L&#39;utilisation de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagerie entier orgue et histologie tissulaire quantitative du Bio-distribution des molécules marquées par fluorescence

Résumé

Imagerie ex vivo ensemble d'organes est un procédé rapide pour la détermination des concentrations relatives des composés marqués par fluorescence à l' intérieur et entre les tissus ou les groupes de traitement. A l'inverse, la fluorescence quantitative histologie, alors que plus de main-d'oeuvre, permet la quantification des taux tissulaires absolues des molécules marquées.

Résumé

Le marquage fluorescent est un processus bien établi pour examiner le sort des molécules marquées sous une variété de conditions expérimentales à la fois in vitro et in vivo. Les sondes fluorescentes sont particulièrement utiles pour déterminer la biodistribution de grosses molécules administrées, où l'addition d'un marqueur fluorescent à petite molécule est peu susceptible d'affecter la cinétique ou la bio-distribution du composé. Une variété de méthodes existent pour étudier la biodistribution qui varient de manière significative la quantité d'effort nécessaire et si les mesures résultantes sont totalement quantitatif, mais en utilisant plusieurs méthodes en combinaison peut fournir un système efficace et rapide pour l'analyse de bio-distribution.

Imagerie ex vivo ensemble d'organes est un procédé qui peut être utilisé pour comparer rapidement les concentrations relatives des molécules fluorescentes dans les tissus et entre les divers types de tissus ou de groupes de traitement. L'utilisation d'un plat d'imagerieforme conçue pour animaux vivants ou d'imagerie ensemble d'organes, la fluorescence dans les tissus intacts peut être déterminée sans traitement ultérieur, un gain de temps et de travail tout en offrant une image précise de la bio-distribution globale. Ce procédé est idéal dans des expériences tentant de déterminer la spécificité tissulaire d'un composé ou pour la comparaison de plusieurs composés différents. histologie des tissus Quantitative d'autre part nécessite une transformation ultérieure de tissus afin de créer une mesure quantitative des composés marqués. Pour évaluer avec précision la bio-distribution, tous les tissus d'intérêt doivent être tranchés, numérisés et analysés par rapport à des courbes standard afin de faire des comparaisons entre les tissus ou les groupes. histologie tissulaire quantitative est l'étalon-or pour déterminer les concentrations de composés absolues dans les tissus.

Ici, nous décrivons comment les deux méthodes peuvent être utilisées efficacement ensemble pour évaluer la capacité des différentes méthodes d'administration, unnd modifications composés pour cibler et fournir des molécules marquées par fluorescence au système nerveux central ^1.

Introduction

Le marquage fluorescent est une méthode facilement utilisable et efficace pour déterminer la bio-distribution de composés, en utilisant une gamme d'équipements qui est commun à de nombreux laboratoires. Les fluorophores sont largement disponibles, relativement peu coûteux et viennent dans une variété de longueurs d'onde, de sorte que plusieurs molécules marquées peuvent être utilisées simultanément sans interférence. La plupart des fluorophores ont une gamme de chimies de conjugaison à différents groupes réactifs présents sur les composés cibles, et le processus de conjugaison est généralement simple pour la plupart des types de sites réactifs. En outre, l'équipement nécessaire pour les mesures de composés marqués par fluorescence sont communs dans de nombreux laboratoires. microscopes fluorescents, imageurs, et les scanners de diapositives peuvent tous être utilisés dans des circonstances différentes, ce qui rend l'utilisation d'un marquage fluorescent très accessible. Des marqueurs fluorescents sont fréquemment utilisés pour déterminer la biodistribution et la cinétique de composés à la fois in vivo et ex vivo avec des dispositifs d'imagerie en temps réel, tels que le spectre IVIS Imager, ainsi que par histologie tissulaire quantitative ^2,3.

