire.
6. Recueillir les billes en les attirant vers le fond du tube avec un aimant.
7. Avec une micropipette, retirez délicatement le BSS sans perturber le culot de billes.
8. Répétez les étapes 2.2.5 à 2.2.7 trois fois plus.
9. Resuspendre par pipetage les perles et dans 250 pi de BSS.
10. Assurez-vous que la solution de perle est bien homogénéisé. Ensuite, aliquoter rapidement 25 ul de la suspension dans des tubes stériles de 0,5 ml. La concentration finale de la solution mère de talon est de 1,6 x 10 ⁶ billes / ul.
11. Conserver à 4 ° C.

3. L'induction de l'hypertension oculaire

Remarque: L'article 3 est une opération de deux personnes. Dans le cas où une action particulière doit être effectuée par une personne en particulier, la personne appropriée est identifiée. En général, la Personne 1 gère la souris sous le microscope alors que la personne 2 est responsable pour manipuler la pompe microseringue. La durée totale de l'intervention chirurgicale doit être inférieure à 10 min (étapes 03/09 à 03/17).

1. Exécuter les procédures en C57BL / 6 souris adultes. Les souris domestiques dans un environnement standard avec accès à la nourriture et de l' eau ad libitum. Dans cet article, utilisez femelle C57BL / 6 entre 3 et 4,5 mois d'âge. Cependant, ce protocole peut être adapté à des souris mâles et d'âges différents, ainsi que d'autres souches de souris, y compris les souris transgéniques et knock-out.
2. Mesurer la PIO de base chez la souris éveillée avant l'injection de l'anesthésie et microbille en utilisant un tonomètre rebond calibré. Appliquer une goutte de chlorhydrate de proparacaïne sur la cornée.
   1. retenir délicatement la souris en maintenant la peau entre les oreilles. Placez la souris sur la paillasse pour que l'animal est à l'aise et les yeux sont accessibles. Tenez le tonomètre perpendiculaire à la surface de la cornée et de prendre au moins trois séries de dix lectures consécutives par oeil pour obtenir unemoyenne IOP. La mesure de la PIO chez la souris éveillée est préférable de contourner les effets liés à l'anesthésie sur la PIO. Alternativement, la PIO peut être mesurée chez les souris anesthésiées après l'étape 3.4.
3. Préparer un mélange cocktail d'anesthésie stock souris composée de 20 mg / ml de kétamine, 2 mg / ml de xylazine, et 0,4 mg / ml acépromazine.
4. Induire une anesthésie chez la souris par administration intraperitoneale du mélange de cocktail (1 ul / g de poids corporel). L'utilisation d'un anesthésique cocktail injectable est préférable à des anesthésiques de gaz (par exemple, isoflurane) , car il permet une flexibilité lors de la manipulation de la tête de la souris que l'animal ne soit pas relié à un masque d'inhalation. En outre, la période de récupération est plus nécessaire avec un anesthésique injectable assure que microbilles régler à l'angle irido sans déloger de nouveau dans la chambre antérieure.
5. Administrer 0,05 mg par kg de poids corporel, de la buprénorphine sous-cutanée.
6. Traiter l'oeil avec un ey tropicamidee drop pour induire la dilatation des pupilles. En raison de la petite taille de la chambre antérieure murin, l'élève doit être dilaté pour visualiser facilement le positionnement et la promotion de la micro-aiguille lors de l'injection.
7. Appliquer une pommade topique sur l'oeil controlatéral (ONU-opéré) pour éviter le séchage de la cornée pendant la procédure.
8. Fixer une micro-aiguille propre à l'ensemble d'injection de la pompe à microseringue. Remplacer la micro-aiguille après chaque opération pour éviter toute contamination croisée des animaux.
9. Personne 1: Transférer la souris anesthésiés à la plate-forme d'exploitation. Sous le microscope, veiller à ce que l'élève est complètement dilaté et que les muscles oculaires sont détendus de sorte qu'il n'y a pas de mouvement de l'oeil. L'absence de mouvements oculaires assure la stabilité pendant l'injection. Essuyez doucement la chute tropicamide oculaire de l'oeil en utilisant des tampons absorbants.
