Использование<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Обработки изображений цельнозерновой органов и тканей Количественные гистологии, чтобы определить, био-распределение флуоресцентно меченых молекул

Резюме

Ex естественных изображений целого органа является быстрый метод для определения относительных концентраций флуоресцентно меченых соединений внутри и между тканями или группами лечения. С другой стороны, количественная флуоресцентная гистологии, в то время как более трудоемок, позволяет для количественного определения абсолютных уровней тканевых меченых молекул.

Аннотация

Флуоресцентная маркировка представляет собой хорошо установленный процесс для изучения судьбы меченых молекул при различных экспериментальных условиях в пробирке и в естественных условиях. Флуоресцентные зонды особенно полезны при определении био распределение вводимых крупных молекул, где добавление метки флуоресцентного малой молекулы вряд ли повлияет на кинетику или биологическое распределение соединения. Различные методы существуют для изучения био-распределения, которые существенно различаются по объему требуемых усилий, и являются ли полученные результаты измерений полностью количественный, но с использованием нескольких методов в сочетании могут обеспечить быструю и эффективную систему для анализа био-распределения.

Экс естественных изображений целого органа является методом , который может быть использован , чтобы быстро сравнить относительные концентрации флуоресцентных молекул в тканях , так и между различными типами тканей или групп лечения. Использование Plat изображенийФорма предназначена для живого животного или изображения целого органа, флуоресценция в пределах здоровых тканей может быть определена без дальнейшей обработки, экономии времени и труда, обеспечивая точную картину общего биологического распределения. Этот процесс является идеальным в экспериментах, пытающимися определить тканевую специфичность соединения или для сравнения нескольких различных соединений. Количественный гистологию ткань с другой стороны, требует обширной дальнейшей обработки тканей, с тем чтобы создать количественную меру меченых соединений. Для того, чтобы точно оценить биологическое распределение, все ткани интерес должен быть нарезан, отсканированы и проанализированы относительно стандартных кривых для того, чтобы проводить сравнения между тканями или группами. гистологии Количественный ткань является золотым стандартом для определения абсолютных концентраций составных в тканях.

Здесь мы описываем, как оба метода могут быть использованы вместе эффективно для оценки способности различных методов администрационныхе составные модификации целевой и доставить флуоресцентно меченных молекул в центральной нервной системе ^1.

Введение

Флуоресцентная маркировка легко используется и эффективный метод для определения био- распределения соединений, с использованием целого ряда оборудования, которое является общим для многих лабораторий. Флуорофоры широко доступны, относительно недорог, и бывают различных длин волн, таким образом, что несколько меченых молекул могут быть использованы одновременно без помех. Большинство флуорофоры имеют диапазон химических составов для конъюгации с различными реакционноспособными группами целевых соединений, и процесс конъюгации, как правило, простой для большинства типов реакционноспособных участков. Кроме того, оборудование, необходимое для измерения флуоресцентно меченых соединений являются обычным явлением во многих лабораториях. Флуоресцентные микроскопы, тепловизоры, и слайд-сканеры могут быть использованы в различных условиях, что делает весьма доступным использование флуоресцентных меток. Флуоресцентные метки часто используются для определения био распределения и кинетика соединений как в естественных условиях и бывший ЛьвовскийO с живыми устройств обработки изображений, таких как IVIS Spectrum Imager, а гистологически количественного ткани ^2,3.

