Свет лист флуоресцентной микроскопией корней растений, растущих на поверхности геля

Резюме

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Аннотация

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

Введение

Одним из ключевых вопросов в развитии понимания растений как одиночные клетки ведут себя во время дифференцировки органов и роста. В идеале, клеточные события, как паттернов экспрессии генов и локализации внутриклеточный белок, можно увидеть в свете большего контекста ткани. Эта цель ставит технические проблемы и требует целого наблюдения органов с высоким пространственным, а также временным разрешением в течение длительных периодов времени, которые могут вызвать эффекты фото-токсичности. Так как растения быстро адаптироваться к изменениям окружающей среды, растущие условия должны быть под жестким контролем. Для того чтобы сделать долгосрочное томографию без вмешательства физиологического состояния растения, три вещи, которые должны быть обеспечены, 1) условия выращивания в отборной камере, 2) стабильное образец монтажа в течение длительных периодов времени, и 3) формирования изображения с низкой интенсивностью света, чтобы избежать повреждения фото- и нефизиологичного условий.

Физиологический растет conditiДополнения в микроскопе образца камеры имеют решающее значение для долгосрочных экспериментов. Есть целый ряд имеющихся протоколов , которые описывают камеры роста изображений для конфокальной микроскопов ^{1 - 3.} Тем не менее, конфокальной микроскопии вводит высокие интенсивности света на растение, которое может вызвать ответные реакции на стресс и , как правило , тормозит рост ^4. Кроме того, большинство обычных микроскопов допускают только горизонтальное позиционирование образца, который не является оптимальным для растений, так как они пытаются переориентировать и растут в направлении вектора силы тяжести. За последние десять лет, светло-лист микроскопия превратилась в мощный инструмент для захвата развитие крупных образцов на клеточном разрешении в течение периодов времени до нескольких дней ^{5 - 9.} Свет-лист микроскопия позволяет позиционировать образец вертикально и все чаще используется в исследованиях растений изучает развитие корневой системы ^{10 - 21,} в недавнем обзоре Бертат и Майзель ^22. Многие из упомянутых исследований ^{10,13 - 18,21} были оптимизированы и проводились в лаборатории Эрнста HK Штельцера с использованием специального способа крепления образца характеризуется ростом корня на поверхности геля ^17. В этих исследованиях использовали на заказ микроскоп, в котором растение проходит от дна. В противоположность этому, большинство широко доступных легких листовых микроскопов держать образец из верхней части. Таким образом, этот конкретный способ получения не может быть легко применен. Метод , представленный здесь , обеспечивает протокол для устоявшихся на-поверхностного монтажа методом , применимым к OpenSPIM ^23, открытую платформу доступа для применения и повышения Выборочный Plane Illumination микроскопии (SPIM).

Общая цель этого протокола заключается в обеспечении долгосрочной визуализации Arabidopsis корней в OpenSPIM свет листов микроскопа. Это достигается путем выращивания растения в вертикальном положении на Surface геля с корнями в жидкой среде, в то время как листья остаются в воздухе. Для того чтобы обеспечить фотосинтетическую активность растения, изготовленным на заказ система освещения освещает листья , но не корни (рисунок 1).

протокол

1. Arabidopsis Культивирование До Воображение

1. Подготовьте ½ MS среду (вполсилы Мурасиге и Скуга) путем добавления 2,15 г MS-среду, 10 г сахарозы, 0,97 г MES (2- (N -morpholino) этансульфоновой кислоты) и 1 л DDH ₂ O (бидистиллятом ) на 1 л бутылку. Доводят рН до 5,8 с помощью KOH.
2. Добавьте 15 г / л геллановую камедь к среде ½ MS и автоклаве в течение 20 мин при 121 ° С.
3. Налейте 30 мл горячей среды в квадратные чашки Петри (245 х 245 х 25 мм), чтобы создать слой геля с толщиной около 2 мм. Пусть блюда остыть до комнатной температуры, чтобы среда затвердеть.
4. Помещенный Стерилизованные семена Arabidopsis в 1,5 мл реакционную пробирку , содержащую 1 мл стерильного H ₂ O. Возьмите семена с помощью стеклянной пипетки или пипетки кончик 1000 мкл и высевают их на поверхность геля. Место семена отдельно около 10 мм друг от друга. Печать пластины с лентой.
5. Инкубируйте планшет в течение 24 ч при 4° С (стратификации).
6. Выращивают пластину в инкубаторе роста, например , при 22 ° С в / ночной цикл 16/8 ч день с 120-140 мкмоль / м ² / с количеством света в течение 6 дней. До 10 дней можно использовать старые растения.