10. Personne 2: Mélanger la solution de microbille magnétique par pipetage de haut en bas.
11. Utilisation de la pompe à microseringue, charger immédiatement le microneedle (préparé dans la section 1) avec 1,5 pi de la solution de microbille magnétique homogénéisé (2,4 x 10 ⁶ perles). Veiller à ce que les bulles d'air sont absents à la pointe de la microaiguille. Après la microaiguille est chargé, effectuer les étapes de 3,12 à 3,13 le plus rapidement possible afin que la solution de microbille magnétique reste dans une suspension homogène.
12. Positionner le microaiguille chargé à un angle de 45 °, placé en avant par rapport au limbe. Personne 1: soutenir l'œil à l'aide des pinces en plastique. Faire en sorte que l'angle entre le micro-aiguille et la pince en plastique est d'environ 90 °.
13. Personne 2: Avec la microaiguille chargée, percer doucement la cornée de sorte que la pointe de la micro-aiguille pénètre dans la chambre antérieure. Assurez-vous que la microaiguille chargée reste à un angle de 45 ° par rapport au limbe pendant la ponction. Éviter tout contact avec la lentille ou l'iris. Assurez-vous que la microaiguille ne pénètre pas dans la chambre postérieure. Personne 1: continuer à soutenir l'œilen utilisant une pince en plastique.
14. Personne 1: Sans bouger la tête de la souris, placez l'aimant à côté de l'oeil, en face de la pointe de la micro-aiguille, pour attirer les billes magnétiques dans la chambre antérieure et de minimiser le contact des billes avec la surface interne de la cornée. Personne 2: Utilisation de la pompe à microseringue, injecter 1,5 pl de la solution de bille magnétique dans la chambre antérieure. La solution de microbilles est injectée sur une période de 15 à 30 secondes. Personne 1: Continuer de tenir l'aimant opposé à la pointe de la micro-aiguille pendant toute la durée de l'injection.
15. Personne 2: Une fois le plein volume de perles a été injecté, retirer lentement la microaiguille de l'œil. Personne 1: Pour éviter le reflux des microbilles, continuent d'attirer les billes magnétiques vers la chambre antérieure en maintenant l'aimant à côté de l'oeil pour un montant supplémentaire de 30 à 60 sec.
16. Personne 1: Utilisation de l'aimant, attirer les perles à l'angle irido-cornéen. Veiller à ce que les billes forment un noyau uniformément répartieautour de la circonférence de la chambre antérieure. Au cours de cette étape, éviter d'attirer des perles à la cornée comme ils ont tendance à coller à la surface interne de la cornée lors d'un contact.
17. Traiter l'œil opéré avec un collyre antibiotique pour minimiser le risque d'infection.
18. Laissez la souris pour récupérer sur un coussin chauffant jusqu'à complètement réveillé (~ 3-4 heures). Placez la souris de sorte que l'œil opéré est tourné vers le haut. Ce positionnement permet d'éviter l'accumulation des billes injectées à la surface intérieure de la cornée par la force gravitationnelle. En outre, cette position diminuera le risque d'infection de l'œil opéré ne sera pas en contact avec une literie et / ou d'autres matières qui peuvent être présentes dans la cage. Dans le cas où un animal affiche tout signe de détresse, d'administrer des doses supplémentaires de buprénorphine au besoin.
19. Permettre aux souris de se remettre de la procédure pendant au moins 2 jours avant de prendre des mesures de la PIO. Mesurer la PIO comme décrit dans 3.2. Monitor IOP au moins une fois par semaine ou plus fréquemment, au besoin, et en même temps de la journée pour minimiser les fluctuations circadiennes liées.
20. Pour les mesures de la PIO, utilisez l'oeil controlatéral de la souris fonctionne comme un contrôle interne. Vous pouvez également utiliser des mesures à partir intactes, non-exploités comme témoins naïfs ou souris pseudo-opérés.

