Исследование хост фенотипы в<em&gt; Gambusia аШшз</em&gt; После Лечение антибиотиками

Резюме

Это исследование включает в себя методы, чтобы выявить эффекты на модели рыбы хозяина следующие изменения кожи и кишечника микробиомом сообщества композиции антибиотиком.

Аннотация

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Введение

Было установлено, что антибиотики могут нарушить человеческую микробиомом, ведущую к дисбактериоза, а это означает микробного сообщества дисбаланс. Композиционное изменение микробиоты после лечения антибиотиками было показано для снижения разнообразия сообщества, уменьшить ключевых членов, и изменить метаболизм сообщества, особенно в кишечнике ^{1, 2.} Антибиотик нарушение кишечника микробиомом может уменьшить сопротивление колонизационную к Clostridium несговорчивый ^{3, 4} и ⁵ сальмонелл.

Кроме того, нарушение микробиоты был связан с развитием многих синдромов и заболеваний у человека (например, связанные антибиотик энтероколиты, воспалительные заболевания кишечника, нарушения обмена веществ и др.). Антибиотики также широко применяется в сельском хозяйстве в качестве стимуляторов роста вскота и птицы производство ^6. Использование этих мощных инструментов не без побочных эффектов, что проявляется в быстром росте устойчивости к антибиотикам, а также последствий нарушенного микробиомом имеет с ее обитаемых хозяином. Многие исследования показали, что использование антибиотик широкого спектра действия имеет долгосрочные последствия для структуры и функции микробиоты, однако побочные эффекты от антибиотика разрушенным микробиомом воздействуя хозяина физиологии являются лишь спекуляциями, которые еще не поддерживаются.

Взаимодействие между принимающими, микробиоты и антибиотики далеко от понимания в сжатой форме. Таким образом, простой и более сговорчивым модель выгодно пролить свет на чрезвычайно сложной системы млекопитающих. Слизистые поверхности в организме человека, в том числе в кишечнике, питают самую высокую плотность и разнообразие микробов, а также самые близкие взаимодействий микроб-хост. Через слизистую оболочку кожи микробиомом из рыбы предложения сeveral преимущества в качестве модельной системы. Костистых рыб (костистых рыб) является одним из самых ранних линий расходиться по смыслу , что позвоночных костистых рыб имеют как врожденные и приобретенные иммунные системы, которые совместно развивались отношения с синантропных бактериальных сообществ ^7. Акций рыбьей кожи много особенностей с типом 1 слизистыми оболочками млекопитающих, таких как физиологические функции, компоненты иммунитета, а расположение слизью клеток , продуцирующих ^8. Внешнее расположение поверхности рыбы через слизистую оболочку кожи предлагает микробиомом легко манипулировать и экспериментально образца.

Западный гамбузия, Gambusia аШшз (Г. аШшз), представляет собой модель рыбы , которая была использована в прошлом для изучения спаривание и токсикологии ^{9, 10, 11.} Учитывая небольшой размер, численность населения в дикой природе, как инвазивные виды, м inimal затрат по уходу, и выносливые характер, мы разработали Г. аШшз как через слизистую оболочку модели микробиомом. Кроме того, Gambusia разделяют физиологию рождая живых детенышей с живородящих млекопитающих, что является редкостью в видов рыб. Мы завершили наиболее обширное исследование во время рыбьей кожи нормальной микробиоты с использованием 16S профилирование с Gambusia ^12. Дальнейшая работа продемонстрировала три отрицательных эффектов на хосте следующие нарушения кожи и микрофлоры кишечника , используя антибиотик широкого спектра действия ^13.

Пять различных эффектов были исследованы в рыбе после воздействия антибиотика. Наиболее хорошо известна принимающей преимущество микробиомом является конкурентное исключение патогенных микроорганизмов. Рыба патоген Edwardsiella ictaluri известно, причиной вспышки кишечно септицемии в коммерческих фермах сома ^14. E. ictaluri также было показано летально заражают даниокласс = "Xref"> ^{15, 16} и Gambusia ^17. Проблема, с этим патогеном из толщи воды может служить мерой исключения. В качестве сравнения с восприимчивостью к отдельному патогена, выживание при воздействии высокой плотности смешанных организмов также было проведено. Фекалии и богатой органическими веществами почвы использовались как часто встречающихся источников микробных сообществ.

