L&#39;esame dei fenotipi host in<em&gt; affinis Gambusia</em&gt; In seguito a trattamento antibiotico

Riepilogo

Questo studio coinvolge i metodi per rivelare gli effetti su un host modello di pesce seguito alterazione della pelle e intestino composizione delle comunità microbiome da un antibiotico.

Abstract

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Introduzione

È stato stabilito che gli antibiotici possono disturbare il microbioma umano che porta a disbiosi, il che significa uno squilibrio comunità microbica. Alterazione della composizione del microbiota dopo trattamenti antibiotici ha dimostrato di ridurre la diversità della comunità, di ridurre i membri chiave, e alterare il metabolismo della comunità, in particolare nell'intestino ^{1, 2.} Disturbi antibiotico del microbioma intestinale in grado di ridurre la resistenza colonizzazione da Clostridium difficile ^{3, 4} e ⁵ Salmonella.

Inoltre, l'interruzione del microbiota è stato collegato allo sviluppo di molte sindromi e malattie negli esseri umani (per esempio, associata agli antibiotici enterocolite, malattie infiammatorie intestinali, disturbi metabolici, ecc.). Gli antibiotici sono anche ampiamente implementati in agricoltura come promotori della crescita neibestiame e pollame di produzione ^6. L'utilizzo di questi potenti strumenti non è priva di effetti collaterali, che è evidente nel rapido aumento della resistenza agli antibiotici, così come gli effetti di una microbiome perturbato ha con il suo ospite abitato. Molti studi hanno dimostrato che l'ampio spettro di utilizzo di antibiotici ha lunghe conseguenze durature per la struttura e la funzione del microbiota, eppure gli effetti collaterali da un microbiome impatto fisiologia ospite antibiotico-perturbato sono solo speculazioni, che devono ancora essere supportato.

L'interazione tra host, microbiota, e antibiotici è ben lungi dall'essere inteso in modo conciso. Pertanto, un modello semplice e più trattabile è vantaggioso per illuminare il sistema di mammiferi molto complesso. mucose negli esseri umani, tra cui l'intestino, il porto la più alta densità e la diversità dei microbi, e anche i più intimi interazioni microbo-ospite. Il microbioma pelle mucosa offre pesce svantaggi everal come sistema modello. Il Teleostei (pesci ossei) è uno dei primi lignaggi a divergere ai sensi vertebrati che teleostei hanno sia innato e acquisito un sistema immunitario che sono co-evoluti un rapporto con le comunità batteriche commensali ^7. Azioni pelle di pesce molte caratteristiche con le superfici di tipo 1 mucose di mammiferi, come le funzioni fisiologiche, i componenti di immunità, e la disposizione delle cellule che producono muco ^8. La posizione esterna della superficie cutanea pesci mucosa offre microbiome facile da manipolare sperimentalmente e campione.

Il mosquitofish occidentale, affinis Gambusia affinis (G.), è un pesce modello che è stato usato in passato per lo studio dell'accoppiamento e tossicologia ^{9, 10, 11.} Data la piccola dimensione, numero di esemplari in natura come una specie invasiva, m costi di assistenza inimal, e la natura resistente, abbiamo sviluppato G. affinis come modello microbiome mucosa. Inoltre, Gambusia condividono la fisiologia del parto a vivere i giovani con i mammiferi vivipari, il che è raro in specie di pesci. Abbiamo completato il più ampio studio al momento della pelle di pesce microbiota normale utilizzando 16S profilatura con Gambusia ^12. Ulteriori lavori hanno dimostrato tre effetti negativi sulla serie seguenti interruzione della pelle e flora intestinale con un antibiotico ad ampio spettro ^13.

Cinque diversi effetti sono stati esaminati nel pesce dopo l'esposizione agli antibiotici. Il vantaggio ospite più consolidata del microbioma è esclusione competitiva di agenti patogeni. Il pesce patogeno Edwardsiella ictaluri è noto per provocare focolai di setticemia enterica in allevamenti di pesce gatto commerciali ^14. E. ictaluri è stato anche dimostrato di infettare mortalmente zebrafishclass = "xref"> ^{15, 16} e ¹⁷ Gambusia. Una sfida con questo patogeno dalla colonna d'acqua può servire come una misura di esclusione. Come confronto suscettibilità a un patogeno individuo, la sopravvivenza durante l'esposizione ad alta densità di organismi misti stata inoltre effettuata. Feci e organico ricco suolo sono stati utilizzati come fonti comunemente riscontrate delle comunità microbiche.

