호스트 표현형의 시험에<em&gt; Gambusia의 affinis입니다</em&gt; 다음은 항생제 치료

요약

이 연구는 항생제에 의해 피부와 장내 마이크로 바이 옴의 사회 구성의 변경 다음 모델 물고기 호스트에 효과를 나타 내기 위해 방법을 포함한다.

초록

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

서문

이 항생제는 미생물 지역 사회의 불균형을 의미 dysbiosis로 이어지는 인간 마이크로 바이 옴을 방해 할 수 설립되었습니다. 항생제 치료 후 미생물의 조성 변화, 특히 장 ^{1, 2,} 지역 사회의 다양성을 낮출 키 회원을 줄이고, 지역 사회의 신진 대사를 변경하는 것으로 나타났다. 장내 마이크로 바이 옴의 항생제 방해는 클로스 트리 디움 디피 ^{3, 4,} 살모넬라 ⁵ 식민지 저항을 줄일 수 있습니다.

또한, 미생물의 파괴는 많은 신드롬 및 인간 질환의 발전에 연결되어있다 (예를 들면, 항생제 관련 장염, 염증성 장 질환, 대사 질환, 등.). 항생제가 널리 성장 촉진제로 농업 구현가축 및 가금류 생산 ^6. 이러한 강력한 도구의 사용은 항생제 내성의 급속한 상승뿐만 아니라 마이크로 바이 교란의 효과는 명백하다 거주 된 호스트 갖는 부수적 효과가없는 것은 아니다. 많은 연구가 광범위 항생제 사용이 장시간 동안 지속 미생물의 구조와 기능에 영향 아직 항생제 파괴 마이크로 바이 영향 호스트 생리학에서 부작용되어지지되도록 아직만을 추측이 있는지 보여준다.

호스트, 미생물, 항생제 사이의 상호 작용은 간결한 방식으로 이해되는 거리가 멀다. 따라서, 간단하고 더 다루기 쉬운 모델은 복잡한 포유류 시스템에서 빛을 발산하는 것이 유리하다. 장내 포함한 인체 점막 표면은 또한 높은 밀도 및 미생물의 다양성, 및 가장 친밀한 미생물 숙주 상호 항구. 물고기 이벤트 (S)의 점막 피부 마이크로 바이 옴모델 시스템으로 everal 장점. 진골 어류 (뼈 물고기) 경골 어류는 모두 타고난를 가지고 공생 세균 지역 사회 ^(7)과의 관계를 공동 진화 면역 체계를 인수하는 척추 동물의 의미 내에서 분기 할 수있는 최초의 계보 중 하나입니다. 물고기 피부 공유 등의 생리 기능, 면역 구성 요소 및 점액 생산 세포 ^(8)의 배치와 같은 포유 동물의 종류 1 점막 표면, 많은 특징. 물고기 피부 점막 표면의 외부 위치는 실험적으로 조작하기 쉽고 샘플 마이크로 바이 옴을 제공합니다.

서부 mosquitofish, Gambusia의 affinis입니다 (G. affinis입니다)를 결합 및 독성 ^{9, 10, 11을} 공부 과거에 사용 된 모델 물고기입니다. 침입 종으로 야생에서 작은 크기, 인구 풍부을 감안할 때, m inimal 관리 비용, 성의 자연, 우리는 점막 마이크로 바이 옴 모델로 G. affinis입니다을 개발했다. 또한, Gambusia 물고기 종의 드문 태생 포유류, 젊은 살고 출산의 생리를 공유 할 수 있습니다. 우리는 Gambusia ¹² 프로파일 16S를 사용하여 물고기 피부에 정상 미생물의 시점에서 가장 광범위한 연구를 완료했다. 또한 작품은 피부와 장내 미생물의 중단 넓은 스펙트럼 ⁽¹³⁾ 항생제를 사용하여 다음 호스트에 세 가지 부정적인 영향을 보여 주었다.