L'utilisation de l' imagerie ex vivo ensemble d'organes en utilisant des dispositifs d'imagerie en direct a augmenté au fil du temps en raison de leur facilité d'utilisation et la capacité de créer rapidement une comparaison précise des concentrations relatives des composés marqués sans nécessiter le traitement ultérieur de tissues4. Cependant, alors que l' ensemble d' imagerie ex vivo d' un organe peut permettre une analyse et une comparaison simple, il ne génère pas une mesure quantitative de la concentration de composés absolues à l' intérieur d' un tissu. Ceci est dû à des effets de diffusion de la lumière à l'intérieur d'organes intacts. Etant donné que la diffusion de lumière (et, dans une moindre mesure, l'absorbance) varie selon la taille et la densité des tissus, l'imagerie entière organe peut sous-estimer les niveaux de tissu dans les organes de grande taille ou denses. Formuler des normes appropriées pour les mesures de concentration absolue est également difficile parce qu'il faut imiter l'épaisseuret la densité de chaque organe individuel. D'autre part, l'imagerie ensemble d'organes est une méthode rapide pour obtenir les taux tissulaires relatifs d'un agent, et il est idéal pour comparer la bio-distribution relative des multiples molécules associées (par exemple, dans des études de ciblage de médicament). Une stratégie alternative consiste à utiliser quantitative histologie de fluorescence, une technique dérivée de la méthode de autoradiographie quantitative, pour obtenir des concentrations tissulaires absolues d'un agent d'essai ^5,6. Plutôt que de placer un animal ou d'un organe entier dans un dispositif d'imagination, histologie quantitative des tissus exige que chaque tissu est découpé en tranches, montées sur des lames, numérisées et analysées individuellement. Les normes de l'agent d'essai sont préparés et découpés à la même épaisseur que les échantillons d'organes. En coupant tous les organes et les normes de la même épaisseur, la variabilité due à la diffusion de lumière ou l'absorbance est éliminée, et l'intensité de fluorescence de tissus peut être adaptée à la courbe standard pour déterminer concent absolueration. Bien que cette méthode, lorsqu'elle est effectuée correctement, est quantitative, il est également de main-d'œuvre et facilement mal géré. Étant donné la nature plus complexe de l'histologie quantitative et le coût nettement plus élevé de la main-d'œuvre par rapport à l'imagerie ensemble d'organes, il devient intéressant d'examiner où chaque processus est plus pratique à utiliser lors de l'examen de la bio-distribution des composés marqués par fluorescence. Ce protocole fournit une description détaillée de la façon dont ces méthodes peuvent être utilisées ensemble pour comparer efficacement la bio-distribution du polypeptide élastine comme marqué à la rhodamine (PEL), avec ou sans l'addition des peptides de pénétration cellulaire SynB1 ou Tat, par l'intermédiaire du intranasale (IN) et intraveineuse (IV) voies d'administration.

Protocole

REMARQUE: Toute utilisation des animaux dans ce protocole a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université du Mississippi Medical Center.