4. Évaluation des cellules ganglionnaires de la rétine Soma et Axon Survival

1. Perfuse des souris soumises à une hypertension oculaire par injection intracardiaque d'une solution 0,1 M de tampon phosphate (PBS) suivie immédiatement refroidi à la glace 4% de paraformaldehyde (PFA).
2. Perfuser souris intactes, non opérés comme décrit dans 4.1 et de les utiliser en tant que témoins indemnes. L'utilisation des yeux controlatérale de souris exploités est recommandé de ne pas évaluer la survie RGC parce que les changements dans les yeux controlatérale suivants blessures ont été signalés ^15,16 et peuvent fausser l' interprétation des données. Vous pouvez également utiliser des yeux opérés de manière fictive injectés avec 1.5 Pi de BSS en tant que témoins.
3. Utilisation de microciseaux, découpez soigneusement le tissu conjonctif autour de l'œil de l'isoler de l'orbite de l'œil. Séparer le nerf optique de l'œil en le coupant au niveau de la tête du nerf optique.
4. En utilisant une aiguille 30 G, faire un trou dans la cornée pour permettre la pénétration de la solution de fixateur dans l'œil. Placer l'oeil dans 4% de PFA et incuber pendant 1 heure à 4 ° C pour une fixation supplémentaire.
5. Placer le nerf optique dans une solution contenant 2% de PFA et 2,5% de glutaraldéhyde dans 0,1 M de cacodylate de sodium (PM: 214 g / mol) et laisser incuber O / N à 4 ° C pour une fixation supplémentaire.

5. rétines Quantification de RGC Soma Densité sur Flat-montés

Remarque: La procédure suivante est adaptée d'un protocole par Nadal-Nicolas et al ¹⁷ et décrit la quantification de RGC en utilisant un anticorps contre le homeobox / POU protéine de domaine 3A spécifiques du cerveau (Brn3a) sur-supports plats rétiniennes.. Alternative methods pour RGC étiquetage peuvent également être utilisés, y compris l'immunohistochimie avec un anticorps contre la protéine de liaison à l'ARN avec épissage multiple (RBPMS) ou marquage rétrograde avec Fluorogold ou Dil.

1. Sous un microscope à dissection, enlever la partie antérieure de l'œil en faisant une incision le long de la totalité du limbe jusqu'à ce que la cornée se détache facilement. Retirez la cornée et le cristallin. Détacher délicatement la rétine de l'œil en faisant des coupes le long de l'ora serrata et le nerf optique.
2. Préparer un plat de montage de la rétine en faisant quatre petites incisions équidistantes de la périphérie de la rétine vers le nerf optique de délimiter clairement les quatre quadrants de la rétine. En utilisant une petite brosse, retirez délicatement tout vitreux restant de la rétine. La suppression de tant humeur vitrée que possible est essentiel pour obtenir un signal immunohistochimique propre et forte.
3. Transférer délicatement la rétine à une plaque de culture sur le fond 48 puits plat contenant 0,5% de Triton X-100 dans du PBS de sorte que la rétine estflottant librement. Assurez-vous que la couche de cellules ganglionnaires est orientée vers le haut.
4. Placer la plaque de culture à -70 ° C pendant 15 min. Après décongélation, les rétines en outre perméabiliser par un lavage deux fois dans l'eau douce 2% de Triton X-100 dans du PBS.
5. Diluer l'anticorps à Brn3a de 0,3 à 0,5 pg / ml avec du PBS contenant 2% de Triton X-100 et 2% de sérum d'âne normal. Incuber la rétine dans la solution d'anticorps primaire Brn3a en agitant doucement O / N à 4 ° C. Les rétines doivent être complètement immergés dans 150 à 200 pi d'une solution à tout moment.
6. Diluer l'anticorps secondaire IgG anti-chèvre d'âne à 2 pg / ml avec du PBS contenant 2% de Triton X-100 et on incube la rétine dans cette solution pendant 2 heures à température ambiante sous agitation douce. La rétine doit être totalement immergé dans la solution d'anticorps à tout moment. Couvrir la plaque de culture avec une feuille d'aluminium pour les étapes restantes pour éviter photoblanchiment.
7. Avec un pinceau, transférer soigneusement la rétine à une diapositive de sorte que le tissu est aussi plat que possible. Sécher à l'air pendant 10 min. Monter en utilisant anti-fade milieu de montage.
8. Examiner les montures plates rétiniennes sous un microscope à fluorescence. Quantifier le nombre de RGC positifs Brn3a dans trois domaines qui ne se chevauchent par quadrant rétinien comme décrit. ¹⁸