Использование бывших естественных изображений целого органа с использованием устройств визуализации живых увеличилось с течением времени из - за их простоты использования и возможность быстро создать точное сравнение относительных концентраций меченых соединений без необходимости дальнейшей обработки tissues4. Тем не менее, в то время как бывший естественных изображений целого органа может позволить легко проводить анализ и сравнение, он не создает количественную меру абсолютных концентрациях соединения в пределах ткани. Это происходит из-за световых эффектов рассеяния внутри интактных органов. Так как рассеяние света (и, в меньшей степени, абсорбция) варьируется в зависимости от размера и плотности ткани, изображения целого органа могут недооценивать уровни ткани в больших или плотных органов. Формулирование соответствующие стандарты для абсолютных измерений концентрации также трудно, потому что нужно имитировать толщинуи плотность каждого отдельного органа. С другой стороны, изображения целого органа является быстрый способ получения относительных уровней ткани агента, и он идеально подходит для сравнения относительной био-распределения, связанных с несколькими молекулами (например, в исследованиях лекарственных препаратов). Альтернативной стратегией является использование количественного флуоресцентного гистологию, технику , полученную из метода количественной авторадиографии, чтобы получить абсолютные уровни ткани тестируемого агента ^5,6. Вместо того, чтобы помещать весь животное или орган в воображая устройство, количественное гистологии ткани требует, чтобы каждая ткань быть нарезано, смонтированный на салазках, отсканированные и анализировали по отдельности. Стандарты тестируемого агента получают и нарезанные на той же толщины, что и образцы органов. Сокращая все органы и стандарты для той же толщины, вариативность из-за рассеяния света или поглощения устраняется, и интенсивность флуоресценции ткани может быть пригодным для стандартной кривой, чтобы определить абсолютную ОБОГАЩЕНИЯрацион. Хотя этот метод, когда сделано должным образом, количественный, но и трудоемкий и легко засланный. С учетом более сложный характер количественного гистологии и значительно более высокой стоимости рабочей силы, по сравнению с изображениями целого органа, становится целесообразно рассмотреть, где каждый процесс является наиболее практично использовать при рассмотрении био распределение флуоресцентно меченых соединений. Этот протокол содержит подробное описание того, как эти методы могут быть использованы вместе, чтобы эффективно сравнивать биологическое распределение родамин-меченого Эластин-подобный полипептид (ELP), с добавлением или без добавления клеток проникающим пептидов SynB1 или Tat, используя как интраназально (IN) и внутривенные (IV) пути введения.

протокол

Примечание: Любое использование животных в этом протоколе был одобрен Institutional Animal Care и использование комитета Университета Миссисипи медицинского центра.

1. Лечение животных и тканей

1. Администрирование и Sacrifice
   1. Обезболить животных с использованием 3% изофлуран в течение 5 мин и проверить глубину анестезии, наблюдая отсутствие ног-пинча рефлекс. Нанесите мазь ветеринарная к глазам, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
   2. Взвешивание животных и пипеткой 50 мг / кг доза либо родамина-меченого ELP, SynB1-ELP или Tat-КПН в пробирку 1,5 мл. Сохранить 100 мкл вводимых меченых соединений для разработки стандартных кривых в последующих стадиях.
      Примечание: Важно, чтобы стандарты были сделаны из той же самой партии меченого белка, вводимого животным, с тем, чтобы избежать различий в связи с изменчивостью в люминесцентной эффективности маркировки. Для того чтобы правильно удалить фон fluoresценция из более поздних измерений флуоресценции, необработанная животное должно быть принесено в жертву, используя те же методы / реагенты, как у обработанных животных.
   3. Администрирование инъекции IV , как описано выше ¹ , используя либо хвостовую вену или бедренную вену (доступ к которой осуществляется через 1 см разрез в паховой области в). Для анальгезии, если сделать паха надрез, администрировать карпрофен подкожно в дозе 5 мг / кг, и применять sensorcaine на месте разреза до закрытия с зажимом раны. Для администрирования по маршруту интраназально (IN), поместите животное в положении лежа на спине.
   4. С помощью пипетки 2-мкл, составить 1-мкл каплю меченого соединения. Кратко скользят голову животного от анестезии воротник, чтобы обеспечить доступ к ноздрей.
   5. Поместите кончик пипетки на открытие одного Nare и медленно нажмите на поршень, позволяя капелька бежать вниз НАРЭ в носовой полости. Повторять каждые 1 мин, чередуя ноздрей каждую каплю до полной дозы не объявленияприслуживала.
      Примечание: Максимальный объем вводят через IN не должна превышать 10 - 15 мкл для мышей.
   6. Оставьте животных в положении лежа на спине под наркозом в течение 10 мин после последнего введения перед их перемещением каждого в отдельную клетку.
      Примечание: Не оставляйте животных без присмотра, пока они не восстановили достаточное сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее.
   7. 1 ч после введения, повторно анестезию животных , как и прежде , и принести их в жертву с помощью transcardial перфузии с помощью PBS (210,0 мг / л KH ₂ PO _4, 9,000.0 мг / л NaCl, 726 мг / л Na ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O) в 10 мл / мин в течение в общей сложности 20 мл.
      Примечание: перфузия животных в жертву, чтобы удалить всю кровь из тканей требуется для определения внесосудистое концентрации меченых соединений. Перфузионные реагенты могут привести к изменению фоновой флуоресценции и должны быть согласованы. Метод жертвы должны быть последовательнымивнутри групп. Различные методы жертвы могут привести к различным уровням крови в сосудистую систему, изменяя фоновой флуоресценции тканей.
2. Коллекция ТКАНЕЙ
   1. Готовят PBS, как описано выше для полоскания удаленных тканей.
      Примечание: Если другой буфер был использован в качестве перфузионной жидкости, полоскание тканей в том же самом буфере.
   2. Удалите сердце, легкие, желудок, печень, селезенку, почки и простым рассечение. Кратко промыть в PBS перед использованием лаборатории салфетки, чтобы погладить сухой или фитиль от избытка влаги и размещения ткани на циновку визуализации.
   3. Обезглавьте мыши и снимите верхнюю часть черепа с помощью костных резцы или кусачек. Использование щипцов, тщательно удалить мозг, сохраняя нетронутыми обонятельной луковицы. Промыть, сухой, и поместите его на поставленном мат формирования изображения.
   4. Для удаления спинного мозга через быстрого выброса ^7, заполнить 10-мл шприц с PBS и прикрепить притупляется 18 калибра иглы.
      Примечание: 18 калибра припадкивзрослого позвоночного канала многих линий мышей. Требуемый диаметр будет меняться в зависимости от размера животного.
   5. Поместите животное в лежачем положении, гарантируя, что открытие позвоночного канала на участке обезглавливание является чисто вырезать и без крови.
   6. Удалить кожу со всего позвоночника. Используя острые резцы кости или ножницы, прорезать позвоночника в поясничном отделе непосредственно ростральной к бедрам.
   7. Кратко промывать PBS для визуализации позвоночного канала. Осторожно вставьте иглу в позвоночный канал.
      Примечание: игла должна чувствовать себя уютно и может потребовать некоторого медленного прокатку назад и вперед во время введения. Если игла чувствовать себя свободно, более ростральной разрез может быть сделано или больший диаметр иглы может быть необходимо.
   8. Используя большой и указательный палец, оказать давление на позвоночный столб вокруг вставленной иглы. Выжмите поршень с умеренным и постоянным давлением. Спинной мозг извлечет нетронутыми из ростральной открытия в спинномколонка.
      Примечание: Полное удаление, полоскание и сушку всех основных органов может быть разумно завершена в 5 - 7 мин. Этот короткий промежуток времени предотвращает необходимость в длительном хранении в PBS, что может привести к чрезмерным воздействием света и выщелачивание меченых белков из ткани.