1. Traitement des animaux et des tissus

1. Administration et Sacrifice
   1. Anesthésier les animaux en utilisant 3% d'isoflurane pendant 5 minutes et vérifier la profondeur de l'anesthésie par l'observation de l'absence du réflexe de pincement pincement. Appliquer une pommade vétérinaire aux yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
   2. Peser l'animal et la pipette une dose de 50 mg / kg soit marqué à la rhodamine PEL, SynB1-ELP ou Tat-ELP dans un tube de 1,5 ml. Économiser 100 ul des composés marqués administrés pour la formulation de courbes standard dans les étapes ultérieures.
      Remarque: il est important que les normes sont fabriqués à partir du même lot de protéine marquée est administrée à des animaux, afin d'éviter des écarts dus à la variabilité de l'efficacité de marquage fluorescent. Afin de supprimer correctement fluores de fondcence de mesures de fluorescence plus tard, un animal non traité doit être sacrifié en utilisant les mêmes méthodes / réactifs que les animaux traités.
   3. Administrer une injection IV comme décrit précédemment ¹ en utilisant soit la veine de la queue ou la veine fémorale (auquel on accède par un 1 cm incision dans l'aine). Pour l'analgésie, si une incision à l'aine, l'administration sous-cutanée carprofène à la dose de 5 mg / kg, et appliquer sensorcaine sur le site d'incision avant la fermeture avec un clip de la plaie. Pour administrer par voie intranasale (IN), placer l'animal dans la position couchée.
   4. En utilisant une pipette de 2 pl, établir une chute de 1 ul de composé marqué. glisser brièvement la tête de l'animal à partir du col de l'anesthésie pour permettre l'accès aux narines.
   5. Placez la pointe de la pipette à l'ouverture d'une seule narine et appuyez lentement sur le piston, ce qui permet la gouttelette couler le long de la narine dans la cavité nasale. Répéter chaque 1 min, nares alternant chaque goutte jusqu'à ce que la dose complète est adson ministère.
      Remarque: Le volume maximal administré via IN ne doit pas dépasser 10 - 15 pi pour les souris.
   6. Laissez les animaux en position couchée sous anesthésie pendant 10 minutes après l'administration finale avant de les déplacer chaque dans une cage individuelle.
      Note: Ne pas laisser les animaux sans surveillance jusqu'à ce qu'ils aient repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternale.
   7. 1 h après administration, re-anesthésier les animaux avant et les sacrifier par perfusion transcardial utilisant PBS (210,0 mg / L KH ₂ PO _4, 9,000.0 mg / L de NaCl, 726 mg / L Na ₂ HPO ₄ 7H ₂ O) 10 ml / min, pour un total de 20 ml.
      Remarque: la perfusion des animaux au moment du sacrifice pour enlever tout le sang des tissus est nécessaire pour déterminer les concentrations extravasculaires des composés marqués. réactifs de perfusion peuvent entraîner des changements dans la fluorescence de fond et devraient être maintenus cohérents. La méthode de sacrifice devrait être compatibleau sein des groupes. Différentes méthodes de sacrifice peut se traduire par des niveaux variables de sang dans le système vasculaire, la modification de la fluorescence des tissus de fond.
2. Collection de tissus
   1. Préparer PBS comme décrit ci-dessus pour le rinçage des tissus prélevés.
      Remarque: Si un autre tampon a été utilisé comme liquide de perfusion, rincer les tissus dans le même tampon.
   2. Retirez le cœur, les poumons, l'estomac, le foie, la rate et les reins par simple dissection. Rincer brièvement dans du PBS avant d'utiliser le laboratoire lingettes pour éponger ou évacuer l'excès d'humidité et de placer les tissus sur le tapis d'imagerie.
   3. Décapitez la souris et enlever le haut du crâne à l'aide de coupe d'os ou de rongeurs. En utilisant une pince, retirer délicatement le cerveau, en gardant les bulbes olfactifs intact. Rincer, sécher, et placez-le sur le tapis d'imagerie fourni.
   4. Pour retirer la moelle épinière par éjection rapide ^7, remplir une seringue de 10 ml avec du PBS et fixer une aiguille de calibre 18 émoussée.
      Remarque: 18 ajustements de jaugel'adulte canal médullaire de plusieurs lignées de souris. Le diamètre requis variera en fonction de la taille de l'animal.
   5. Placer l'animal dans la position couchée, en veillant à ce que l'ouverture du canal médullaire au niveau du site de la décapitation est coupé proprement et exempt de sang.
   6. Retirer la peau autour de la colonne vertébrale. Utilisation de coupe d'os pointus ou des ciseaux, couper à travers la colonne vertébrale dans la section lombaire directement rostrale aux hanches.
   7. Brièvement le rincer avec du PBS pour visualiser le canal rachidien. Insérez délicatement l'aiguille dans le canal rachidien.
      Remarque: L'aiguille doit se sentir serré et peut nécessiter un certain roulement lent avant et en arrière lors de l'insertion. Si l'aiguille se sentir lâche, une coupe plus rostrale peut être fabriqué ou une aiguille de plus grand diamètre peut être nécessaire.
   8. Avec le pouce et l'index, appliquer une pression sur la colonne vertébrale autour de l'aiguille insérée. Enfoncer le piston avec une pression modérée et constante. La moelle épinière s'éjecte intact de l'ouverture rostrale dans la moellecolonne.
      Remarque: Le retrait complet, le rinçage et le séchage de tous les principaux organes peuvent raisonnablement être réalisées en 5-7 min. Ce court laps de temps empêche la nécessité d'un stockage prolongé dans du PBS, ce qui pourrait entraîner une exposition excessive à la lumière et le lessivage des protéines marquées à partir du tissu.