Еще одна роль создана бактериальная кишечника сообщество выполняет это питательных веществ и энергии обработки урожая, тем самым влияя на общую питательную поглощения для хозяина. Как грубое измерение питания, вес тела рыбы сравнивали до и после одного месяца кормили стандартной диете. Антибиотик обработанной рыбы, как в среднем потеряли вес в то время как контроль рыбы в среднем прибавили в весе в течение месяца. Механизм этого недостатка увеличения веса остается неясным. Одним из возможных факторов является время прохождения пищи в кишечнике. ГИ МотиМетод мируемости был адаптирован из данио (Адам Рич, SUNY Брокпорт, личное сообщение) для определения времени транзита. Она до сих пор не определена, если антибиотик обработанной рыбы имеют измененную время транзита.

Общей проблемой опыт в природной среде всех организмов, в особенности рыб, является осмотический стресс. Gambusia было показано , что быстро адаптироваться , когда остро подчеркнуто в высоких концентрациях солености ^18. Удивительно, но рыба с микробиомом антибиотик изменен выставленного опускают выживаемость до высокой солевого стресса. Механизм этого нового фенотипа находится под следствием. Другой общий акцент на водных животных, особенно в аквариумах, является токсичной формы азота (аммиака, нитратов и нитритов). Выживание против нитратов существенно не отличалась между антибиотиками и обработанных контрольных рыб. Методы , представленные в этой рукописи могут быть использованы с Gambusia или аналогичной модели , рыб организмов, таких как зебрырыба и оризия, для измерения фенотипы в рыбе следующих экспериментальных манипуляций.

протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с утверждением протоколов IACUC, пронумерованных 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 и 14-04-17-1018-3-01.

1. Сбор животных, обработка и этическим принципам ухода

1. Сбор Gambusia аШшз с сайта поля (руководство по определению на http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) с использованием небольшого сачок и место в 19 л ведра. Используйте визуальный осмотр для определения видов.
2. Остальные рыбы в течение 1 - 2 г в ведро с водой пруда. Затем передать рыбу в 76 или 189 л аквариума цистерны, заполненные наполовину прудовой воды / половину водопроводной воды при 25 ° C, газированных с пузырящейся Распылитель. Используйте маленькую сачок при обработке рыбы, чтобы минимально нарушить их микробиомом кожи.
   Примечание: плотность рыбы должна быть не выше, чем 20 рыб / 38 л аквариумной воды. Рыба акклиматизировались в аквариум, по крайней мере 5 дней до эксперимента.
3. Кормите рыбу на ежедневный режим с 5 мг чешуйчатого пищи в рыбе. эйЛ.Д. рыбы с 12 ч свет / 12 ч темного цикла.

2. Первичная Антибиотик экспозиции для всех экспериментов

1. Рисование всех рыб из каждого эксперимента из того же аквариума, поместить на две отдельные группы (лечение: подвергаться воздействию антибиотика и управления: неразоблаченным) в 19 л ведра. Предыдущие данные, собранные показывает, что рыба в том же аквариуме были гомогенизированные microbiomes кожи, которые имеют небольшое изменение в составе сообщества. ¹²
2. В ходе экспериментов, держать рыбу в 2 л воды искусственный водоем (APW; 0,33 г / л CaCl _2, 0,33 г / л MgSO _4, 0,19 г / л NaHCO ₃₎ , который стерилизовали автоклавированием перед использованием.
3. Подготовка к рифампицину антибиотик маточного раствора путем добавления 50 мг / мл в диметилсульфоксиде (ДМСО). Рифампицин является представителем антибиотик широкого спектра действия, который не является токсичным для рыб. У человека и у мышей, он распределяет хорошо в тканях.
4. Из рифампицина запаса управлять окончательнымконцентрация 25 мкг / мл в 2 л ППВ для воздействия антибиотика обработанной группы рыб в течение 3-х дней. Следует отметить, что после того, как 3 г, культивируемых кожи бактериальные числа возвращают аналогично предварительно обработанной кожи рыб.
5. Параллельно с этим, держать группу необработанной рыбы в ЕПР и дать эквивалентное количество ДМСО (0,5 мл на литр ППВ) в толщу воды, чтобы действовать в качестве контрольной группы.
6. Как эксперименты предназначены для измерения воздействия на микробиомом антибиотик изменен на рыбные фенотипов, чтобы избежать эффектов непосредственно из самого антибиотика, после воздействия трехдневной антибиотик (или контроль) период, перешлите рыбу в ведро с 2 л свежий ППВ.
   1. Используйте период отдыха в течение 10 часов, так что антибиотик удаляют телами рыб. База на этот раз исключение на экспериментах, где рыбы были подвергнуты 25 мкг / мл антибиотика в течение трех дней. Эвтаназии рыбу отрезая спинного мозга с последующим Pithing, затем гомогенизировать все тело с помощью шлифовальной машины ткани.
   2. Определить наличие антибиотик путем размещения 50 мкл этой суспензии после фильтрации 0,2 мкм в центре агаровой Петри. Сделайте отверстие для этой суспензии, нажав перевернутый стерильную 200 мкл пипетки в агар, который удаляет небольшую пробку.
   3. Используйте агаром с 20 мл измеренный объем питательный агар, и равномерно распределить с помощью ватного тампона с индикатором организма, Сенная палочка, которая чувствительна к рифампицину. Получение В. зиЫШз из чашки с питательным агаром инкубировали при 25 ° CO / N и с помощью ватного тампона , чтобы получить колонии. Наблюдая зону ингибирования, после инкубации в течение ночи при 25 ° С указывает на наличие антибиотика в тканях рыб.

