Анализ белка импорта в хлоропласты, выделенных из растений стрессовых

Резюме

Здесь мы опишем новый метод изучения импорта белков в изолированных хлоропластах под напряжением. Метод является быстрым и простым, и может быть применен для изучения последствий различных стрессовых условиях для импорта хлоропласта белка, и соответствующие регулирующие механизмы.

Аннотация

Хлоропласты органеллы со многими жизненно важную роль в растениях, которые включают в себя не только функции сигнализации фотосинтез, но многочисленные другие метаболические и. Кроме того, хлоропласты имеют решающее значение для растений реакции на различные абиотических стрессов, таких как соленость и осмотического стрессов. Хлоропласта может содержать до ~ 3000 различных белков, некоторые из которых закодированы своим собственным геном. Тем не менее, большинство белков хлоропласта кодируются в ядре и синтезируются в цитоплазме, и эти белки должны быть импортированы в хлоропласт через translocons на хлоропластов конвертом мембран. Недавние исследования показали, что хлоропласт импорта белок может быть активно регулируется напряжением. Для того, чтобы биохимически исследовать такое регулирование импорта белков в условиях стресса, мы разработали метод, описанный здесь, как быстрый и простой процедуры, которая может быть легко достигнуто в любой лаборатории. В этом способе растения выращивают при нормальном Conditioнс, а затем облучают к стрессовым условиям в жидкой культуре. Растительный материал собирают, и хлоропласты затем выпустили гомогенизацией. Сырой гомогенат отделяют центрифугированием в градиенте плотности, что позволяет изоляцию интактные хлоропласты. Хлоропластов выход оценивают с помощью подсчета, и хлоропласт нетронутость проверяется под микроскопом. Для импортных анализов белка, очищенные хлоропласты инкубируют с ³⁵ S меченый в пробирке в переводе белков - предшественников, а также эксперименты по времени курса проводятся для того, чтобы сравнение темпов импорта между генотипами в условиях стресса. Мы представляем данные, полученные с помощью этого метода, которые показывают, что скорость импорта белков в хлоропласты из регуляторного мутанта специально переделан под осмотических условиях стресса.

Введение

Хлоропласты являются весьма обильные органеллы, которые существуют в зеленых тканях растений. Они хорошо известны за их решающую роль в процессе фотосинтеза, процесс , который использует энергию света для преобразования двуокиси углерода в сахар и , таким образом , поддерживают почти всю жизнь на Земле ^1. Кроме того, хлоропласты (и более широкое семейство родственных органелл, называемых пластиды) играют многие другие жизненно важные функции в растениях, в том числе биосинтезе аминокислоты, липиды, пигменты, и зондировании экологических сигналов, таких как силы тяжести и возбудителем вызов. Фотосинтез генерирует активные формы кислорода (ROS) в качестве побочных продуктов, которые при определенных обстоятельствах имеют полезную роль, но если избыточном может вызвать повреждение или даже летальные последствия. Перепроизводство ROS особенно способствует неблагоприятным условиям окружающей среды, и , таким образом , хлоропласты тесно связаны с ответами на абиотических стрессов, таких как соленость и осмотического напряжений ^2.

Chloroplasts имеют сложную структуру. Каждый хлоропласт окружен двойной мембраной наружного слоя называется оболочка, которая состоит из наружной и внутренней оболочек. Внутри есть другая мембранная система называется тилакоидов, где световые реакции фотосинтеза происходят. Между двумя мембранных систем имеется водный отсек вызова стромы, которая участвует в фиксации углерода. Хлоропластов может содержать до ~ 3000 различных белков, и подавляющее большинство из этих белков синтезируются в цитоплазме в форме предшественника и должны быть импортированы в органеллы через специализированные белковые translocons в оболочке мембран ^1. Интересно, что недавние исследования показали, что импорт хлоропласта белок активно регулируется, и поэтому способен оказывать существенное уровень контроля над хлоропласта протеома. Например, сообщалось, что в 2015 году импорт белок может реагировать на абиотическим стрессам путем прямого регулирования обилия йе транслокон на внешней мембране оболочки хлоропластов (TOC) по системе убиквитин-протеосомного ^3.