다섯 가지 효과는 항생제에 노출 된 후 물고기에 조사 하였다. 마이크로 바이 옴의 가장 잘 설립 된 호스트의 이점은 병원균의 경쟁 제외입니다. 물고기 병원균 인 Edwardsiella의 ictaluri는 상업적인 메기 양식장 ¹⁴ 장 패혈증의 발생을 일으키는 것으로 알려져있다. E. ictaluri은 제브라 치명적 감염을 보였다클래스 = "외부 참조"> ^{15, 16,} Gambusia ^17. 물 열에서이 병원체가있는 문제는 배제의 기준 역할을 할 수 있습니다. 개별 병원체에 대한 감수성에 비교 된 바와 같이, 혼합 된 미생물의 고밀도에 노출시 생존도 행했다. 대변 ​​및 유기 풍부한 토양 미생물 사회의 일반적 발생 소스로 사용 하였다.

장내 세균 커뮤니티가 수행하는 또 다른 역할은 확립 따라서 호스트에 대한 전체적인 영양 섭취에 영향을 양분 처리 에너지 수확이다. 영양의 총 측정으로, 물고기 체중은 표준 식단을 공급되는 한 달 전, 후 비교 하였다. 평균적으로 제어 물고기는 달 체중이 증가하면서 평균 체중 감량으로 물고기를 항생제 처리. 체중 증가의 결여의 메카니즘은 불분명하다. 한 가지 요인은 창자에서 음식의 통과 시간입니다. GI의 모티lity 방법은 전송 시간을 결정하는 제브라 피쉬 (아담 리치, SUNY 브록 포트, 개인 통신)에서 적응했다. 항생제 처리 물고기가 변경된 통과 시간이있는 경우는 아직 결정되지 않았습니다.

모든 생물체, 특히 어류에 의해 자연 환경에서 경험하는 일반적인 문제는 삼투압 스트레스입니다. Gambusia은 급성 염분 ^(18)의 높은 농도로 강조 할 때 신속하게 적응하는 것으로 나타났다. 놀랍게도, 전시 항생제 변경 마이크로 바이 옴 물고기는 높은 소금 스트레스 생존을 낮췄다. 이 소설 표현형에 대한 메커니즘을 조사 중입니다. 특히 수조 수생 동물에 다른 일반적인 스트레스 독성 형태 질소 (암모니아, 질산염, 아질산염)이다. 질산에 대한 생존 항생제 처리 및 제어 물고기 사이에 유의 한 차이가 있었다. 이 논문에서 제시 한 방법은 이러한 제브라 같은 Gambusia 또는 유사한 물고기 모델 유기체로 사용될 수있다물고기와 송사리는 실험 조작 다음과 물고기의 표현형을 측정합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은, IACUC 프로토콜의 승인하에 수행, 14-05-05-1018-3-01 13-04-29-1018-3-01 및 14-04-17-1018-3-01 번호가되었다.

1. 동물 수집, 처리, 및 윤리 관리

1. 19 L 버킷에 작은 딥 그물과 장소를 사용하여 필드 사이트 (http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm에서 식별 가이드)에서 Gambusia affinis입니다를 수집합니다. 종을 식별하기 위해 육안 검사를 사용합니다.
2. 연못 물을 양동이에 2 일 - 1 나머지 물고기. 그 후, 버블 링 airstone와 포 25 ° C에서 절반 연못 물 / 반 수돗물 가득 76 또는 189 L 수족관 탱크에 물고기를 전송합니다. 최소한 자신의 피부 마이크로 바이 옴을 방해으로 물고기를 처리 할 때 작은 딥 그물을 사용합니다.
   참고 : 물고기의 밀도는 20 생선 / 수족관 물 38 L보다 높을 수 없습니다. 물고기는 실험 전에 적어도 5 일 동안 수족관에 적응하고 있습니다.
3. 물고기 당 플레이크 음식의 5 밀리그램과 매일식이 요법에 물고기를 먹이. 호12 시간 조명 / 12 시간 다크 사이클 LD 물고기.