2. цельнозерновой орган Ex Vivo флуоресцентной томографии

1. Параметры обработки изображений
   1. Запустите программу захвата изображений. В правом нижнем углу панели управления приобретение, нажмите кнопку "инициализировать".
   2. Под "режиме съемки" выберите "флуоресцентный" флажок. Под "время экспозиции", выберите "AUTO".
   3. Под "биннинга" выберите "маленький" и установите F / Stop до 2.
   4. Выберите 535-нм возбуждение и фильтры излучения 580 нм.
      Примечание: Это будет варьироваться в зависимости от используемой метки.
   5. Выберите "Поле View B" и установите таргвысота т до 0,3 см.
      Примечание: Это будет варьироваться в зависимости от ткани, которые будут отображены.
   6. После того, как индикатор температуры становится зеленым (это означает, машина полностью инициализирован), поместить в ткани на черном фоне при условии мата, обеспечивая, что ткани полностью отделены друг от друга. Поместите коврик в томографа, гарантируя, что все ткани находятся в пределах сетки выбранной области. Более крупные и неоднородные ткани, такие как всей печени, должно быть организовано таким образом, чтобы уменьшить перекрытие лепестков.
      Примечание: Тканей могут быть организованы вместе в одной группе, что позволяет одному изображению для размещения одного животного или все ткани подобного типа. Это делает анализ и организацию проще в дальнейшем. Если большие различия в интенсивности флуоресценции присутствуют среди различных тканей, то лучше изображению их по отдельности или в виде группы одного и того же типа ткани, как единое время экспозиции не может быть идеальным для всех интенсивностях тканей.
   7. Нажмите кнопку "Приобретать."
   8. После того, как изображения, удалить ткани сразу и хранить или заморозить их для количественной гистологии, как описано в шаге 4.