Использование очищенных хлоропласты и в пробирке синтезирован белков - предшественников, импорт белок может быть восстановлен в пробирке ^4,5. Таким образом, методы в пробирке могут быть использованы для оценки темпов импорта в различных мутантных растений ^6, который был критический подход для анализа предполагаемых компонентов импорта машин белка и для выявления механизмов , лежащих в основе импорта белка и его регуляции. Кроме того, хлоропласты могут быть обработаны с последующим фракционированием или протеазы пищеварения, после импорта в пробирке, которая может облегчить исследования по суб-органоидного локализации и топологии хлоропластов белков ^7,8.

Для изучения регуляции импорта белков стресса, мы изменили нашу рутинную метод изоляции хлоропласт, как мы будем описыватьВот. Важно отметить, что хлоропласты были выделены из растений, которые были выращены на стандартном Мурашига и Скуга (MS) агаровой среды в течение 8 дней, а затем переносили в жидкую среду MS с добавлением стрессора, обеспечивая относительно коротким, контролируемое лечение стресса. Выход и компетентность хлоропластов , выделенных из таких напряжений обработанных растений совместимы с вниз по течению в анализе импорта пробирке белка ^3. В дополнение к протоколу хлоропластов изоляции, мы представляем нашу рутинную метод экстракорпорального импорта белков, который доказал , чтобы быть надежным и широко используется ^3,9-12.

протокол

1. Рост растений Arabidopsis и лечение Стресс

1. Готовят 1 л Мурашига и Скуга (MS) среде с добавлением 4,3 г МС Базальная смесь солей, 10 г сахарозы, 0,5 г 2- (N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) к деионизированной воде до 1 л, и регулировать рН до 5,7 с помощью гидроксида калия (КОН). Добавить 6 г phytoagar и автоклаве в течение 20 мин при 120 ° С.
   1. Перед застывания, залить среду в круглых пластин Петри (диаметром 9 см, высота 1,5 см, с 20 - 25 мл MS среды на пластину). Разрешить пластины высохнуть в течение ~ 1 ч в ламинарном потоке перед закрытием крышки.
2. Поместите семена Резуховидка Таля в 1,5 мл пробирку для стерилизации поверхности путем добавления 1 мл 70% (об / об) этанола , содержащего 0,02% (об / об) Тритон Х-100 и непрерывно встряхивания в течение 5-10 мин. Для каждого генотипа / состояния, подготовить 10 чашек Петри, несущие каждый ~ 100 - 150 саженцев.
3. Подождите около 10 секунд, пока семена не оседают наНижняя часть трубки, а затем отбросить супернатант с помощью пипетки. Добавить 1 мл 100% этанола, и трясти трубку снова в течение 10 мин.
4. Приготовьте ламинаре в то время как семена стерилизовать. Возьмите один кусочек фильтровальной бумаги в образце, сложите его пополам, чтобы облегчить сев, и окуните его в 100% этаноле в капюшоне. Подождите, пока он высохнет полностью. Следует отметить, что 100% -ный этанол используется как она испаряется быстрее, чем 70% этанола.
5. Перенести семена на фильтровальную бумагу с помощью пипетки с использованием 1 мл пипетки порезу ~ 5 мм от тонкого конца. Дайте им высохнуть, которая должна занять около 10 - 15 мин.
6. Высевают ~ 100 - 150 стерилизованные семена равномерно на каждой пластине MS среднего Петри, и запечатать каждую тарелку с хирургической лентой.
7. Храните пластины с ног на голову при 4 ° С в течение 2 - 4 г, чтобы поощрять и синхронизировать всхожесть. Старые семена, возможно, придется остаться дольше (до недели) при 4 ° С.
8. Перенесите пластины к культуральной камеры растительной ткани и оставить их с ног до.Выращивать растения на 8 дней при длиннодневной цикла (16 ч 100 мкмоль · м ^{- 2} · с ^{- 1} света, 8 ч темно) при температуре 20 ° С.
9. Для лечения стресса, когда растения 8 г старый, в ламинарном проточном, перенесите их из агаровой среды, осторожно очищая их вручную носить этанол стерилизованные перчатки, в стерилизованную колбу жидкой среды MS , содержащей стрессора (например , , 200 мМ маннита). Избегайте переноса агаровой среды. Накройте колбу рот стерилизованной фольгой и позволить растениям расти при тех же самых условиях, что и в пункте 1.8 в течение еще 2 г на орбитальном шейкере при осторожном встряхивании (~ 100 оборотов в минуту).