2. Завод образца Способ получения

Примечание: Держатель образца может быть либо 3D напечатаны или ручной работы в мастерской машины , используя размеры , изображенные на рисунке 2C. Файл модели 3D обеспечивается в дополнительном материале (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Смотрите ссылку для заказа 3D-печати в списке материалов.

1. Добавьте 5 г легкоплавкой агарозы в колбу 50 мл, содержащую 50 мл среды MS с половиной и автоклаве в течение 20 мин при температуре 121 ° С.
2. Алиготе 1% раствор агарозы легкоплавкой в ​​1,5 мл реакционных труб. Хранить при температуре 4 ° С (может быть использован в течение по крайней мере двух месяцев).
3. Растопить аликвоты 1 %% легкоплавкой агарозы при 80 ° C и дайте ему остыть до33 ° С.
4. Очистите держатель образца в ультразвуковом аппарате. Стерилизовать держатель образца с 70% -ным этанолом и промывают стерильной водой.
5. Порежьте гель вокруг растения с помощью скальпеля.
6. Поднимите блок с плоской лопаточкой и сдвиньте его аккуратно на держателе образца с использованием второго шпателя.
7. Клей гель на держатель образца с 1% агарозы (при 33 ° C) с использованием 100 мкл пипеткой.
8. Клей завод на гель с 1% агарозы с использованием 10 мкл пипетки. Используйте стерео микроскоп, чтобы убедиться, что листья не покрыты гелем. Не устанавливайте гель непосредственно на области, представляющей интерес.
9. Для того, чтобы предотвратить растение от высыхания, бесперебойно работать. Вставьте держатель образца в 1000 мкл кончика пипетки, когда это возможно. Используйте кончик пипетки в качестве колпачка и вставьте его тщательно в течение одного конца держателя образца, где расположен завод.
10. Поместите держатель образца в наконечник пипетки коробке и подготовить больше растений, если это необходимо. Растения могут быть дирекждении или отражаются положить обратно в инкубатор роста.

3. Настройка микроскопа

Примечание: Система освещения LED является несерийный лампа. Технические детали , необходимые для создания LED-кольцо можно найти на рисунке 3 и в списке материалов. Смотрите дополнительный файл материала (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) для дизайна платы.

1. Винтовой или клей (например двухсторонней ленты) светодиод кольцо на нижней стороне OpenSPIM х / у / г / θ стадии рычага.
2. Подключите светодиодное кольцо с регулируемым источником питания (0-30 В, макс 2 А).
3. Отрегулируйте напряжение до желаемой интенсивности света (для Arabidopsis, 120-140 мкмоль / м ² / сек, Рисунок 3D).
4. Стерилизовать камеру образца с 70% -ным этанолом и промывают стерильной водой.
5. Очистите объектив с бензиновой и чистки линз ткани. Стерилизовать объектив с 70% этанола.
6. Подключите perfusiна трубах в камере для образца в устройстве односторонней. Положить 1 л бутылку, содержащую свежий ½ MS среду и другую пустую бутылку рядом с перистальтического перфузионного насоса. Подключение бутылочку со средой с нижним входным отверстием камеры для образца с использованием одной перфузионной трубки. Соедините верхнюю выпускное отверстие камеры для образца с пустой бутылкой громить используемой среды с использованием другой перфузионной трубки.
7. Установите скорость потока 1 мл / мин.
   Примечание: Чтобы не перелива камеры пробы, важно, чтобы иметь более высокий отток, чем приток. Либо увеличить скорость откачки или использовать трубки с большим внутренним диаметром для оттока.
8. Вырезать черную пластиковую пленку в 3 мм небольшие квадраты, промывают 70% этанолом и дайте им высохнуть перед помещением их в камеру для образца на поверхности воды.
9. Удалите наконечник пипетки из держателя образца и вставьте держатель образца в камере для образца. Если только что изготовленный держатель образца не укладывается в стадии руки, использовать мелкий песокбумага, чтобы сделать его более тонким или использовать уплотнительное кольцо (∅ 6 мм) в случае, если она слишком тонкая.
10. Для создания крышки, вырезать черную алюминиевую фольгу на два 50 х 25 мм штук. Сделать 5 мм, вырезанные в середине одной стороне каждого куска. Fold , чтобы создать треугольник отступа (рис 1D). Закройте пробоотборной камеры с двумя крышками, поставив крышки на верхней части пробоотборной камеры с треугольником углублений, с которыми сталкивается держатель образца. Убедитесь в том, что листья растений не в тени крышек и получать свет от системы освещения.
11. Найти интересующую область с помощью X / Y / Z и поворота сцены позиционировать появляющуюся боковой корень в поле зрения.
12. Перед записью, позволяют системе уравновешивания в течение не менее 15 мин.
13. Установка получения изображения.
    1. Установите стек 217 изображений с 3 мкм г расстояния (650 мкм) и установить промежуток времени с 15-минутного интервала формирования изображения на общий срок 17 ч.
       Примечание: Подробная документация покак управлять программным обеспечением OpenSPIM можно найти на (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack).
14. Начать запись.