Un altro ruolo stabilito la comunità batterica intestinale svolge è l'elaborazione di nutrienti e di energia raccolta, influenzando così l'assorbimento nutrizionale generale per l'host. Come una misura lorda di alimentazione, il peso corporeo del pesce è stato confrontato prima e dopo un mese di essere alimentati con una dieta standard. pesce trattata con antibiotici come media ha perso peso, mentre i pesci di controllo, in media, ha guadagnato peso nel corso del mese. Il meccanismo di questa mancanza di aumento di peso non è chiaro. Una possibile fattore è il tempo di transito del cibo nell'intestino. A Moti GIMetodo lità è stato adattato da zebrafish (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicazione personale) per determinare il tempo di transito. Non è stato ancora determinato se pesci trattati con antibiotici hanno un tempo di transito alterato.

Una sfida comune vissuta in un ambiente naturale da parte di tutti gli organismi, in particolare il pesce, è lo stress osmotico. Gambusia hanno dimostrato di adattarsi rapidamente quando acutamente sottolineato in alte concentrazioni di salinità ^18. Sorprendentemente, pesce con un microbiome antibiotico-alterato esibito abbassato la sopravvivenza ad un elevato stress salino. Il meccanismo di questo romanzo fenotipo è sotto inchiesta. Un altro sforzo comune relativa agli animali acquatici, soprattutto in acquari, è forme tossiche di azoto (ammoniaca, nitrati, nitriti e). Survival contro nitrati non era significativamente differente tra trattata con antibiotici e controllo dei pesci. I metodi presentati in questo manoscritto possono essere utilizzati con Gambusia o simile modello pesci organismi, come zebrapesce e Medaka, per misurare fenotipi nel pesce seguenti manipolazione sperimentale.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in corso di approvazione dei protocolli IACUC, numerate 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, e 14-04-17-1018-3-01.

1. Animal Collection, manipolazione, e cura etico

1. Raccogliere Gambusia affinis dal sito campo (guida di identificazione a http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) utilizzando un piccolo tuffo rete e posto in 19 L secchi. Utilizzare ispezione visiva per identificare le specie.
2. pesce Riposo per 1 - 2 d in un secchio con acqua di stagno. In seguito, il trasferimento del pesce in 76 o 189 carri armati L acquario riempiti con acqua acqua di rubinetto metà stagno / mezza a 25 ° C, gassate con una pietra porosa bubbling. Utilizzare un piccolo tuffo rete durante la manipolazione di pesce come a disturbare minimamente la loro microbiome pelle.
   NOTA: la densità di pesce non deve essere superiore a 20 pesci / 38 l di acqua. I pesci sono acclimatati per l'acquario per almeno 5 d prima sperimentazione.
3. Mangiare pesce su un regime quotidiano con 5 mg di cibo in scaglie per pesci. Hopesce LD con un / 12 h ciclo buio 12 ore di luce.

2. Esposizione antibiotico iniziale per tutti gli esperimenti

1. Disegno tutti i pesci da ogni esperimento dallo stesso acquario, luogo in due gruppi separati (trattati: esposto a antibiotica e di controllo: non esposto) in 19 L secchi. i dati precedenti raccolti mostrano che i pesci nello stesso acquario hanno omogeneizzati microbiomes della pelle che hanno poco variazione nella composizione della comunità. ¹²
2. Durante gli esperimenti, mantenere i pesci in 2 litri di acqua del laghetto artificiale (PMU; 0,33 g / L CaCl _2, 0,33 g / L MgSO _4, 0,19 g / L NaHCO ₃₎ che viene sterilizzato in autoclave prima dell'uso.
3. Preparare il brodo soluzione antibiotica rifampicina con l'aggiunta di 50 mg / mL in dimetilsolfossido (DMSO). La rifampicina è un rappresentante antibiotico ad ampio spettro che non è tossico per i pesci. Negli esseri umani e topi, si distribuisce anche nei tessuti.
4. Dal magazzino rifampicina amministrare un finaleconcentrazione di 25 mg / mL in 2 L di PMU per esposizione ad antibiotici del gruppo pesci trattati per 3 giorni. Si noti che dopo 3 d, pelle coltivabili numeri batterica ritorno simile a quello della pelle di pesce pretrattati.
5. In parallelo, mantenere un gruppo di pesci non trattate, APW e dare una quantità equivalente di DMSO (0,5 mL per L di PMU) nella colonna d'acqua di agire come gruppo di controllo.
6. Come esperimenti sono destinati a misurare gli effetti di un microbiome antibiotico-modificata sulla fenotipi pesce, al fine di evitare effetti direttamente dal antibiotica, dopo l'esposizione di tre giorni antibiotico (o controllo) periodo, pesce trasferimento in un secchio con 2 L di APW fresco.
   1. Utilizzare un periodo di riposo 10 h così l'antibiotico viene rimosso dagli organi dei pesci. Base questa volta eliminazione su esperimenti dove i pesci sono stati esposti a 25 ug / ml di antibiotico per tre giorni. Eutanasia il pesce snipping midollo spinale seguita da enervazione, quindi omogeneizzare il tutto il corpo utilizzando una smerigliatrice tessuto.
   2. Determinare presenza antibiotico ponendo 50 ml di questa sospensione dopo 0,2 micron filtrazione al centro di una capsula di Petri agar. Fare un foro per la sospensione premendo un testa in giù sterile 200 microlitri punta della pipetta nel agar, che rimuove un piccolo plug.
   3. Utilizzare piastre di agar con 20 mL volume misurato di agar nutriente, e diffondere uniformemente usando un tampone di cotone con un indicatore organismo, Bacillus subtilis, che è sensibile alla rifampicina. Ottenere la B. subtilis da un agar nutritivo incubati a 25 ° CO / N e con il tampone di cotone per ottenere una colonia. Osservando una zona di inibizione dopo incubazione per una notte a 25 ° C indica la presenza di antibiotici nei tessuti dei pesci.