2. Создание белка - предшественника с помощью In Vitro Транскрипция / Перевод

Примечание: Этот протокол предполагает использование Arabidopsis фотосистемы I субъединица D предшественника (pPsaD) в качестве шаблона / пребелок, но метод совместим с другими.

1. Клонирование последовательности , кодирующей (ЦДС) pPsaD в сайт множественного клонирования (MCS) вектора pBlueScript II SK (или любого другого аналогичного вектора с вверх по течению промотора Т7) ^13. Очищают плазмиду (pBSK-pPsaD) с использованием набора для выделения ДНК и проверить последовательность путем секвенирования ДНК.
   Примечание: Все эти шаги используют стандартные методы молекулярного клонирования.
2. Определить концентрацию плазмидной ДНК pBSK-pPsaD, используя спектрофотометр набор для измерения оптической плотности при длине волны 260 нм. Развести плазмиды до конечной концентрации 10 нг / мкл.
3. Выполнить 20 мкл ПЦР (для 35 циклов) с использованием разбавленного плазмиды в качестве матрицы. Готовят реакцию следующим образом: 2 мкл 10 × буфера полимеразы, 2 мкл 2 мМ дНТФ, 1 мкл 5 мМ М13 прямого праймера (5'-TGT AAA ACG ACG НКУ АГТ-3 '), 1 мкл 5 мМ М13 обратного праймера (5 '-CAG GAA АСА GCT ATG ACC-3'), 1 мкл разведенного pBSK-pPsaD плазмиды, 1 U Taq-полимеразы и дистиллированную воду до общего объема реакционной смеси до20 мкл. С помощью стандартной программы ПЦР, следующим образом: 95 ° С, 5 мин; 35 циклов [95 ° C, 30 сек; 56 ° С, 30 сек; 72 ° С, 30 сек); и 72 ° С, 5 мин.
4. Выполните 5 мкл ПЦР-продукта на 1% (вес / объем) гель агарозы в ТАЕ буфере (Трис-HCl, рН 7,6, 20 мМ уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА), чтобы проверить правильность амплификации кДНК, и количественно соответствующая группа относительно стандартов подтверждения концентрации. Хранить остальную часть продукта при температуре -20 ° С для дальнейшего применения.
5. Готовят 50 мкл реакционной помощью бесклеточной транскрипции / системы на основе лизата ретикулоцитов кролика перевода , совместимого с ПЦР - ДНК, следующим образом : 40 мкл лизата ретикулоцитов из системы транскрипции / трансляции, 2,5 мкл меченного радиоактивным изотопом ^[35 S] метионином, 11 мКи / мл (удельная активность:> 1000 Ки / ммоль), 2,5 мкл стерильной дистиллированной воды и 5 мкл продукта ПЦР pPsaD (100 - 800 нг).
   Внимание: Надевайте перчатки, лабораторную одежду и Glas безопасностиSES при обращении с радиоактивными материалами. Монитор и обеззараживают рабочую поверхность и оборудование. Утилизация всех радиоактивных отходов в утвержденный контейнер для отходов.
6. Инкубируйте реакции в течение 90 мин в C водяной бане 30 °. Остановить реакцию размещения образца на льду.
7. Удалить 1 мкл реакционной смеси в качестве опытного образца (такой же объем, может также служить в качестве элемента управления вводом на шаге 5.7) для проверки на стандартном электрофорезе в полиакриламидном геле в сульфат натрия додецилсульфата (SDS-PAGE) с последующим авторадиографии флюорографии или визуализации люминофора. Хороший результат свидетельствует о наблюдении отчетливой и сильной полосы, соответствующей молекулярной массе pPsaD (~ 23 кДа). Хранить остальную часть реакционной смеси при -80 ° С для дальнейшего применения.