Результаты

Этот способ подготовки проб позволяет выращивать растения внутри образца камеры микроскопа, наблюдая корневую систему с светло - листов микроскопа (рисунок 1). Растение растет на поверхности слоя геля (½ MS среде , содержащей 1,5% геллановую камедь) , установленных на специально созданных держатель образца (рисунок 2). Держатель образца 3D напечатаны с использованием прозрачной смолы в качестве материала. Произведенное вариант подсветки размеров изображен на рис 2С. Корни погружают в жидкость (½ MS среде), которая постоянно синхронизируется системой перфузионной. Листья остаются в воздухе и непрерывно освещен интенсивности света 130 мкмоль / м / с , поступающей из синих и красных светодиодов, которые расположены в кольце над заводом (рис 1A, B и рис 3A-C). Светодиодное кольцо производится в нашей мастерской и машинымы предоставляем техническую информацию о том , как построить LED-кольцо на рисунке 3 и в списке материалов. Интенсивность света можно плавно регулировать в пределах от 30-250 мкмоль / м ² / с (рис 3D). Корневая система находится в тени небольших листов черной пластиковой пленкой , покрывающей поверхность воды (рисунок 1). Любой посторонний свет от подсветки, которая собирается линзой обнаружения фильтруется фильтром GFP (рис 3Е).

С помощью этой установки, время покадровой растущего Arabidopsis бокового корня был записан в течение 17 ч с использованием 20X / 0.5 объектив (Рисунок 4). Боковой корень имеет свое происхождение в слое перицикла клеток, который находится глубоко внутри первичного корня. Для того, чтобы продемонстрировать возможности визуализации даже более глубокие внутри ткани в течение продолжительного периода времени, с большим увеличением (40х / 0,75) был использован для захвата образование бокового роВЗ от первой стадии зачатка до появления из первичного корня в течение периода времени 38 ч (рисунок 5). Иллюстративный 2D срез набора данных показан на рис. 5В. Эта запись позволяет проследить динамику формирования боковых корней в 3D (рис 5А) с сотовым разрешением.

Рисунок 1: Рост условий внутри OpenSPIM камеры для образца. А) Эскиз изображения камеры. Растение растет в вертикальном положении на поверхности геля, установленный на пользовательском встроенный держатель образца (смотри также рисунок 2). Корни растут в жидкой среде, который непрерывно обменивается с помощью перфузионной системы. Листья растения растут в воздухе и подсвечиваются красными и синими светодиодами (смотри также рисунок 3). Корневая система затененных остроумие ч небольшие листы черной пластиковой пленкой, покрывающей поверхность воды. Крышка выполнена из двух кусков черного алюминиевой фольги дополнительно уменьшает количество света под поверхностью воды и позволяет поддерживать влажность в камере для образца. Увеличенная Панель справа высвечивает растениеводство на поверхности блока геля, погруженного в жидкую среду. Каплю агарозы монтирует корневой на гель. Пунктирным прямоугольником указывает на область интереса, наблюдаемого в микроскоп. Б) Фотография изображения камеры (без крышки). Числа (1) - (10) в А и В представляют собой: (1): х / у / г / θ ступени со светодиодным кольцом, (2): держатель образца, (3): крышка, (4): Резуховидка Таля , (5): листы черной пластиковой фольги, (6): перфузионной системы, (7): обнаружение линзы объектива, (8): жидкая среда, (9): камера для образца, (10): освещение линза объектива. С) Крышка сделана из двух кусков черного алюминиевой фольги. целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Держатель образца. А) 3D - модель. Файл модели 3D предусмотрен в дополнительном материале. Б) Фотография 3D отпечатков с использованием различных материалов (1) - (3): прозрачный акриловый пластик, (4) и (5): смолы, (6): прозрачную смолу. C) Технический чертеж держателя образца, числа представляют миллиметр. D) Фотография изготовленной держатель образца с завода установлен. Пунктирная область можно наблюдать с помощью микроскопа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