3. Microbiome Estrazione

1. Estrarre un campione microbiome pelle dall'epidermide mucose esterne mettendo il pesce in una sterile tubo da 15 ml riempita con 2 ml di PBST sterile (137 mm NaCl, 10 mM fosfato, 0,1% Tween-20, pH 7.4), soluzione e vortex ad una regolazione di 10 per 1 min con 10 s incrementi di pausa. Detergente e sale nel buffer promuove anche la dispersione di batteri in soluzione. Risultati comparabili sono stati trovati con il 0,85% di soluzione salina, ma abbassato conta batterica con acqua pura.
2. Trasferire il pesce dal tubo conico di un secchio di recupero. Letalità del estrazione di pelle è in genere inferiore al 10%. O, analizzare la sospensione batterica nel tubo immediatamente dopo estrazione o pellet batteri da un 2 min di spin in una centrifuga a temperatura ambiente a 15.000 xg e conservare a -80 ° C per le analisi future.
   NOTA: Tutta la cultura e le analisi biochimiche sono immediati; DNA o estrazione di proteine ​​possono essere da campioni congelati.
3. Per ottenere un campione intestino microbiome, il primo posto il pesce in una capsula di Petri sterile. Eutanasia il pesce da recidere il midollo spinale cervicale direttamente dietro la testa con le forbici chirurgiche, seguita da enervazione, E poi disinfettare esternamente al corpo 70% salviette etanolo.
4. Dopo la dissezione, rimuovere l'intero intestino tagliando dopo l'esofago e prima l'ano.
5. Tagliare l'intestino in piccole sezioni 1 - 2 mm di lunghezza e mettere tutte le sezioni in due mL di soluzione PBST in un tubo conico. Dopo vortex per 1 minuto, rimuovere il surnatante in un'altra provetta pulita (fare attenzione a non elaborare sezioni dell'intestino).
   NOTA: Il surnatante contiene batteri intestinali estratti che possono essere utilizzate sia per le analisi dirette o pellettato con il metodo precedente menzionato per campioni di pelle.

4. L'infezione preparazione del modello e bagno di un agente patogeno specifico

1. Ottenere un ceppo infettivo di Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) e mantenere la cultura conservati a -80 ° C. Strain 93-146 utilizzato in questo studio, isolata da un pesce gatto infetto, è stato ottenuto da Mark Lawrence, College di Medicina Veterinaria, Mississippi State University.
2. streak E. magazzino ictaluri su un terreno selettivo e differenziale chiamati E. ictaluri dei media (EIM) di agar ¹⁹ alla cultura i batteri e incubare per 2 d a 27 ° C.
3. Trasferire una colonia pura isolato dalla cultura e inoculare un pallone da 150 ml contenente 40 ml di brodo nutritivo (NB; 5 g / L peptone, 4 g / L estratto di carne). Inserire matraccio in un agitatore impostato a 150 rpm per 2 d a 27 ° C.
4. Dopo incubazione, diluire un campione della cultura in PBST ad una lettura spettrometro di 0,2 OD a 650 nm per calibrare E. cultura ictaluri per volumi dose infettante desiderati.
5. Trasferimento successivo sia trattata (dopo 3 d di esposizione agli antibiotici) e gruppi di pesci non trattati in singoli bicchieri di plastica contenenti 130 ml di acqua fresca laghetto artificiale, o APW per circa 10 h per clearance del farmaco nei tessuti dei pesci.
6. Poi da entrambi i gruppi, trasferire di nuovo ogni pesce in bicchieri di plastica da 8 once contenenti 130 ml di PMU pulito.
7. Dare ad ogni pesce una dose letale contenente 2,8 x 10 ⁶ CFU / ml di E. cultura ictaluri nella PMU (bagno modello di infezione) e tenere in un incubatore a 27 ° per 24 ore.
8. Dopo il bagno E. ictaluri, trasferire il pesce singolarmente in nuove tazze con 130 ml di PMU.
9. Dopo la sostituzione di acqua, record di pesce mortalità per tutta la durata di una settimana. I pesci non sono alimentati in questo periodo. In contrasto pesce gatto, Gambusia non mostrano segni esterni di infezione, quindi è indispensabile utilizzare letalità come endpoint sperimentale.