3. Хлоропластов Изоляция

1. Подготовьте следующие растворы:
   1. Подготовка хлоропласт Изоляция буфера (CIB, 2x): 0,6 М сорбитол, 10 мМ хлорида магния(MgCl _2), 10 мМ Этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EGTA), 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 20 мМ бикарбоната натрия (NaHCO _3), 40 мМ 4- (2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES) ; доведения рН до 8,0 с помощью КОН. Подготовка 2 л 2x CIB, делают аликвоты и хранить их при температуре -20 ° С в течение длительного хранения, или при температуре 4 ° С для кратковременного хранения. Для того, чтобы 1x CIB, разбавить 2x CIB 1: 1 с дистиллированной водой; он может быть получен только что в день эксперимента в хлоропласт изоляции.
   2. Подготовка HEPES-MgSO ₄ -Sorbitol буфер (HMS, 1x): 50 мМ HEPES, 3 мМ сульфата магния (MgSO _4), 0,3 М сорбитол; доведения рН до 8,0 с помощью гидроксида натрия (NaOH). Приготовьте 400 мл буфера, делают аликвоты и хранить их при температуре -20 ° С в течение длительного хранения, или при температуре 4 ° С для кратковременного хранения.
2. Проведение всех следующих процедур в холодном помещении или на льду. Предварительного охлаждения всех решений, устройств, оборудования и роторов перед тем стarting.
3. Готовят непрерывный градиент плотности путем смешивания 13 мл перколлом, 13 мл 2x CIB буфера, и 5 мг глутатиона в 50 мл центрифужную пробирку и центрифугировали смесь при 43000 х г в течение 30 мин (от тормоза) при 4 ° С. После центрифугирования обрабатывать трубку с осторожностью, чтобы не беспокоить градиент и держать его на льду для последующего использования.
4. Перенести 100 мл 1x CIB на генотип / состояние до 1 л лабораторный стакан.
   1. Удалите рассаду из жидкой среды, наклонив их в сито, и передавать их в другой CIB содержащие химический стакан; Затем промойте ткань с CIB, чтобы удалить остатки жидкой среды перед его заменой 100 мл свежего CIB.
5. Для гомогенизации, используют в общей сложности 100 мл 1x CIB на пробу в течение пяти последовательных циклов гомогенизации, каждый раунд с использованием 20 мл свежего CIB удерживается в стакане 50 мл.
   1. Для первого этапа гомогенизации, перенесите ткани растения в стакан 50 мл вручную, позволяяпредыдущий буфер холдинг стечь сквозь пальцы. Попробуйте использовать большую часть ткани в первом раунде, но убедитесь, что он погружен в буфер; если это не представляется возможным, ввести оставшиеся неиспользованные ткани во втором туре.
6. Поместите зонд гомогенизатора тканей в ткани и гомогенизируют с двумя импульсами 1 - 2 с каждый. Фильтр гомогената через два слоя фильтровальной ткани в 250 мл центрифужную пробирку, осторожно сдавливании. Сохраняют фильтрат, и перенесите ткани обратно в химический стакан на 50 мл.
7. Поместите второй 20 мл CIB аликвоты в стакан 50 мл, добавляя оставшуюся ткань не используется в первом раунде гомогенизации и повторите гомогенизации и фильтрации шаги. Таким образом, повторите шаги 3.5 и 3.6 , пока все 100 мл CIB израсходован (т.е. 5 аликвоты по 20 мл) и объединить получившиеся фильтратов.
8. Центрифуга гомогената объединенных при 1000 × г в течение 5 мин (тормоза на) при 4 ° С, и слейтесупернатант сразу после завершения центрифугирования, следя за тем, чтобы не нарушить осадок. Ресуспендируют осадок в оставшемся супернатанте в барабане, осторожно перемешивая пробирку на льду. Не ресуспендируют энергично пипеткой или встряхиванием.
9. Аккуратно перенести гомогената на вершину Premade непрерывного градиента плотности, с помощью пипетки Пастера, чтобы применить его через стенку приемной трубки. Избегайте нарушая градиент. Центрифуга в бакет-роторе при 7800 х г в течение 10 мин (Brake отсекается) при температуре 4 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два зеленых полос можно увидеть в градиенте после центрифугирования: нижняя полоса содержит интактные хлоропласты, а верхняя полоса содержит сломанные хлоропласты.
10. Отбросить верхнюю полосу пипеткой, а затем передать нижнюю полосу с пипеткой Пастера в свежую 50 мл центрифужную пробирку, сохраняя объем до 8 мл на градиент.
11. Добавить ~ 25 мл 1x HMS буфера в трубку и инвертировать трубку дважды то мыть перколлом от хлоропластов. Поместите трубку снова в качающийся-роторе и центрифуге при 1000 х г в течение 5 мин (тормоза на) при 4 ° С.
12. Слейте супернатант и осторожно ресуспендируют осадок хлоропластов в остаточных HMS осталось в трубке, осторожно перемешивая трубку на льду. Добавить еще 100 - 300 мкл HMS при необходимости (в зависимости от размера гранул и подсчета в разделе 4), но не пытаться разбавлять образец слишком много.
    1. Держите хлоропластов на льду. Каждый раз перед хлоропласты используются для последующих применений, трясти трубку ресуспендирования их. Всегда используйте кончик пипетки вырезать (с увеличенной поры) для передачи хлоропластов.