6. Quantification de RGC axones sur Optic Nerve Cross Sections

1. Recueillir le nerf optique de l' étape 4.5 et incuber dans 2% de tétroxyde d' osmium (OSO _4, MW 254,23 g / mol) pendant 2 heures.
   Attention: En raison de sa forte toxicité, le tétroxyde d'osmium doit être manipulé dans une hotte avec une tenue de laboratoire approprié.
2. Déshydrater le nerf optique en le plongeant dans des concentrations croissantes d'éthanol (50%, 70%, 90%, 95% et 100%) pendant 15 min à chaque fois.
3. Préparer la résine époxy en utilisant la recette suivante: 15,72 ml Intégrer-812, 6,45 ml d'anhydride dodécénylsuccinique, 7,83 ml d'anhydride nadique de méthyle, 0,45 ml de DMP-30.
4. Séquentiellement incuber le nerf optique dans les solutions composéesdes rapports suivants de résine époxy pour l'oxyde de propylène (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25 et 1: 0. Le nerf optique est incubé dans chaque solution à la température ambiante pour une O / N période.
5. Incuber nerfs optiques noyées dans une résine 100% époxy (dernière étape de 6,4) à 60 ° C pour un 48 heures supplémentaires.
6. Générer sections transversales nerf optique semi-minces (0,75 um) en utilisant un microtome.
7. Colorer sections nerveuses transversales optiques avec 1% de bleu de toluidine.
8. Quantifier les axones RGC dans cinq domaines qui ne se chevauchent de chaque section du nerf optique comme décrit ^19.

Résultats

L'injection de microbilles magnétiques dans la chambre antérieure de souris adultes décrits dans ce protocole a donné lieu à une élévation robuste et reproductible de la PIO. Une semaine après la procédure, la PIO a augmenté de 10 ± 0,6 mm Hg (moyenne ± SEM), la PIO de base moyen dans les yeux controlatérale, à 19 ± 0,5 mm Hg dans les yeux hypertendus (t -test de l' étudiant; *** p <0,001, n = 12, Tableau 1, Figure 2). IOP stabilisée par la suite et est restée élevée à une moyenne de 20 mm Hg pendant au moins 6 semaines, la plus longue durée points examinés dans cette étude. La PIO moyenne de pic dans les yeux injectés de microbilles à 2, 3 et 6 semaines après l'intervention chirurgicale était de 25 mm de Hg. La grande majorité des souris traitées a développé une PIO élevée soutenue, par conséquent, ce protocole ne nécessite pas une seconde injection de microbilles.

Pour évaluer l'évolution temporelle de la perte RGC dans ce modèle, RGC soma étaientpremier quantifiée par immunocoloration avec Brn3a, un marqueur spécifique RGC ^17. Le nombre de cellules positives Brn3a a été quantifié sur des rétines montées à plat à 1, 2, 3 et 6 semaines après l'induction de l'hypertension oculaire. Bien qu'une élévation de la PIO significative a été détectée dès 1 semaine après l' injection de microbilles, sans perte significative de RGC soma a été observée dans les 2 premières semaines de la procédure (Figure 3). Mort RGC substantielle (22%), cependant, était évidente à 3 semaines (2,430 ± 67 RGC / mm ^2, moyenne ± SEM, n = 12) et 6 semaines (2350 ± 74 RGC / mm ^2, n = 10) post l' induction de l' hypertension oculaire, par rapport aux yeux témoins intacts provenant de souris NON-opérée 3,141 ± (49 RGC / mm ^2, n = 23) (ANOVA, p <0,001).

Dysfonction et la dégénérescence des axones RGC est une caractéristique cardinale de glaucome. Par conséquent, la perte axonale a été examiné à 3 et 6 semaines après l'injection de microbilles parquantification des axones RGC dans nerveuses sections optiques colorées avec du bleu de toluidine (figure 4). Une perte importante d'axones RGC (25%) a été observée à 3 semaines (28,401 ± 702 axones / nerf, moyenne ± SEM, n = 5) et 6 semaines (29,426 ± 948 axones / nerf, n = 6) après l'injection de microbilles par rapport aux nerfs optiques intacts des yeux de l'ONU-exploité (39.467 ± 137 axones / nerf, n = 4) (ANOVA, p <0,001). Collectivement, ces données démontrent que l'injection de microbilles magnétiques dans la chambre antérieure de la souris conduit à reproductible et durable PIO qui se traduit par RGC soma et une dégénérescence des axones.