2. Le total orgue Ex Vivo Fluorescence Imaging

1. Paramètres d'imagerie
   1. Démarrez le logiciel d'acquisition d'image. En bas à droite du panneau de commande d'acquisition, cliquez sur "initialiser."
   2. Sous «mode d'imagerie», sélectionnez la case à cocher "fluorescent". Sous "temps d'exposition", sélectionnez "AUTO".
   3. Sous "binning", sélectionnez "petit" et réglez le F / Stop à 2.
   4. Sélectionnez l'excitation de 535 nm et filtres d'émission de 580 nm.
      Note: Cela variera en fonction du marqueur utilisé.
   5. Sélectionnez «Field of View B" et régler la target à la hauteur de 0,3 cm.
      Remarque: Cela varie en fonction des tissus à imager.
   6. Une fois que l'indicateur de température passe au vert (ce qui signifie que la machine est complètement initialisé), placer les tissus sur le tapis de fond noir fourni, en veillant à ce que les tissus sont complètement séparés les uns des autres. Placez le tapis dans l'imageur, veiller à ce que tous les tissus sont dans la grille de la zone sélectionnée. Plus grands et non homogènes, tels que les tissus du foie entier, doivent être disposés de manière à réduire le chevauchement des lobes.
      Remarque: Les tissus peuvent être disposés ensemble dans un seul groupe, ce qui permet une image pour accueillir un seul animal ou tous les tissus d'un type similaire. Ceci rend l'analyse et de l'organisation plus facile par la suite. Si de grandes différences dans l'intensité de fluorescence sont présents parmi les divers tissus, il est préférable de l'image individuellement ou en tant que groupes du même type de tissu, comme un seul temps d'exposition peut ne pas être idéal pour toutes les intensités de tissus.
   7. Cliquez sur "Acquérir."
   8. Après l'imagerie, enlever les tissus immédiatement et stocker ou les congeler pour l'histologie quantitative, comme indiqué à l'étape 4.

3. Normes et traitement d'image

1. Normes
   1. Dans du PBS, créer des dilutions en série deux fois de chaque protéine utilisée dans le traitement des animaux, à partir de la concentration initiale, avec un total de 15 dilutions.
      Remarque: La plage de concentration devrait inclure les concentrations dans les tissus attendues et peut nécessiter une dilution supplémentaire de l'échantillon d'origine, en fonction de la concentration de départ.
   2. Pipeter 100 pi de chaque norme dans chaque puits d'une plaque de 96 puits noir. Inclure un puits de pur PBS pour obtenir une mesure de la fluorescence de fond.
   3. Image les normes avec les mêmes paramètres utilisés pour l'imagerie des tissus.
   4. Dans le logiciel d'acquisition d'image "Palette d'outils" sous "ROI Tools", sélectionnez la «région d'intérêt (ROI) "Cercle et tirer le retour sur investissement autour d'un puits. Copiez ce ROI à tous les autres puits remplis et cliquez sur "mesurer le ROI."
   5. Soustraire la valeur de l'efficacité moyenne radiante du pur PBS à partir des valeurs des autres normes; ceci supprime la fluorescence de fond. Tracer les valeurs contre la concentration connue sur un nuage de points.
      Remarque: L'équation de la ligne de tendance linéaire résultant peut ensuite être utilisé pour calculer la valeur relative de la fluorescence.
2. Traitement d'image
   1. Dans le logiciel d'acquisition d'image, sélectionnez l'outil ROI freeform et dessiner ROIs autour de chacun des tissus individuels. Cliquez sur "mesure".
   2. La moyenne des mesures d'efficacité radiante résultant, on soustrait les valeurs mesurées à partir de l'animal non traité pour chaque type de tissu et tracer ces valeurs sur la courbe standard précédemment créé.
      Remarque: Les valeurs relatives de fluorescence obtenues fournissent un aperçu rapide et précis de labiodistribution du composé marqué.