4. Анализ урожайности и целость хлоропластов

1. Добавьте 5 мкл выделенных хлоропластах до 495 мкл 1х HMS буфера в 1,5 мл пробирку, а затем аккуратно перемешать с помощью переворачивания пробирки для получения разведение 1: 100.
2. Пласе покровного стекла поверх счетной камеры гемоцитометра. Медленно пипетку ~ 40 - 60 мкл разведенных хлоропласта суспензии в зазоре между покровным стеклом и счетную камеру. С помощью фазового контрастного микроскопа с объективом 10х или 20х, интактные хлоропласты осмотреться и яркие и окружены ореолом света.
   Примечание: Под микроскопом, существует счетная площадь 1 мм ² с 25 большими квадратами, каждый из которых содержит 16 маленьких квадратов в центре измерительной камеры.
3. Подсчитайте количество хлоропластов в 10 больших площадях. Число хлоропластов на большой площади должна составлять в среднем от 10 до 30. Если слишком мало или слишком много хлоропласты, отрегулируйте коэффициент разбавления (шаг 4.1 выше) соответственно, и повторите процедуру.
4. Подсчитайте число хлоропластов на мл (концентрации) следующим образом: N (среднее число хлоропластов на большой площади, вычисленной на этапе 4.3) × 25 (общее количество больших площадей) × 100 (коэффициент разбавления) × 10 ⁴ (коэффициент масштабирования , чтобы выразить данные на 1 мл, так как объем выше 25 квадратов составляет 0,1 мм ^3).
5. Вычислить фактический выход хлоропласты путем умножения концентрации на объем хлоропласта суспензии, полученной на стадии 3.12. Как правило, более чем в 50 × 10 ⁶ хлоропласты могут быть получены.

5. Хлоропластов белка Импорт

1. Подготовьте следующие растворы:
   1. Подготовка 10x HMS буфер: 500 мМ HEPES, 30 мМ MgSO ₄ и 3,0 М сорбитол; доведения рН до 8,0 с помощью NaOH. Приготовьте 50 мл этого буфера, аликвоты и хранят при -20 ° С в течение длительного хранения и при температуре 4 ° С для кратковременного хранения.
   2. Подготовка Импорт стоп-буфер: 50 мМ ЭДТА, растворенного в буфере 1x HMS. Приготовьте 50 мл этого буфера, аликвоты и хранят при -20 ° С.
   3. Готовят 2x Протеин загрузочного буфера: 60 ​​мМ Трис-HCl, рН 6,8, 10% (об / об) глицерина, 2% (мас/ Об) ДСН, 0,005% (вес / объем) бромофенолового голубого цвета. Сделайте 50 мл и хранят при температуре 4 ° С. Непосредственно перед использованием добавляют 100 мкл 1 М 1,4-дитиотреитола (DTT) в 900 мкл буфера.
2. Для запуска тайм-курс с 3 временных точках, подготовить 3 пробирки каждая из которых содержит 130 мкл аликвоты импорта стоп-буфера, и оставить их на льду. Приготовьте реакции импортировать 450 мкл в 2 мл трубки (на генотип / состояние). Разморозить все ингредиенты непосредственно перед использованием.
   1. Для одной реакции импорта, как правило , используют 10 × 10 ⁶ хлоропласты в объеме мкл; Например, если концентрация хлоропласт составляет 2,5 × 10 ⁸ / мл, используют 40 мкл хлоропласт подвески. Три временных точках потребуется 3 × A мкл (т.е. 120 мкл в нашем примере).
   2. Смешать компоненты реакции на льду в следующем порядке: дистиллированная вода (чтобы получить общий объем 600 мкл), B мкл 10х буфера ГМС (где В = [600-3 × A] / 10, то есть 48 в нашем примере), 12 мкл1 М глюконовой кислоты (калиевую соль), 6 мкл 1 М раствором NaHCO _3, 6 мкл 20% (вес / объем) БСА, 30 мкл 100 мМ аденозин - 5'-трифосфат магниевую соль (MgATP), 24 мкл 250 мМ метионин (не радиоактивно ), и 30 мкл белка предшественника. Непосредственно перед началом реакции импорта, добавьте 3 × A мкл хлоропластов и перемешать, осторожно коснувшись трубку.
3. Инкубируйте реакционную трубку при 25 ° С в водяной бане при 100 мкмоль · м ^{- 2} · с ^{- 1} света. Время от времени Флик трубки для ресуспендирования хлоропласты.
4. Для того, чтобы провести время курса, изъять 130 мкл аликвоты из реакционной смеси в требуемых временных точках в пределах линейного диапазона импорта, который для pPsaD составляет до ~ 12 мин (4-, 8- и 12-минутных временных точек подходят в этом случае). Период линейный диапазон может варьироваться для разных белков ^14. Таким образом, предлагается, чтобы проверить каждый отдельный препротеина до того, чтобы оптимизировать Tон моменты времени.
5. Сразу же после снятия, передачи каждый 130 мкл аликвоты в пробирку охлажденного льдом импорта стоп-буфера, перемешать, осторожно коснувшись трубку, и сохранить все трубы на льду, пока время курс не был завершен.
6. Центрифуга все образцы в течение 30 с при 12000 & bull; g в микроцентрифуге, отбрасывать супернатанты пипеткой, и ресуспендируют гранул в 15 мкл 2Х белка загрузочного буфера путем встряхивания.
7. Анализ всех образцов плюс входной контроль pPsaD (содержащий pPsaD эквивалентно 10% от количества , добавляемого в каждой реакции импорта, начиная с шага 2.7) с помощью стандартных SDS-PAGE и авторадиографии, флюорографии или фосфористой изображений ^15. С помощью программного обеспечения для анализа изображений для количественного определения и анализа результатов. Для того, чтобы обеспечить индикацию эффективности импорта, количество импортного белка в различных генотипах / условия могут быть оценены путем измерения радиоактивности, связанной с каждой зрелой группы.