모든 실험 2. 초기 항생제 노출

1. 같은 수족관에서 각 실험에서 모든 물고기 그리기, 두 개의 그룹으로 배치 (처리 : 노출 항생제 및 제어 : 노출되지 않은) 19 L 버킷있다. 이전 데이터는 같은 수족관에 물고기가 지역 사회 조성에 약간의 변화가 피부 microbiomes을 균질화 한 것을 쇼를 모았다. ⁽¹²⁾
2. 실험을하는 동안, 인공 연못 물 2 L 물고기를 유지 (APW, 0.33 g / L 염화칼슘 _2, 0.33 g / L _황산 0.19 g / _{L의 NaHCO3)} 사용 전에 고압 증기 멸균 소독한다.
3. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 50 ㎎ / ㎖를 첨가하여 리팜피신 항생제 스톡 용액을 제조 하였다. 리팜피신은 물고기에 독성이 대표 광범위 항생제이다. 인간과 쥐에서는 조직에서 잘 분배한다.
4. 리팜피신 재고에서 최종 관리3 일간 처리 된 물고기 그룹의 항생제 노출 APW의 2 L에 25 μg의 / mL의 농도. 3 일 후, 배양 피부 세균 수는 전처리 물고기의 피부와 유사한 반환합니다.
5. 병행하여, APW에서 미처리 물고기의 그룹을 유지하고 대조군 역할을 수층으로 DMSO의 당량 (APW의 L 당 0.5 ml)에 제공한다.
6. 실험은 2 L 양동이에 사흘 항생제 노출 (또는 제어)주기, 전송 물고기 다음, 항생제 자체에서 직접 영향을 피하기 위하여, 어류의 표현형에 항생제 변경 마이크로 바이 효과를 측정하도록 구성되기 때문에 신선한 APW.
   1. 항생제는 물고기의 몸에 의해 제거되도록 10 시간의 휴식 기간을 사용합니다. 자료 물고기가 사흘 동안 항생제의 25 μg의 / mL의에 노출 된 실험에서이 제거 시간. pithing 다음 척수로 자르는 것은 물고기를 안락사 후 조직 분쇄기를 사용하여 전신 균질화.
   2. 한천 배양 접시의 중심으로 0.2 μm의 필터링 한 후이 현탁액 50 μL을 배치하여 항생제의 존재를 확인합니다. 작은 플러그를 제거 한천로 멸균 200 μL 피펫 팁을 거꾸로 아래로 눌러이 서스펜션에 대한 구멍을 확인합니다.
   3. 영양 한천의 20 mL를 측정 볼륨 한천 플레이트를 사용하고, 리팜피신에 민감한 지표 생물, 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)과 면봉을 사용하여 균일하게 확산. 25 ° CO / N에서 배양 영양 한천에서 B. 서브 틸리 스를 확보하고 면봉을 사용하여 식민지를 얻었다. 25 ° C에서 하룻밤 배양 한 후 억제의 영역을 관찰하면 물고기 조직에서 항생제의 존재를 나타냅니다.

3. 마이크로 바이 옴 추출

1. 2 mL의 멸균 PBST (137 밀리미터 나 가득 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 물고기를 배치하여 외부 점막 표피에서 피부 마이크로 바이 옴 샘플을 추출10 초 일시 중지 단위로 1 분 동안 10의 설정에서 CL, 10 mM의 인산, 0.1 % 트윈 20, pH를 7.4) 솔루션 및 텍싱. 버퍼에 세제와 소금 용액에서 박테리아의 균일 분산을 촉진한다. 비교 결과는 0.85 %의 식염수로 찾았지만 순수한 물과 세균 수를 감소했다.
2. 복구 양동이에 원뿔 튜브에서 물고기를 전송합니다. 피부 적출의 치사율은 일반적으로 10 % 미만이다. 어느 즉시 추출시 튜브 내의 세균 현탁액을 분석 또는 미래의 분석을 위해 -80 ℃에서 15,000 × g으로 저장 실온에서 원심 분리기에서 2 분간 회전하여 세균 펠렛.
   참고 : 모든 문화와 생화학 적 분석은 즉시이다; DNA 또는 단백질 추출 냉동 샘플에서 할 수있다.
3. 첫 번째 멸균 페트리 접시에 물고기를 배치하는 장내 마이크로 바이 옴 샘플을 구하십시오. pithing 다음, 수술 가위로 머리 바로 뒤에 자궁 경부 척수를 절단하여 물고기를 안락사다음 외부 70 % 에탄올 잎사귀로 몸을 소독.
4. 해부 후 식도 후 항문 전에 절단하여 전체 창자를 제거합니다.
5. 길이 2mm 및 원뿔 튜브에 두 mL의 PBST의 솔루션으로 모든 섹션을 배치 - 작은 섹션으로 1 창자를 잘라. 1 분 동안 텍싱 후, (창자 섹션을 작성하지에주의을) 다른 깨끗한 튜브에 뜨는을 제거합니다.
   참고 : 상등액 중 피부 샘플에 대한 언급 이전 방법에 의해 직접 분석에 사용 또는 펠렛 할 수 있습니다 추출 장내 세균이 포함되어 있습니다.