5. polimicrobiche sfida con le feci e del suolo

1. Trattamento feci
   1. Ottenere feci umane fresche da un volontario sano soggetto che non ha ricevuto antibiotici nelle precedenti due settimane, usando guanti sterili e sterili tubo da 50 ml.
   2. Al momento la raccolta, raccogliere materia fecale in un sacchetto di plastica sterile e poi trasferire in una sterile 15 ml ctubo onical. Creare una concentrazione magazzino sospendendo feci in PBST per dare una soluzione stock di 500 - 800 mg / mL. Questa miscela di spessore è migliore per trasferire utilizzando un 1 mL o maggiore puntale in plastica che è stato tagliato in basso con forbici sterili modo che l'apertura è più grande.
   3. Dopo l'esposizione antibiotico iniziale di gruppi di pesci non trattati trattati e di controllo, separato in singoli bicchieri di plastica contenenti sospensione fecale a concentrazioni finali di ciascuna 15 mg / ml o 10 mg / mL in PMU con un volume totale di 130 mL. Tenere tazze in un incubatore a 25 ° C.
   4. mortalità dei pesci di registrazione durante l'esposizione fecale da un'attenta osservazione su 2 d.
2. trattamento del suolo
   1. Raccogliere 1 - 2 kg di ricco terriccio organico (dovrebbe contenere la più alta densità e la diversità dei microbi) circa 7 - 15 cm verso il basso in modo approfondito e mettere in un contenitore di plastica pulito. Si noti che il terreno deve essere utilizzato entro due giorni seguenti la raccolta.
   2. terribilectly dopo il periodo di esposizione iniziale, separare i due gruppi di antibiotici trattati e pesce non trattati in singoli bicchieri di plastica contenenti 18,2 g di terreno in 130 ml di PMU. Mescolare il suolo nel pozzo a mano prima di aggiungere il pesce. La maggior parte del particolato non sospendono e rimanere sul fondo della tazza.
   3. Esporre pesce per una durata di 3 d a 25 ° C e registrare qualsiasi mortalità.

6. Sfida stress osmotico

1. Dopo il trattamento, seguito da un periodo di 10 h come descritto sopra, individuare pesci nelle tazze separate contenenti NaCl a 17,5 mg / ml (300 mM) in 150 mL di PMU. Questa è la metà della tipica salinità dell'acqua di mare, che non è pienamente letale (<50%) per controllare pesce, ma è fortemente stressante, richiedendo osmoregulation efficace.
2. Osservare per la mortalità nel corso di un periodo di 36 h.

7. nitrato Tossicità Sfida

1. pesce riposo per un periodo di 10 ore dopo esposizioni antibioticiure, e pesce quindi separata nelle tazze individuali contenenti una concentrazione di nitrato di sodio di 10 mg / mL (118 mM) o 17,5 mg / ml (206 mM) in 130 mL di PMU.
2. Record per la mortalità oltre 4 d per basse dosi e 1 d per alta dose.