Temps après la chirurgie OHT		N	PIO moyenne (mmHg) ± SEM			Pic IOP (mmHg)
			controlatéral	Glaucome	Différence	controlatéral	Glaucome
1 semaine		12	10 ± 0,4	19 ± 0,5	9 ± 0,6	12 ± 0,4	22 ± 0,6
2 semaines		13	11 ± 0,5	20 ± 0,8	9 ± 0,5	12 ± 0,9	25 ± 0,7
3 semaines		dix	11 ± 0,8	20 ± 0,7	10 ± 0,9	13 ± 0,2	25 ± 0,9
6 semaines		12	12 ± 0,5	20 ± 0,6	9 ± 0,7	13 ± 0,5	24 ± 0,6

Tableau 1. L' élévation de la pression intraoculaire dans le murin magnétique Microbead Occlusile modèle. Dans éveillé femelle C57 BL / 6 souris, la PIO a été mesurée en utilisant un tonomètre à rebond calibré. yeux Operated affichent une augmentation de la PIO détectée à une semaine post-chirurgie qui est restée élevée pendant au moins six semaines après la procédure.

Figure 1. Flux de travail des étapes impliquées dans le murin magnétique Microbead Occlusion Modèle de Glaucome. Étape par étape aperçu de toutes les procédures effectuées avant, pendant et après la chirurgie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Augmentation de la pression intraoculaire dans le modèle murin magnétique Microbead Occlusion. En éveilléfemelles C57 BL / 6 souris, la PIO a été mesurée en utilisant un tonomètre à rebond calibré. Les IOP des yeux de microbilles injection étaient significativement plus élevés à une semaine post-opératoire (ANOVA, p <0,001). Les OIP sont restés élevés de manière significative par rapport à l'oeil controlatéral de souris injectées pendant au moins 6 semaines (ANOVA, p <0,001). (Intact: n = 12; 1 semaine: n = 12, 2 semaines: n = 13, 3 semaines: n = 10, 6 semaines: n = 12). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Retinal Ganglion la mort cellulaire dans les murins magnétiques. RGC Microbead Occlusion modèle ont été visualisées par immunocoloration de rétines plat monté en utilisant Brn3a dans les rétines intactes de contrôle (A) et rétines glaucomateux à 3 et 6 semaines après l' injection de microbilles pour induirel' hypertension oculaire (OHT) (B, C). Barres d'échelle: 20 um. (D) Analyse quantitative a confirmé que l' injection de microbilles a entraîné une perte significative de soma RGC à 3 et 6 semaines après l'intervention par rapport aux yeux témoins. La densité de RGC soma intacte, C57 non-glaucomateux / souris BL6 est montré comme référence (barres blanches, 100% de survie). Les valeurs sont exprimées comme la moyenne ± SEM (à l'état intact: n = 23; 1 semaine: n = 6, 2 semaines, n = 6, 3 semaines: n = 12, 6 semaines, n = 10, ANOVA, *** p < 0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. axonale Degeneration dans les axones microbilles magnétiques Occlusion modèle. RGC murins ont été visualisées par coloration du nerf optique sections transversales avec du bleu de toluidine danstémoin intact (A) et rétines glaucomateux à 3 et 6 semaines après l' injection de microbilles pour induire l' hypertension oculaire (OHT) (B, C). Barres d'échelle: 10 um. (D) Analyse quantitative a confirmé que l' injection de microbilles a donné lieu à une importante perte d'axones CGR à 3 et 6 semaines après l'intervention par rapport aux yeux témoins. La densité des axones RGC dans intacte, C57 non-glaucomateux / souris BL6 est montré comme référence (barres blanches, 100% de survie). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM (Intact: n = 4; 3 semaines: n = 5, 6 semaines: n = 6, ANOVA, *** p <0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Discussion

La technique vidéo présentée ici fournit des instructions étape par étape détaillées sur la façon d'effectuer l'injection intracamérulaire de microbilles magnétiques pour induire de manière efficace et reproductible élévation de la PIO chez les souris. Cette procédure entraîne soutenue augmentation de la PIO qui ne nécessite pas d'injections supplémentaires et favorise détectable soma RGC et la perte axonale dans les 3 premières semaines de l'hypertension oculaire induction.Elevated IOP est un facteur de risque majeur pour le développement du glaucome chez l'homme. Par conséquent, ceci est un modèle murin de valeur oculaire hypertension dépendante du glaucome qui a un potentiel pour un large éventail d'applications.