загрузить / 55044 / 55044fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Установка освещения растений. А) Принципиальная электрическая схема лампы. Пары светодиодов можно включать / выключать по отдельности для направленного молнии. LED: светодиод, R: сопротивление, T: транзистор, JP: булавочную головку. Б) Окончательный дизайн лампа подсветки была разработана с использованием ПХД программного обеспечения (PCB: печатная плата). Мы предоставляем файл дизайн платы в дополнительном материале. Плата была изготовлена ​​и затем собраны в нашем институте МИБА механический цех. C) Фотография светодиодное кольцо включения. Четыре пары красного и синего светодиода расположены в кольце. D) Диапазон напряжения можно регулировать в пределах от 3,5 В и 14,0 В. были использованы сопротивлений для достижения количества света в пределах от 30-250 мкмоль / м ² / с (R1-8: 220 Ом, R9-12: 1,220 Ом ). Е) Спектр излучения лампы, GFP и YFP. TP: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Временной интервал записи Резуховидка Таля боковой корень. 5 дней саженец выражает мембранный маркер (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) и ядерный репортер (pGATA23 :: NLS-GUS-GFP), в частности, маркировка перицикла клеток, которые развиваются в боковой корень. Стек из 217 изображений (3 мкм г-расстояние) был взят в плен каждые 15 мин в течение 17 ч записи с использованием 20X / 0.5 объектив. A) Четыре временных точек из 69 показаны в максимальной проекции интенсивности. Б) Шесть из 217 одноместных ломтиков г стопкой один момент времени показаны. Шкала баров в А и В составляет 100 мкм.нагрузка / 55044 / 55044fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Временной интервал записи Резуховидка Таля боковой корень. 6 дней саженец выражает мембранный маркер (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) и ядерный репортер (pGATA23 :: NLS-GUS-GFP), в частности, маркировка перицикла клеток, которые развиваются в боковой корень. Стек 200 изображений (1,5 мкм г-расстояние) был взят в плен каждые 15 мин в течение 38 ч записи с использованием 40X / 0.75 объектива. А) 3D - рендеринг четырех временных точек, числа в сетке представляют мкм, В) единый срез через центральную плоскость главного корня. Шкала бар составляет 50 мкм. пожалуйстаНажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. Файл модели 3D обеспечивается. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

LED Справочная файла Ring Board.brd. Файл дизайн платы предусмотрен. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Легкий лист флуоресцентной микроскопией имеет большое преимущество, чтобы совместить низкую фототоксичности и сверхбыструю скорость сбора данных, который может быть использован для захвата большого объема с высоким пространственно-временным разрешением, сохраняя образец в физиологическом состоянии. Разрешение светового микроскопа листа может быть по сравнению с конфокальной микроскопии ^9. Тем не менее, рассеяние света и поглощение происходит вдоль возбуждения и излучения пути по отдельности и в целом качество изображения может быть значительно ниже, внутри непрозрачных тканей по сравнению с поверхностью. Для того, чтобы обойти это осложнение можно использовать возможность вращать образец вдоль вертикальной оси и наблюдать один и тот же объем с разных направлений. Но это не всегда выгодно, например , боковые корни появляются на одной стороне корня и визуализации сзади приводит к низкому качеству изображения без получения дополнительной информации. Тем не менее, вращение может быть в основном используется для позиционирования SAMPле наилучшим образом. Классическая горизонтальное расположение линз объектива позволяет новые способы крепления образца. Растения извлечь выгоду из вертикального положения. Представленной здесь "на поверхности геля" метод монтажа имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами , такими как монтажными встраивание корень внутри геля ^24,25. 1) Корневая система находится в непосредственном контакте с жидкой средой. Отборная камера соединена с системой перфузионной, которая обеспечивает непрерывно свежую среду. Он также может быть использован для быстрого обмена весь объем камеры для образца для применения различных средств массовой информации или наркотиков. 2) До начала подготовки образцов растения растут, как они используются для выращивания в лабораториях. Растения могут быть выбраны под флуоресцентным микроскопом и только желаемые растения должны быть подготовлены. 3) Растение переносят из чашки Петри в держатель образца без прикосновения. Таким образом растение может дополнительно развиваться на том же самом геле он рос на в incubato ростаR и механическое напряжение снижается до минимума. 4) Вид на образец перекрывались и оптические аберрации сводятся к минимуму, так как пространство между образцом и объективом обнаружения исключительно заполнена средой, и без каких-либо других материалов с разными показателями преломления,.