3. микробиомом Добыча

1. Извлечение образца микробиомом кожи от внешних слизистых оболочек эпидермиса, помещая рыбу в стерильный 15 мл коническую трубку , заполненную 2 мл стерильного PBST (137 мМ Na, 10 мМ фосфат, 0,1% твина-20, рН 7,4) раствора хлористого аммония и вортексе при насадке 10 в течение 1 мин с шагом делая паузу 10 сек. Моющее средство и соль в буфере способствует равномерное диспергирование бактерий в растворе. Сопоставимые результаты были получены с 0,85% физиологический раствор, но снизил количество бактерий с чистой водой.
2. Передача рыбу из конической трубки к восстановлению ковша. Летальность извлечения кожи, как правило, ниже, чем 10%. Либо, анализировать бактериальную суспензию в трубе сразу после экстракции или гранул бактерии с помощью 2 мин отжиму в центрифуге при комнатной температуре при 15000 х г и хранят при -80 ° С для последующего анализа.
   Примечание: Все культуры и биохимические анализы немедленно; ДНК или экстракции белка может быть из замороженных образцов.
3. Для того, чтобы получить образец кишки микробиомом, сначала поместите рыбу в стерильную чашку Петри. Эвтаназии рыбу путем разъединять шейного отдела спинного мозга непосредственно позади головы с хирургическими ножницами, а затем Pithing, А затем внешне санировать организм 70% этанола салфетками.
4. После рассечения, удалите весь кишечник путем разрезания после пищевода и до заднего прохода.
5. Вырезать кишку на небольшие участки 1 - 2 мм в длину и разместить все секции в два мл раствора PBST в конической трубе. После того, как встряхиванием в течение 1 мин, удалить надосадочную жидкость в другую чистую пробирку (будьте осторожны, чтобы не составлять секции кишки).
   Примечание: Супернатант содержит выделенные бактерии кишечника, которые либо могут быть использованы для прямого анализа или осаждали предыдущим способом, указанным для образцов кожи.