Результаты

Пример хлоропласт белка импорта эксперимент с 3 -х временных точках показан на рисунке 1. ППСА является компонентом ~ 18 кДа фотосистемы я подвергается стромы, с формой предшественника ~ 23 кДа ^16. ППСА был выбран здесь для анализа импорта белка в пробирке , поскольку ее равновесные уровни повышены в sp1 мутанта, по отношению к WT, в стрессовых условиях, что предполагает изменение его эффективности импорта в мутанта ^3. Sp1 мутанта несет дефект в качестве важного регулятора хлоропластов импорта белка техника - SP1 белка ^3. Для получения хлоропластов , выделенных из растений , выращенных в нормальных условиях, не было никакой очевидной разницы в импорте ППСА между sp1 и WT (данные не показаны) ^3. Тем не менее, используя методы, описанные здесь, для оценки ППСА импорта в хлоропласты, изолированные из осмотическинапряженных растений, была обнаружена четкая разница. В то время как мы наблюдали накопление зрелой формы белка в зависимости от времени с обоих генотипов, уровень импорта был значительно ниже для WT хлоропластов , чем для sp1 хлоропластов (рисунок 1), что согласуется с нашими предыдущими результатами ³ -х , и показывает важная роль белка SP1 в регулировании импорта хлоропластов из ППСА в условиях стресса.

Рисунок 1. Белок Импорт Анализ проводили с использованием хлоропластов , выделенных из растений , выращенных под осмотический стресс условиях. Хлоропласты были изолированы от 10-дневной WT (Col-0) и sp1 мутанта Arabidopsis растений , выращенных в стрессовых условиях (200 мМ маннита) в течение 2 дней. Импорта (А) белка проводили с использованием ^[35 S] -methionine меченных pPsaD и протекала в течение 4, 8 и 12 мин перед проведением анализа с помощью SDS-PAGE и визуализации люминофора. Параллельно pPsaD 10% входной контроль , включающий в пробирке транслируемого белка (ИВТ) был проанализирован. Предшественник (предварительно) и зрелый (мат) формы pPsaD указаны, в то время как между ними есть две полосы, которые, вероятно, соответствуют усеченных или proteolyzed продуктов трансляции, потому что их интенсивность не изменилась за время курса (*). (B) Для сравнения цены импорта в хлоропласты из WT и sp1 растений , выращенных в условиях стресса, интенсивность каждой полосы , соответствующей импортированной зрелого белка в количественно. Все данные выражены в процентах от количества импортируемого белка в хлоропластах из WT растений после 12 мин. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Недавно мы показали , что хлоропласт импорта белок может быть активно регулируется напряжением, что имеет решающее значение для функции хлоропласта и растений выживания ^3. В этом исследовании, чтобы контролировать такое регулирование, мы изменили нашу хлоропластов изоляцию и экстракорпоральное процедур импорта анализа , с тем чтобы оценка потенциала импорта растений , выращенных в условиях стресса. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли SP1 в хлоропласт регулировании импорта белков.