특정 병원체 4. 감염 모델 준비 및 목욕

1. 인 Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri)의 감염 균주를 확보하고 -80 ° C에서 보관 문화를 유지한다. 스트레인 93 - 감염된 메기로부터 고립 된이 연구에 사용 된 146, 마크 로렌스, 동물 용 의약품의 대학, 미시시피 주립 대학에서 얻었다.
2. 헤어 구조 강화박테리아 문화 ⁽¹⁹⁾ 한천 E. ictaluri 미디어 (EIM)라는 선택적 및 차동 미디어와 27 ° C에서 2 일 동안 배양에 AK E. ictaluri 재고.
3. 문화에서 순수한 고립 식민지를 전송하고 영양 배지 40 mL를 함유하는 150 mL의 플라스크에 접종 (NB를, 5g / L의 펩톤, 4g / L 쇠고기 추출물). 27 ° C에서 2 일 동안 150 rpm으로 설정 통에 넣어 플라스크.
4. 배양 후, 원하는 감염 투여 볼륨 E. ictaluri 문화를 보정하는 650 nm에서 0.2 OD의 분광계 읽기에 PBST에서 문화의 샘플을 희석.
5. 다음 전송을 모두 처리 물고기 조직에서 의약품 허가를위한 약 10 시간 동안 130 신선한 인공 연못의 물 용액, 또는 APW를 포함하는 개별 플라스틱 컵에와 치료 물고기 그룹 (항생제 노출의 3 일 후).
6. 그런 다음 두 그룹 모두에서 깨끗하고 APW 130 mL로 포함 8 온스 플라스틱 컵에 다시 각각의 물고기를 전송합니다.
7. 각 물고기에게 APW에 E. ictaluri 문화의 2.8 × ¹⁰⁶ CFU / ㎖ (목욕 감염 모델)를 포함하는 치사량을 지정하고 24 시간 동안 27 ° C 배양기에서 유지.
8. E. ictaluri 목욕 후, APW 130 mL로 새로운 컵에 개별적으로 물고기를 전송합니다.
9. 물 교체, 일주일의 기간에 걸쳐 기록 물고기 사망률 다음과 같습니다. 물고기는이 기간 동안 공급되지 않습니다. 메기 달리 Gambusia 따라서는 실험적 포인트로 치사를 사용하는 것이 필수적이며, 외부 감염의 징후를 표시하지 않는다.