Un inconvénient commun associé à l'injection de microbilles dans la chambre antérieure se rapporte à perler reflux à travers le site d'injection lorsque l'aiguille est retirée, ce qui se traduit souvent par une obstruction partielle seulement de l'écoulement aqueux et une plus grande variabilité. Pour résoudre ce problème, plusieurs modifications importantes ont été mises en œuvre. Firs t, la préparation minutieuse d'un propre, microaiguille de verre tranchant avec un biseau facettée est essentiel pour l'injection réussie des microbilles. Un microaiguille bien préparé permet la pénétration contrôlée et lisse de la cornée avec une application minimale de la pression à la surface oculaire délicate. La petite perforation de la cornée empêche le reflux de microbilles. En outre, l'amende microaiguille réduit le risque de structures à proximité dommageables tels que l'iris et le cristallin, ce qui pourrait entraîner une inflammation non-maladie liée. En second lieu, l'application d'un aimant terminal mobile vers des zones oculaires stratégiques pendant et après l'injection est un autre aspect important de cette technique. Lors de l'injection, l'aimant est utilisé pour aspirer les microbilles magnétiques dans la chambre antérieure empêchant le reflux des microbilles lors de la micro-aiguille est retirée. Après l'injection, l'aimant est ensuite utilisé pour diriger les microbilles à l'angle irido-cornéen pour bloquer humeur aqueuse.

tente "> Un autre problème souvent rencontré dans les modèles d'occlusion de microbilles est que les injections répétées de perles sont souvent nécessaires pour atteindre soutenue PIO ^10,11. Cela pourrait être le résultat de microbilles délogeant de l'angle irido - cornéen avec le temps. La combinaison d'un aimant de poche, comme décrit ci-dessus, et le positionnement de la souris post-opératoire améliore considérablement le résultat. l'utilisation d'anesthésiques injectables, qui permettent la flexibilité pour déplacer la tête au cours de la procédure et nécessite une période de récupération plus longue post-opératoire, est favorisée. le placement du souris avec l'œil opéré vers le haut pour un couple d'heures après la chirurgie contribue au règlement de microbilles à l'angle irido-cornéen et diminue le risque de délogement de retour dans la chambre antérieure.

Veiller à ce que le nombre de billes injectées est relativement cohérente est une autre étape essentielle pour minimiser les variations inter-animaux. Étant donné que les microbilles se déposent au bOttom du tube, il est nécessaire d'homogénéiser complètement la solution de microbilles et de retirer le volume approprié dans la micro-aiguille d'une manière opportune. L'injection de moins de perles dans la chambre antérieure peut entraîner un blocage incomplet des structures aqueuses de drainage de l'humour, qui est susceptible d'entraîner une faible ou variable élévation de la PIO. Il convient de noter, bien que le but ultime de l'injection de microbilles est d'élever la PIO, la prudence devrait être prise lorsque les mesures de la PIO de souris éveillés sont plus élevés que les valeurs de crête rapportés dans cette étude (~ 25 mmHg). Extrêmement élevées IOP augmentent le risque de lésions ischémiques et peuvent également causer des douleurs à l'animal. L'élévation de la PIO doit être considéré comme l'un des nombreux facteurs pour évaluer le succès de la chirurgie. En tant que tel, le résultat de la procédure devrait être évaluée en fonction de plusieurs paramètres, y compris l'élévation de la PIO, RGC soma la mort, et la perte de l'axone.

Bien que le protocole décrit ici se traduit dans la plupart des microbilles réussiesly régler à l'angle, une limitation potentielle de ce modèle est que les perles qui restent flottant dans la chambre antérieure peuvent interférer avec l'imagerie rétinienne en direct à travers la cornée, ainsi que des tests électrophysiologiques ou comportementaux qui nécessitent le passage efficace de la lumière. Un autre aspect important à considérer lors de l'utilisation de ce modèle d'occlusion de microbilles est que l'étendue de la PIO et la dégénérescence RGC subséquente varie selon l'âge et le fond génétique de la souris exploité [4]. Par conséquent, la mesure de la PIO élévation et la chronologie de la dégénérescence RGC devront être déterminées pour chaque ligne spécifique de souris transgéniques et / ou tranche d'âge.