Обычные в пробирке импорта анализы используют растения , выращенные на стандартной агаровой среде MS ^6,17,18. В случае sp1 мутанта , описанного здесь, такие обычные анализы не выявили каких - либо различий в белковом импорта по отношению к WT ^3. Тем не менее, роль SP1 в регулировании импорта белков отчетливо обнаруживается при импорте белка оценивается в стрессовых условиях с использованием методов , описанных в данном документе (рисунок 1). В то время как мAY не быть возможным непосредственно сравнивать импорт данных из стрессовых условиях анализа с результатами, полученными от обычных анализов (как методы используются растения, выращенные в жидкой культуре и на агаризованной среде, соответственно), сравнение между стрессом и не стрессовых условиях возможны при условии, что растения были выращены в той же жидкой культуральной среде, с добавлением или без стресса.

По сравнению с лечением стресса на агаризованной среде, жидкая культура является более удобным для обработки большого числа растений , необходимых для импортных анализов в лабораторных условиях . Кроме того, она способствует единообразному применению стрессора всех растений, что особенно важно для краткосрочного лечения стресса. Изложенный здесь метод был применен для изучения осмотического стресса с помощью лечения маннит, но может быть легко адаптирован к широкому диапазону других напряжений; например, кратковременного солевого стресса и окислительного стресса, для которых соответствующие стрессовые факторы могли бе так же применяется с помощью жидкой среды MS. Для других типов напряжений, мы предлагаем степень стресса сначала оптимизированы; чрезмерно суровые методы лечения могут оказывать неблагоприятное воздействие на урожайность и / или импорта компетенции изолированных органелл.

Есть несколько важных шагов в рамках протокола, к которому следует обратить особое внимание, как подробно описано ниже.

Оптимальная концентрация агара для среды MS может отличаться (0,6 - 0,9%, вес / объем) в зависимости от производителя. Таким образом, рекомендуется опытным путем оптимизации концентрации агара до начала экспериментов. Среда не должна быть настолько мягким, что он прилипает к ткани на стадии уборки урожая (шаг 1.9), ни он не должен быть настолько жестким, что он тормозит развитие корневой системы растений. Концентрация сахарозы также может быть скорректирована в соответствии с растений, используемых. При работе с особенно больных мутантов, MS среде, дополненной 2 - 3% (вес / объем) сахарозы, может помочь растениям расти лучше. Когда приложениележа стресс лечения, это не хорошо , чтобы передать очень старые растения в жидкой среде (например,> 14 дней). Это происходит потому, что более развитые корни взрослых растений более легко повреждены во время перенесении.

Что касается системы транскрипции / трансляции, есть 2 основные системы: те, которые основаны на ростках пшеницы, и те, которые основаны на ретикулоцитов кролика. Эти наборы могут использовать различные шаблоны, такие как линеаризованных плазмид, unlinearized плазмид или ПЦР-продуктов. Наборы также специфичны для T3, T7 и SP6 промоутеров. Обратите внимание, что мы рекомендуем комплект здесь подходит для использования только с PCR продуктами и Т7 промотора. Тем не менее, по неизвестным причинам, некоторые радиоактивно меченные препротеинов, сделанные с помощью этой системы могут не работать эффективно в анализе импорта; в таких случаях, можно рассмотреть попытку системы экстракт зародышей пшеницы или систему лизата ретикулоцитов, предназначенную для плазмиды шаблонов. Можно также улучшить результат транскрипции / трансляции повторнодействие путем изменения условий реакции в соответствии с руководства производителя.