4. histologie tissulaire quantitative

1. Préparation et congélation des tissus pour Slicing
   1. Créer ou acheter des conteneurs de taille suffisante pour geler les tissus choisis et cryostat à utiliser. Emballage papier d'aluminium autour d'un objet correctement dimensionné et formé fonctionne bien.
   2. Préparer un mélange d'isopropanol et de glace carbonique en remplissant la moitié d'un bécher de 500 ml avec de la glace sèche et en ajoutant ~ 350 mL d'isopropanol afin qu'il y ait suffisamment de liquide au-dessus de la glace sèche pour immerger partiellement le récipient de congélation.
      Remarque: L'azote liquide se traduit souvent par la rupture du composé de température de coupe optimale (OCT) et les tissus incorporés et doit être évitée.
   3. Remplissez le récipient de congélation partiellement OPO, assurant qu'il n'y a pas de bulles présentes. S'il y a des bulles, les bulles travailler hors de la solution en utilisant une pince ou mettre en œuvre un similaire.
   4. Retirer le tissude PBS et sécher soigneusement, soit en tapotant doucement avec un laboratoire lingette ou en touchant les bords des tissus délicats à un laboratoire essuyez et permettant au liquide pour évacuer.
   5. Placez le tissu doucement dans l'OPO à l'intérieur du récipient de congélation, en veillant à ne pas introduire de bulles sous le tissu. Une fois que le tissu est en place, ajouter octobre jusqu'à ce que le tissu est complètement recouvert.
   6. Immergez le conteneur de congélation autant que possible sans permettre l'isopropanol d'entrer en contact avec les PTOM exposés à l'intérieur du conteneur. Autoriser 30 - 90 s (ou potentiellement plus pour les grands tissus) pour les PTOM et les tissus de geler complètement avant de les stocker à -80 ° C pendant aussi longtemps que nécessaire.
2. Préparation des étalons pour tranchage.
   1. Préparer et d'étiqueter de façon appropriée de 1 ml seringues à usage unique en retirant l'extrémité du canon, de telle sorte que toute la longueur de la seringue est un diamètre. Cela permettra au cylindre congelé pour être poussé par la suite.
   2. Nousing OPO, créer un 15-étape dilution en série deux fois de composés administrés, comme cela a été fait avec du PBS précédemment, mais avec un volume résultant final de 1 ml. Inclure un échantillon de pur octobre pour l'élimination des valeurs de fluorescence de fond.
   3. La viscosité de l'OCT rend difficile un mélange adéquat. Inversez les tubes et permettre à l'OPO pour régler complètement avant de retourner à nouveau. Répéter ces 10 - 20 fois pour assurer un mélange uniforme. Gardez les solutions standard à 4 ° C et à l'abri de la lumière pendant le mélange.
   4. Après mélange, on prépare encore un mélange d'isopropanol et de glace carbonique, comme précédemment.
      Remarque: L'azote liquide peut également être utilisé à la place du mélange de glace isopropanol / sec, à condition que les seringues sont rapidement retirés après avoir gelé.
   5. Dessinez la norme octobre dans la seringue, en prenant soin de présenter comme quelques bulles que possible. Après l'élaboration de la solution OPO, plonger immédiatement la seringue directement dans l'isopropanol et laissez la solution de geler complètementà l'intérieur de la seringue pour 10 - 20 s. Conserver les seringues à -80 ° C pendant aussi longtemps que nécessaire.
3. Découpe des tissus et des normes
   1. Placez les deux tissus et normes -20 ° C et laisser suffisamment de temps pour tous les échantillons à venir à la température.
      Remarque: La température de coupe idéale se situe généralement autour de -10 ° C gamme pour la plupart des tissus, mais cela dépend en fin de compte de la taille des tissus et la teneur en matières grasses et doit être affinée de manière empirique.
   2. L' utilisation d' un cryostat, couper les tissus en 20 um tranches épaisses et les monter sur des lames, comme décrit précédemment ^8. Stocker les diapositives à -20 ° C et de les éloigner de la lumière autant que possible lors de la coupe et jusqu'à ce que la numérisation.
      Remarque: Il est important ici que les sections à mesurer sont répartis de manière appropriée sur toute l'épaisseur du tissu.
   3. Pour monter les normes sur le mandrin de cryostat, prendre la seringue du congélateur et réchauffer l'extérieur pendant 3 - 5 s par holding en main. Poussez le piston jusqu'à ce qu'une courte section (~ 1 cm) du cylindre OPO est en dehors de la seringue.
      1. En utilisant une lame de rasoir, couper à travers le cylindre et placer la section cylindrique résultant perpendiculairement sur le mandrin, en utilisant OPO pour le maintenir en place. Cette configuration devrait se traduire par des cercles bien définis étant coupé.
   4. Trancher les cylindres à 20 um, en plaçant une tranche de chaque dilution sur une seule diapositive, de sorte que une diapositive représente l'ensemble de la courbe standard. Stocker les diapositives à -20 ° C jusqu'au moment de la numérisation.
4. Numérisation et quantification
   1. Démarrez le logiciel de réseau de numérisation et cliquez sur "543 laser" pour commencer la procédure de démarrage du laser. Attendre 15 min pour le laser pour se préparer.
   2. Une fois que le laser est prêt, retirez les diapositives de -20 ° C et déplacez-les dans un grand récipient, lumière protégée à venir à la température et à sécher pendant 3 min. Cela permettra d'éviter l'accumulation d'humidité dans le slide scanner.
   3. Chargez la diapositive dans le réceptacle de diapositives sur le scanner de diapositives. Cliquez sur "scan" et sélectionnez "run scan facile."
   4. Réglez la résolution de numérisation à 50 um.
   5. Sélectionnez la première "Utilisation" case sous "fluorophore" et sélectionnez "TRITC." Régler le PMT Gain à 80%.
      Remarque: Ces paramètres varient en fonction du fluorophore et de la concentration des molécules marquées.
   6. Sur le côté gauche, veiller à ce que la zone de numérisation comprend toute diapositive. Cliquez sur "Démarrer".
   7. Après la numérisation, sélectionnez "fichier" et "enregistrer sous", puis enregistrer l'image en tant que .tif.
      Note: Diapositives des tissus et des normes doivent être numérisés sur les mêmes paramètres.
   8. Chargez les images obtenues dans ImageJ et sélectionnez ROIs autour des tissus et des normes. Sous l'onglet "analyser", sélectionnez "défini des mesures" et sélectionnez "valeur moyenne gris." Cliquez220; mesure ".
      Remarque: Comme avec la technique précédente, la fluorescence de fond doit être soustrait de toutes les valeurs mesurées.
   9. Tracer les mesures moyennes de valeurs de gris des normes contre la concentration connue pour créer une courbe standard.
      Remarque: Les mesures résultant des tissus doivent être en moyenne au sein de chaque tissu et tracés sur cette courbe standard pour déterminer la concentration dans le tissu.