3. Стандарты и обработка изображений

1. стандарты
   1. В PBS, создают двукратные серийные разведения каждого белка, используемого в лечении животных, начиная от исходной концентрации, в общей сложности 15 разведений.
      Примечание: Диапазон концентраций должны быть направлены включать концентрации ожидаемых ткани и может потребовать дополнительных разведений исходной пробы, в зависимости от исходной концентрации.
   2. Пипетка по 100 мкл каждого стандарта в каждую лунку черного 96-луночного планшета. Включите одну лунку чистого PBS, чтобы получить измерение фоновой флуоресценции.
   3. Изображение стандарты с теми же параметрами, используемыми для визуализации тканей.
   4. В программном обеспечении получения изображений "Панели инструментов" в разделе "ROI Сервис" выберите "область интереса (ROI) "Круг и привлечь ROI вокруг одной скважины. Понял ROI для всех остальных заполненных колодцев и нажмите кнопку "измерить трансформирования."
   5. Вычтите значение в среднем лучистой эффективности чистого PBS от значений других стандартов; это снимает фоновой флуоресценции. Участок значения против известной концентрации на график рассеяния.
      Примечание: Полученное уравнение линейной линии тренда, то можно использовать для расчета относительной величины флуоресценции.
2. Обработка изображения
   1. В программном обеспечении получения изображений, выберите инструмент ROI произвольной формы и рисовать трансформирования вокруг каждого из отдельных тканей. Нажмите кнопку "меру".
   2. С помощью полученных средних лучистых измерения эффективности, вычитать измеренные значения из необработанного животного для каждого типа ткани и построить эти значения на ранее созданной стандартной кривой.
      Примечание: Полученные относительные значения флуоресценции обеспечивают быстрый и точный снимок избиораспределение меченого соединения.