Важно, чтобы начать хлоропласт изоляцию рано утром (или в начале светового цикла камеры роста), для того, чтобы избежать накопления крахмала в хлоропластах из-фотосинтезу, которые могут препятствовать изолированности интактных органелл. Процедура изоляции хлоропласта должно быть сделано быстро, без каких-либо ненужных задержек, а также выделенные хлоропласты всегда должны держать в холоде. Это должно смягчить против наблюдения, что изолированные хлоропласты постепенно теряют свою жизнеспособность, что не есть хорошо. При использовании вновь талой CIB или буфер HMS, обязательно смешать буфер перед использованием для получения однородного раствора. Оптимальные условия для гомогенизации растительного материала были установлены эмпирически, и может изменяться, если используется другая гомогенизатора тканей.

Если различные генотипы растений содержат similaУровни хлорофилл г, хлорофилл Количественное может быть использован в качестве альтернативного способа, чтобы нормализовать образцы перед проведением импортных анализов. Хлорофилл может быть определен спектрофотометрически после экстракции образца из изолированных хлоропластах в 80% (об / об) водного ацетона ^19,20. Тем не менее, если ставки на импорт растений с различным содержанием хлорофилла (например, мутанты с хлорозных фенотипов) следует сравнивать, использовать хлоропластов число подсчета , чтобы нормализовать образцы хлоропластов в импортных анализах. Особенно важно, чтобы ресуспендирования хлоропласты тщательно в шаге 3.11. Недостаточная ресуспендирования могут оставить агрегаты хлоропластов, которые сделают его трудно подсчитать количество точно и, таким образом, будет препятствовать правильной загрузке в импортных реакций. Если тяжелая агрегация рассматривается под микроскопом (например, агрегаты с> 10 хлоропласта соединены вместе), продолжают встряхивания образец хлоропластов на льду до AGGREGATэс удалены. Легче ресуспендирования хлоропласты в меньшем объеме буфера.

Важно иметь в виду, что импорт белка реакции (Раздел 5) должны быть проведены с соответствующими мерами предосторожности из-за их радиоактивного характера. Необходимые меры предосторожности включают: носить одноразовые перчатки, лабораторную одежду и защитные очки, мониторинг и обеззараживании рабочую поверхность и оборудование, а также утилизации всех радиоактивных отходов в утвержденный контейнер для отходов. Также имейте в виду, что правильное осмотическое давление имеет решающее значение для поддержания исправности хлоропластов во время импорта реакций, и это в основном поддерживается буфером HMS. Поскольку 10x HMS вязкий, он сначала должен быть разогрет до комнатной температуры, а затем тщательно перемешивают и наносят с помощью пипетки вырезать, чтобы обеспечить измерение точных объемов. В реакции импорта, холодный метионин добавляется для ингибирования включения свободного радиоактивно меченого метионина в несвязанной chloroplAST белки через органоидного перевод на стадии инкубации, в то время как БСА используется для минимизации протеолиза, действуя в качестве субстрата для протеаз.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige and Skoog basal salt	Melford	M0221
phytoagar	Melford	P1003
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)	Melford	B2002
triton X-100	Fisher	BPE151-500
surgical tape (e.g., Micropore, 3M)	3M	1530-1
filter paper	Fisher	FB59023
Percoll	Fisher	10607095
ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E4378
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher	D/0700/53
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Melford	B2001
filtration cloth (Miracloth)	Calbiochem	475855
50 mL centrifuge tube	Fisher	CFT-595-040M
250 mL centrifuge bottle	Fisher	CFT-891-V
Polytron (e.g., Kinematica PT10-35)	Fisher	11010070
Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S)	Fisher	11030083
centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes)	Beckman Coulter	B34182
fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250)	Beckman Coulter	363930
fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50)	Beckman Coulter	363058
swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1)	Beckman Coulter	346963
radiolabeled [35S] methionine	Perkin Elmer	NEG072002MC
rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA)	Promega	L5540
phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i)	Nikon	unavailable
haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber)	Hawksley Technology	AC1000	0.1 mm depth, 1/400 mm2
cover glasses	VWR	16004-094	22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72.690.001
2 mL microfuge tubes	Starlab	S1620-2700
microfuge (e.g., Eppendorf 5415D)	Eppendorf	unavailable
Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar	Thermo Fisher	SPR-700-310L
gluconic acid (potassium salt)	Fisher	22932-2500
bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
MgATP	Sigma	A9187
methionine	Sigma	M6039
bromophenol blue	Fisher	B/P620/44
glycerol	Fisher	G/0650/17
SDS	Fisher	S/5200/53
Tris Base	Melford	B2005
dithiothreitol (DTT)	Melford	MB1015
image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer)	Raytest	unavailable