4. Заражение Модель Подготовка и ванны из конкретного патогена

1. Получение инфекционного штамма Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) и сохранить культуру хранили при -80 ° С. Штамм 93 - 146, используемый в этом исследовании, изолированный от зараженного сома, был получен от Марка Лоуренса, Колледж ветеринарной медицины Университета штата Миссисипи.
2. Streак Е. ictaluri приклад на выборочность и дифференциальные средства массовой информации называют Е. ictaluri медиа (EIM) агар ¹⁹ для культивирования бактерий и инкубировать в течение 2 дней при 27 ° С.
3. Перенесите чистую изолированную колонию из культуры и инокуляции колбу объемом 150 мл, содержащую 40 мл питательного бульона (NB; 5 г / л пептона, 4 г / л экстракта говядины). Поместите колбу в шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту в течение 2 дней при 27 ° С.
4. После инкубации разбавьте образец культуры в PBST к чтению спектрометра 0.2 OD при 650 нм для калибровки E. ictaluri культуры для желаемых инфекционных объемов дозы.
5. Следующая передача и лечение (после 3-х дней воздействия антибиотика) и необработанных групп рыб в отдельные пластиковые чашки, содержащие 130 мл свежей воды искусственного пруда или APW в течение приблизительно 10 ч для клиренса лекарственного средства из тканей рыб.
6. Тогда из обеих групп, передавать снова каждую рыбу в 8 унций пластиковых чашек, содержащих 130 мл чистого ЕПР.
7. Дайте каждой рыбы смертельную дозу , содержащую 2,8 х 10 ⁶ КОЕ / мл E. ictaluri культуры в ЕПР (ванна модель инфекции) и держать в 27 ° C инкубаторе в течение 24 часов.
8. После ванны ictaluri Е., передавать рыбу по отдельности в новые чашки с 130 мл ЕПР.
9. После замены воды, рекорд смертности рыбы по продолжительности недели. Рыба не кормили в течение этого периода. В отличие от сома, Gambusia не обнаруживают никаких внешних признаков инфекции, поэтому необходимо использовать летальность в качестве экспериментальной точки.

5. Полимикробные вызов с калом & Soil

1. Фекалии Лечение
   1. Получить свежие человеческие экскременты от здорового субъекта добровольца, который не получал антибиотики в предыдущие две недели, используя стерильные перчатки и стерильные 50 мл коническую трубку.
   2. После сбора, сбора фекалий в стерильном полиэтиленовом пакете, а затем передать в стерильный 15 мл Conical трубки. Создание концентрации запасов путем суспендирования фекалии в PBST с получением исходного раствора, 500 - 800 мг / мл. Эта густую смесь лучше переносить с использованием 1 мл или больший пластмассовый наконечник пипетки, разрезанные на дне стерильными ножницами так, чтобы отверстие больше.
   3. После первоначального воздействия антибиотиками обработанных и контрольных необработанных групп рыб, разделены на отдельные пластиковые чашки, содержащие фекальные суспензии при конечной концентрации либо 15 мг / мл или 10 мг / мл в ЕПР с общим объемом 130 мл. Удержание чашек в термостате при 25 ° С.
   4. Запись рыбы смертность во время фекального воздействия путем тщательного наблюдения за 2 сут.
2. Обработка почвы
   1. Соберите 1 - 2 кг богатого органического слоя почвы (должна содержать самую высокую плотность и разнообразие микробов) примерно 7 - 15 см вниз в глубину и поместить в чистый пластиковый контейнер. Обратите внимание, что почва должна быть использована в течение двух дней после сбора.
   2. ужасныйctly после первоначального периода воздействия, отделить обе группы обработанных антибиотиком и необработанной рыбы в отдельные пластиковые стаканчики, содержащих 18,2 г почвы в 130 мл ЕПР. Смешайте почву в колодезной воде вручную, прежде чем добавить рыбу. Большинство из макрочастиц не приостанавливать и остаться на дне чашки.
   3. Expose рыбу продолжительностью 3 суток при 25 ° С и записывать любой смертности.

6. осмотический стресс вызов

1. После лечения с последующим 10-часового периода покоя, как описано выше, индивидуализировать рыбу в отдельные чашки, содержащие NaCl при 17,5 мг / мл (300 ммоль) в 150 мл ЕПР. Это половина типичной солености морской воды, которая не является полностью летальная (<50%), чтобы контролировать рыбу, но сильно напряжено, что требует эффективного осморегуляции.
2. Обратите внимание на гибели рыб в течение периода 36 ч.

7. Нитрат Токсичность Вызова

1. Остальные рыбы в течение 10-часового периода после антибиотиков экспоЮр, а затем отдельные рыбы в отдельные чашечки, содержащие концентрацию нитрата натрия: либо 10 мг / мл (118 мМ) или 17,5 мг / мл (206 мМ) в 130 мл ППВ.
2. Запись на смертность в течение 4 сут для низких доз и 1 г для высокой дозы.