Для выполнения долгосрочной визуализации, система освещения растений необходимо обеспечить фотосинтетическую активность растений. В большинстве лабораторий растения растут на прозрачный гель, т.е. корни подвергаются воздействию света. Это может привести к различным ответам на их окружающую среду и вызывает изменения в их биохимии и развития ^26,27. Для того чтобы уменьшить количество света, на корневой системе, черная пластиковая пленка была использована для покрытия поверхности воды, а также крышку, изготовленную из черной алюминиевой фольги охватывает камеру с образцом. Свет может достигнуть листьев растений через центральное отверстие в крышке. В этой установке, никакого увеличения фонового света не наблюдалось, suggestinг, что количество постороннего света от красного и синего светодиодов был значительно уменьшен с помощью фильтра GFP и затенение подходов. Это позволило сохранить свет включенным во время получения изображения без увеличения камеры фоновый шум.

Держатель образца предназначен для 3D-печати. Тем не менее, выбор материала имеет решающее значение, как несколько пластики, которые были протестированы не были 100% стабильны, что приводит к дрейф образца. Поэтому, рекомендуется использовать смолы вместо или построить держатель образца путем измельчения полиэтилена (РЕР) стержня. При использовании легкого листового установки микроскопа с двухсторонней системой освещения держатель образца может мешать одному из легких листов в зависимости от угла поворота. Чтобы уменьшить механическое напряжение во время выкапывая растение из пластины, используйте плоский угол лопаточки. Растение может быстро высыхают и поток воздуха опыт в первый раз. Старайтесь избегать сквозняки (быстрые движения, кондиционер потока), WOгк бесперебойно и сдвиньте держатель образца в 1000 мкл кончика пипетки, когда это возможно. Внутри микроскопа, очень важно, чтобы не погрузить весь завод в жидкость и сохранить листья сухими.

Этот метод идеально подходит для работы с изображениями ранних стадий формирования боковых корней. При выполнении долгосрочной перспективе визуализации зрелых кончиков корней нужно иметь в виду, что Arabidopsis корни растут с 100-300 мкм / ч быстро из поля зрения. Очень полезно в будущем реализация может быть автоматизированный алгоритм отслеживания, который позволил бы рост кончика корня следуя в течение продолжительного периода времени. Возможность контролировать условия окружающей среды, такие как свет и питательный состав среды в процессе сбора позволяет исследовать, как растения адаптируются к изменениям. Корень находится в непосредственном контакте с жидкой средой, которая может использоваться для применения препаратов для химически активации экспрессии генов, например , с использованием дексаметазона индуцируемый ²⁸ или & beta; Estradiol индуцируемую систему ^29. Тем не менее, требуется время, чтобы обменять весь объем камеры для образца, чтобы смыть препарат. Установка может быть улучшена за счет минимизации объема камеры для образца для ускорения обмена среды. Тем не менее, этот метод имеет большой потенциал. Сочетание монтажной процедуры, стандартных условиях выращивания и нежного захвата изображения с использованием световой микроскопии листа позволяет долгосрочные исследования развития растений с высоким разрешением на физиологическом уровне. Это поможет исследователям изучить основные механизмы развития растений.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low melting	VWR	AFFY3282125GM
Black aluminum foil	Thorlabs	BKF12
Black plastic foil	Carl Roth	HT83.2
LED blue (453 nm)	OSRAM	LD CN5M-1R1S-35-1
LED red (625 nm)	OSRAM	LR T66F-ABBB-1-1
LED board - PCB design software	Cadsoft Eagle
MES monohydrate	Duchefa	M1503.0100
Micropore Surgical Tape	3M	1530-1
Murashige & Skoog Medium (MS-Medium)	Duchefa	M0221
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Sample holder 3D print	i.materialise	https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1
Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm)	VWR	734-2179
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097-1KG