Une caractéristique de ce modèle est que les résultats de la PIO élevée dans la perte progressive de RGC la mort au cours des trois premières semaines après l'injection de microbilles, et la mort RGC significative est détectée à 3 semaines après la procédure. Par conséquent, ce modèle permet à l'examen des changements précoces et / ou subtiles qui se produisent dans ce dalad ie, avant manifeste RGC soma et la perte axonale. Une augmentation significative de la mort RGC n'a pas été observée entre 3 et 6 semaines après l'induction de l'hypertension oculaire. En fait, RGC soma et axone perte est resté stable à ~ 22-25% entre 3 et 6 semaines en dépit du succès et soutenue élévation de la PIO à ces points de temps. Une plus longue durée prolongée IOP peut être nécessaire en cas de perte RGC supplémentaire de se produire dans C57BL / 6, qui semblent être plus résistants aux dommages RGC par rapport à d' autres souches de souris. ⁵ Des modifications supplémentaires au protocole présenté ici, y compris l' ajustement de la taille du cordon et des injections supplémentaires, pourraient être nécessaires pour étudier la perte RGC aux points de temps plus tard. Par conséquent, notre protocole est idéal pour des études axées sur les changements physiopathologiques précoces qui sont en corrélation avec les modestes neurodégénérescence RGC qui sont pertinentes à l'apparition et la progression rapide dans le glaucome humain.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Puller	Narishige	PC-10
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW150F-4	Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm
Stereo Microscope	Zeiss	MZ9.5	Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.
Footswitch	Linemaster	T-91-SE
Stainless Steel Blade	Feather	No. 11
Microelectrode Beveler	Science Products	BV-10
Aerosol Duster	Fisher	23-022-523
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Dynabeads M-450 Epoxy	Life Technologies	14011	Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C.
Mini-Tube Rotators	Fisher Scientific	05-450-127
3 Handheld Magnets	Geomag		0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.
25 ml serological pipet	Costar	4489
Pipet	Drummond	4-000-101
Biological Containment Hood	Biostad	377355
Balanced salt solution (BSS)	Alcon	0065-0800-25
P1,000 Micropipet	Gilson	F123602
Microtube 1.5 ml	Sarstedt	72.690
P200 Micropipet	Gilson	F123601
0.2 ml PCR tube	Sarstedt	72737.002
Ketamine			Controlled substance
Xylazine	Bayer Healthcare
Acepromazine	Vetoquinol
U-100 Insulin Syringe	Becton Dickinson and Company	329461
Balance	Ohaus	CS 200
Buprenorphine			Controlled substance
Tropicamide ophthalmic solution	Alcon	0998-0355-15	1% Mydriacyl
Manual Microsyringe Pump with Digital Display	World Precision Instruments	DMP
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Platform	Fisher Scientific	14-673-52	8 x 8 inch
Absorbent swabs	Kettenbach	30601
P20 Micropipet	Gilson	F123600
Plastic forcep	Euroband	1001	Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye
Fluoroquinolone ophthalmic solution	Alcon		Vigamox
Heating pad	Sunbeam	E12107-834
Tonometer	iCare	TV02	TONOLAB rebound tonometer
Paraformaldehyde, Para	Fisher Scientific	T353-500
Dissection tools
Small brush
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G7651
Sodium Cacodylate, tryhydrate	Canemco and Marivec	124-65-2
Brn-3a antibody (C-20)	Santa Cruz Biotechnology	sc-31984
Tissue Culture Plate, 48 well	Falcon	353078
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Life Technologies	A-11058
Aluminum foil
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Slow fade Gold antifade reagent	Life Technologies	S36936
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5E
Osmium tetroxide 2% aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	3294949
Embed-812	Electron Microscopy Sciences	14900
Dodecenyl succinic anhydride	Electron Microscopy Sciences	13710
Nadic methyl anhydride	Electron Microscopy Sciences	19000
DMP-30	Electron Microscopy Sciences	13600
Propylene oxide	Sigma-Aldrich	110205-1L
Embedding mold-Dykstra	Electron Microscopy Sciences	70907
Porter-Blum ultra-microtome	Sorvall	MT-2
Toluidine blue O (Certified Biological Stain)	Fisher-Scientific	T161-25