8. Analisi crescita dei pesci individualizzato o raggruppati

1. Completa 3 d esposizione agli antibiotici o di controllo periodo come gruppi in secchi.
2. Per i singoli, riempire 8-oz tazze di polistirolo con 150 mL APW ciascuna, trasferire un singolo pesce nella tazza e registrare il peso corporeo totale per la valutazione iniziale.
   1. Ripetere l'operazione per tutti i pesci in entrambi i gruppi trattati e non trattati. Utilizzare tazze di polistirolo bianche invece di bicchieri di plastica trasparente perché i pesci non mangiare quando nelle tazze chiare.
3. Mangiare pesce ogni giorno con la dieta standard di due pellet per pesci. I pellet sono stati utilizzati, piuttosto che i fiocchi perché pellet hanno una bassa varianza di massa individuale (3,53 ± 0,42 mg ciascuna, o 8% di variazione), resulting di pesce ricevere simili quantità di cibo. Monitorare il consumo registrando visivamente pellet non consumati. tassi di consumo erano tipicamente superiore all'80%.
4. Alla fine di ogni settimana per 4 settimane, determinare il peso del pesce. Preparare una nuova tazza con fresco PMU, posto su una bilancia, e quindi registrare il peso. Poi, versare un pesce in una rete tuffo dalla coppa originale e trasferire nella nuova tazza, che viene poi nuovamente pesati. I pesci non sono gestite per evitare lo stress.
5. Per i gruppi, porre 2 L di PMU in un 19 L secchio e tarare la bilancia. Mantenere pesce insieme in entrambi i gruppi durante il trasferimento in nuove secchi APW quindi registrare il peso totale del gruppo. Record di peso gruppo di pesce ogni settimana per un arco di tempo il mese con il trasferimento ad un nuovo secchio.

9. Gut Tempo di transito

1. Utilizzare marcato con fluoresceina 70 kDa destrano anionico. Destrano non è significativamente digerito, ed è troppo grande per essere assorbito attraverso lo strato intestino, quindi passare misurerà il tempo di transito attraverso l'intestino.destrano etichettato è stato incorporato nel cibo per pesci.
2. In una sterile 1.7 ml, aggiungere 360 ​​ml di acqua deionizzata sterile e 52 mg di gelatina (soluzione al 13%), e posizionare il tubo su un blocco di calore a 60 ° C fino a quando si scioglie gelatina ed è completamente sciolta.
   1. Macinare fiocchi alimentari pesci rossi ad una polvere fine con un mortaio e pestello e aggiungere 40 mg di questa polvere al tubo, insieme a 20 ml di olio di pesce. Dopo la miscelazione, aggiungere 1,6 mg di FITC-destrano.
3. Versare il composto liquido caldo in 20 microlitri cade sul Parafilm sul banco di laboratorio, e lasciarli raffreddare velocemente e solidificare. Gocce possono essere conservati per un massimo di 4 d prima che diventino troppo difficile per i pesci da mangiare. Conservare gocce in frigorifero posizionando il Parafilm su metà di una capsula di Petri, che viene poi quotata in acqua sterile in un contenitore di plastica sigillato, che mantiene le gocce umidificate.
4. Poco prima di alimentazione, quarto scende in sezioni utilizzando una lama di rasoio. Acclimatare il pesce al Styroschiuma tazze individualmente per 2 giorni senza alimentazione (Nota: solo pesce di controllo non esposti sono stati utilizzati). Mettere quattro quarti del cibo nella tazza con il pesce, ed osservare il pesce per 30 minuti per quanti pezzi del cibo che mangiano ogni.
5. Per iniziare il periodo di monitoraggio, il trasferimento del pesce individualmente nelle tazze con 80 ml di APW utilizzando una rete di tuffo. Ogni 2 ore, miscelare delicatamente il PMU a mano, e poi prendere un campione e negozio di 1 ml in un tubo di 1,7 ml etichettata a 4 ° C. Prelevare campioni per 36 ore.
6. Record fluorescenza, con uno spettrofotometro a fluorescenza, di tutti i campioni allo stesso tempo dopo il completamento del test. Posizionare l'intero campione 1 ml in una provetta, e registrare la fluorescenza misurata con eccitazione a 495 nm ed emissione a 520 nm.

Risultati

Un diagramma schematico generale del sistema sperimentale utilizzato per studiare gli effetti ospitanti pesci da esposizione ad antibiotici ¹³ è rappresentata nella Figura 1A e comprende la tecnica per estrarre la pelle (Figura 1B) e dell'intestino (Figura 1C) microbiomes dal pesce. Tre giorni è stato selezionato come il periodo di esposizione agli antibiotici, perché dati precedenti rivela che, mentre il n...

Discussione

Alcune sfide richiedono un periodo di riposo in PMU pulita dopo il trattamento antibiotico per il farmaco ad esaurirsi nei tessuti dei pesci. Se viene saltato il periodo di riposo poi presenza antibiotico può confondere i risultati, soprattutto quando il saggio comporta l'esposizione ai batteri. Al fine di esaminare gli effetti di una composizione microbiome alterato senza grandi variazioni nel numero totale di microbi sul padrone di casa, esperimenti preliminari monitoraggio della composizione microbiome (16S prof...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
Sodium Nitrate	Sigma Aldrich	S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran	ThermoFisher Scientific	D1823
Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets	Calbiochem	6500-OP	tablets dissolve in water to make PBS