Résultats

Les données ci - dessous décrivent la livraison de trois composés: un vecteur de distribution de médicament connu sous le nom PEL et deux versions de PEL modifiés avec des peptides de pénétration cellulaire (SynB1-ELP et Tat-ELP) ^9. Les trois composés ont été marqués avec la tétraméthylrhodamine-5-maléimide et délivrées par deux voies d'administration (IN et IV). Le but de ces expériences était de déterminer quel composé et voie d' administration entraînerait la meilleure pénétr...

Discussion

Alors que l' imagerie ex vivo entier organe est généralement simple, l'adhésion à certains concepts et techniques de base peut améliorer la précision des mesures de bio-distribution. Courtes longueurs d'onde de la lumière l'expérience d'un degré élevé de dispersion et d'absorption dans la plupart des tissus, ce qui un impact significatif sur l'utilité des fluorophores courte longueur d'onde. Ces fluorophores ont application dans des études en profondeur des tissus li...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)	Thermo Fisher	T6027, A20342	Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling
Phosphate Buffered Saline	Sigma	1002243569	PBS Buffer for rinsing
Optimal Cutting Temperature Compound	Tissue-Tek	4585	Used for freezing and mounting
Equipment
IVIS Spectrum	Perkin Elmer		For ex vivo whole organ imaging
Cryomicrotome	Thermo		For cryosectioning
Fluorescence slide scanner	Perkin Elmer		For slide scanning