4. Количественный ткани гистологии

1. Подготовка и замораживании тканей для нарезки
   1. Создание или приобретение контейнеров достаточного размера, чтобы заморозить выбранные ткани и криостата, которые будут использоваться. Обертывание из алюминиевой фольги вокруг соответствующего размера и формы объекта работает хорошо.
   2. Приготовить смесь из изопропанола и сухого льда, заполняя половину химический стакан объемом 500 мл с сухим льдом и добавлением ~ 350 мл изопропанола таким образом, что имеется достаточное количество жидкости над сухим льдом, чтобы частично погрузить контейнер замерзания.
      Примечание: Жидкий азот часто приводит к перелому оптимальной температуры резания соединения (ОКТ), а также срезах тканей и его следует избегать.
   3. Заполните контейнер замораживания частично ОКТ, гарантируя, что нет пузырьков присутствуют. Если есть пузырьки, работают пузырьки из раствора с помощью пинцета или аналогичного реализовать.
   4. Удалите тканьот PBS и высушить его тщательно, либо аккуратно похлопывая его лаборатории салфетку или коснувшись края деликатных тканей в лаборатории вытереть и позволяя жидкости фитиль прочь.
   5. Поместите ткань мягко в ОКТ внутри морозильной контейнера, обеспечивая, чтобы не вводить пузырьков под ткани. После того, как ткань в месте, добавьте OCT, пока ткань не будет полностью покрыта.
   6. Погрузить контейнер морозильную столько, сколько возможно, не позволяя изопропиловый спирт, чтобы войти в контакт с открытой ОКТ внутри контейнера. Разрешить 30 - 90 с (или потенциально более для больших тканей) для развертывания Office и ткани, чтобы полностью заморозить перед хранением при -80 ° С до тех пор, по мере необходимости.
2. Подготовка стандартов для нарезания.
   1. Подготовка и соответствующим образом маркировать 1-мл одноразовые шприцы, путем удаления конца ствола, таким образом, что вся длина шприца один диаметр. Это позволит замороженный цилиндр выталкиваться позже.
   2. НасING октября, создать 15-ступенчатый двукратные серийные разведения вводимых соединений, как это было сделано с PBS ранее, но с конечным результатом объема 1 мл. Включите один образец чистого развертывания Office для удаления фоновых значений флуоресценции.
   3. Вязкость ОКТ делает трудным достаточное перемешивание. Обратить трубки и позволяют Октябре полностью стабилизируются, чтобы инвертировать снова. Повторите это 10 - 20 раз, чтобы обеспечить однородную смесь. Хранить стандартные растворы при температуре 4 ° С и в защищенном от света во время перемешивания.
   4. После перемешивания, снова приготовить смесь изопропанола и сухого льда, как и раньше.
      Примечание: Жидкий азот также может быть использован вместо смеси изопропанол / сухой лед смеси, при условии, что шприцы быстро удаляются после того, как они замерзла.
   5. Нарисуйте стандарт ОСТ в шприц, следя за тем, чтобы представить, как несколько пузырьков, как это возможно. После составления раствора ОКТ, немедленно опустите шприц непосредственно в изопропаноле и дайте раствору заморозить полностьювнутри шприца в течение 10 - 20 с. Хранить шприцы при температуре -80 ° С до тех пор, по мере необходимости.
3. Раскрой тканей и стандартов
   1. Поместите обе ткани и стандарты в -20 ° C и обеспечить достаточное время для всех образцов, чтобы прийти к температуре.
      Примечание: Идеальная температура резания в целом падает вокруг -10 ° C диапазон для большинства тканей, но в конечном счете, зависит от размера ткани и содержание жира и должны быть уточнены эмпирически.
   2. Использование криостат, разрезать ткани на ломтики толщиной 20 мкм и смонтировать их на предметные стекла, как описано выше ^8. Храните слайды при температуре -20 ° С и держать их подальше от света как можно больше во время резки и до сканирования.
      Примечание: Здесь важно, что участки должны быть измерены соответствующим образом распределены по всей толщине ткани.
   3. Чтобы установить стандарты на криостата патроне, возьмите шприц из холодильника и нагреться снаружи в течение 3 - 5 с помощью холдинь его в руке. Нажимать на поршень до тех пор, короткий участок (~ 1 см) цилиндра OCT находится вне шприца.
      1. Используя бритву, отрежьте через цилиндр и поместите часть баллона в результате перпендикулярно к поверхности зажимного патрона, используя ОКТ, чтобы удерживать его на месте. Эта конфигурация должна привести к четко определенные круги сокращаются.
   4. Нарезать цилиндры при 20 мкм, помещая одну часть от каждого разведения на один слайд, так что один слайд представляет всю стандартную кривую. Храните слайды при температуре -20 ° С до готовности для сканирования.
4. Сканирование и Количественный
   1. Запуск сканирования программного обеспечения массива и нажмите на кнопку "543" лазер, чтобы начать процедуру лазерного запуска. Подождите 15 минут для лазера, чтобы подготовиться.
   2. После того, как лазер готов, удалить слайды от -20 ° C и переместить их в большой, защищенном от света контейнере, чтобы прийти к температуре и высохнуть в течение 3 мин. Это позволит предотвратить накопление влаги в режиме SLIде-сканер.
   3. Загрузите слайд в слайд гнездо на панели сканера слайдов. Нажмите кнопку "сканирование" и выберите "запустить простое сканирование."
   4. Установите разрешение до 50 мкм сканирования.
   5. Выберите первый "Использовать" флажок в разделе "флуорофор" и выберите "TRITC." Установить PMT Gain до 80%.
      Примечание: Эти настройки будут изменяться в зависимости от флуорофора и концентрации меченых молекул.
   6. Со стороны левой руки, убедитесь, что область сканирования включает в себя весь слайд. Нажмите кнопку "Пуск".
   7. После сканирования, выберите "Файл" и "Сохранить как", а затем сохранить изображение как .tif.
      Примечание: Слайды тканей и стандартов должны быть отсканированы на тех же условиях.
   8. Загрузите полученные изображения в ImageJ и выберите трансформирования вокруг тканей и стандартов. На вкладке "Анализ", выберите "набор измерений" и выберите "означают значение серого". Нажмите220; мера ".
      Примечание: Как и в предыдущей методике, фон флуоресценции необходимо вычесть из всех измеренных значений.
   9. Участок средние измерения значение серого от стандартов против известной концентрации, чтобы создать стандартную кривую.
      Примечание: Полученные в результате измерений из тканей должны быть усреднены в пределах каждой ткани и нанесены на этой стандартной кривой, чтобы определить концентрацию в ткани.

Результаты

Приведенные ниже данные описывают доставку трех соединений: вектор доставки лекарственных средств , известный как ELP и две версии ELP модифицированной с сотовыми проникающие пептиды (SynB1-ELP и Tat-ELP) ^9. Все три соединения были помечены тетраметилродамин-5-малеимид и доставлены через дв...

Обсуждение

В то время как бывший естественных изображений целого органа , как правило , проста, приверженность некоторых основных понятий и методов может повысить точность измерений био-распределения. Короткие длины волн света опыта высокая степень рассеяния и поглощения в большинстве ткан...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)	Thermo Fisher	T6027, A20342	Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling
Phosphate Buffered Saline	Sigma	1002243569	PBS Buffer for rinsing
Optimal Cutting Temperature Compound	Tissue-Tek	4585	Used for freezing and mounting
Equipment
IVIS Spectrum	Perkin Elmer		For ex vivo whole organ imaging
Cryomicrotome	Thermo		For cryosectioning
Fluorescence slide scanner	Perkin Elmer		For slide scanning