8. Рост Анализ Индивидуализированного или сгруппированных рыбы

1. Полный 3 d воздействие антибиотика или контрольного периода в виде групп в ведрах.
2. Для индивидуальных, заполните 8 унций пенопластовые чашки 150 мл ЕПР каждого, передать индивидуальную рыбу в чашку и записывают общую массу тела для первоначальной оценки.
   1. Повторите эти действия для всех рыб в обеих обработанных и необработанных групп. Используйте белые пенопластовые чашки вместо прозрачных пластиковых чашек, потому что рыба не будет есть, когда в прозрачных стаканчиков.
3. Поток рыбы ежедневно со стандартной диете из двух гранул на рыбу. Пеллеты были использованы, а не хлопья, поскольку гранулы имеют низкую дисперсию в индивидуальной массе (3,53 ± 0,42 мг каждая, или 8% вариации), resultinг в рыбе получать одинаковое количество пищи. Монитор потребления путем визуального записи недоеденные гранул. Нормы расхода обычно были выше 80%.
4. В конце каждой недели в течение 4-х недель, определить вес рыбы. Подготовьте новую чашку со свежей APW, поместите на весы, а затем записать вес. Затем залить рыбу в сачок из исходной чашки и переносят в новую чашку, которая затем снова взвешивают. Рыба не обрабатываются, чтобы избежать стресса.
5. Для групп, 2 место L ППВ в 19 л ведро и тарные масштаб. Держите рыбу вместе в обеих группах при переходе на новые ведра ППВ затем записать общий вес группы. Запись веса рыбы группы каждую неделю в течение месяца промежуток времени путем перевода на новое ведро.

9. Gut Время перехода

1. С помощью меченных флуоресцеином 70 кДа анионный декстран. Декстрана значительно не перевариваются, и слишком велик, чтобы быть поглощенными через кишечную слой, таким образом, проход будет измерять время прохождения через кишечник.Маркированный декстран была включена в корм для рыб.
2. В стерильный 1,7 мл пробирку, добавьте 360 мкл стерильной деионизированной воды и 52 мг желатина (13% раствор), и поместите трубку на тепло блока 60 ° C до тех пор, желатином расплавах и полностью растворяется.
   1. Измельчить золотая рыбка пищевые хлопья в мелкий порошок, используя ступку и пестик, и добавляют 40 мг этого порошка в трубку, наряду с 20 мкл рыбий жир. После перемешивания добавляют 1,6 мг FITC-декстрана.
3. Разлить горячую жидкую смесь в 20 капель на Parafilm мкл на лабораторном столе, и пусть они быстро остыть и затвердеть. Капли можно хранить до 4 дней, прежде чем они станут слишком трудно для рыбы, чтобы поесть. Хранить капли в холодильнике, поместив парафином на половину чашки Петри, которая затем плавал на стерильной воде внутри герметичного пластикового контейнера, который удерживает капли увлажненным.
4. Непосредственно перед подачей, четверть капель на секции с помощью лезвия бритвы. Акклиматизировать рыбу к STYROпены чашки индивидуально в течение 2 дней без кормления (Примечание: были использованы только Неэкспонированные управления рыбы). Поместите четыре четверти пищи в чашку с рыбой, и наблюдать рыбу в течение 30 минут для того, сколько кусочков пищи, которую они едят каждый.
5. Для начала периода мониторинга, передавать рыбу индивидуально в чашки с 80 мл ППВ с использованием сачок. Каждые 2 ч, осторожно взболтать APW вручную, а затем взять 1 мл пробы и хранят в маркированный 1,7 мл трубки при 4 ° С. Отбирают образцы в течение 36 часов.
6. Запись флуоресценции, с флуоресцентным спектрофотометром, из всех образцов, в то же время, после завершения анализа. Поместите весь 1 мл образца в кювету, и регистрации флуоресценции, измеренную с использованием возбуждения при 495 нм и излучение на длине волны 520 нм.

Результаты

Общая принципиальная схема экспериментальной системы , используемой для изучения рыб - хозяев эффектов от воздействия антибиотика ¹³ представлена на рисунке 1А и включает в себя метод для извлечения кожи (Фигура 1В) и кишечника (рис 1C)...

Обсуждение

Некоторые проблемы требуют периода отдыха в чистом ЕПР после лечения антибиотиками препарат расходоваться в тканях рыб. Если период отдыха пропускается затем присутствие антибиотика может запутать результаты, особенно когда анализ включает воздействие бактерий. Для того чтобы иссл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
Sodium Nitrate	Sigma Aldrich	S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran	ThermoFisher Scientific	D1823
Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets	Calbiochem	6500-OP	tablets dissolve in water to make PBS