대변 ​​및 토양 5. Polymicrobial 도전

1. 배설물 처리
   1. 멸균 장갑과 멸균 50 ML 원뿔 튜브를 사용하여 이전 2 주 동안 항생제를받지 못한 건강한 자원 봉사 대상에서 신선한 인간의 배설물을 얻습니다.
   2. 수령시, 멸균 비닐 봉지에 대변을 수집 한 후 멸균 15 ML의 C로 전송onical 튜브. 800 ㎎ / ㎖ - 500의 재고 솔루션을 제공하기 위해 PBST에 대변을 중단함으로써 주식 농도를 만듭니다. 이 혼합물을 두께 개구부가 커지도록 멸균 가위 하부 절단 된 1 mL의 이상 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 전송할 최상이다.
   3. 처리 및 제어 미처리 생선 기의 초기 항생제 노출시킨 후, 130 mL의 총 부피로 APW 중 15 ㎎ / ㎖, 10 ㎎ / ㎖의 최종 농도에서 배설물 현탁액을 함유하는 개별 플라스틱 컵으로 분리한다. 25 ° C에서 인큐베이터에 컵을 개최합니다.
   4. 2 일 이상 경과 관찰에 의해 대변 노출되는 동안 기록 물고기 사망률.
2. 토양 처리
   1. 풍부한 유기 표토의 2kg (미생물의 높은 밀도와 다양성을 포함한다) 약 7 - 1 - 수집 15cm 아래로 깊이 깨끗한 플라스틱 용기에 넣습니다. 토양이 모음 다음과 같은 두 가지 일 이내에 사용해야합니다.
   2. 무서운ctly 초기 노출 기간 후에, APW 130 ㎖의 토양의 18.2 g을 포함하는 개인 플라스틱 컵에 항생제 치료와 치료 물고기의 두 그룹을 구분합니다. 물고기를 추가하기 전에 손으로 우물에서 토양을 섞는다. 미립자의 대부분은 일시 중단과 컵의 하단에 머물하지 않습니다.
   3. 25 ° C에서 3 일의 기간 동안 물고기를 노출하고 사망률을 기록합니다.

6. 삼투압 스트레스 도전

1. 상술 한 바와 같이 10 시간 휴식 기간 뒤에 처리 후, APW 150 mL의 17.5 ㎎ / ㎖ (300 밀리미터)에 NaCl을 함유하는 별도의 컵에 물고기를 개별화. 이 생선을 제어 완전히 치명적인없는 해수의 염도 통상 (<50 %)의 절반이지만 삼투 효과를 필요 강한 스트레스.
2. 36 시간의 기간에 걸쳐 물고기 사망률에 대한 관찰한다.

7. 질산 독성 도전

1. 항생제 박람회 후 10 시간 동안 나머지 물고기의 질산 나트륨 농도를 함유하는 개개의 컵에 URE 후 별도 생선 중 10 ㎎ / ㎖ (118 mM)을하거나 APW 130 ㎖의 17.5 ㎎ / ㎖ (206 mm)이다.
2. 저용량에 대한 사망률 4 위에 D와 고용량 1 D 녹음.

개별 또는 그룹화 물고기 8. 성장 분석

1. 버킷의 그룹으로 완료 3 일 항생제 노출 또는 제어 기간.
2. 개인의 경우, 150 mL의 APW 각각 8 온스 스티로폼 컵을 채우기 컵에 개별 물고기를 전송하고 초기 평가를 위해 총 체중을 기록한다.
   1. 모두 치료 및 치료 그룹의 모든 물고기를 반복합니다. 때 투명 컵에 물고기가 먹을 수 없기 때문에 대신에 투명한 플라스틱 컵 흰색 스티로폼 컵을 사용합니다.
3. 물고기 당 두 개의 펠릿의 표준 식단과 함께 매일 물고기를 먹이. 펠릿 개별 질량 낮은 분산 (3.53 ± 0.42 mg을 각각 8 %의 변동) resultin 있기 때문에 펠렛 플레이크 대신 사용했다음식의 비슷한 금액을받는 물고기 g. 시각적으로 먹지 알약을 기록하여 소비를 모니터링합니다. 소비 비율은 80 % 이상 일반적이었다.
4. 사주 위에 각각 주말에, 생선의 무게를 결정한다. 신선한 APW와 함께 새로운 컵을 준비 균형에 배치 한 다음 무게를 기록한다. 그런 다음, 원래 컵에서 딥 그물로 물고기를 부어 다시 칭량 새로운 컵으로 전송합니다. 물고기는 스트레스를 방지하기 위해 처리되지 않습니다.
5. 그룹의 경우, 19 L 양동이에 APW의 2 L를 배치하고 규모를 용기를. 다음 전체 그룹의 체중을 기록 새로운 APW 버킷로 전송할 때 두 군 모두에서 함께 물고기를 유지합니다. 기록 물고기 그룹의 무게 새로운 버킷에 전송하여 한 달의 시간 범위에 걸쳐 매주.

9. 굿 환승 시간

1. 형광 표지 된 70 kDa의 음이온 덱스 트란을 사용합니다. 덱스 트란 분해 크게하고 장내 층에 걸쳐 흡수하기에 너무 큰 것은 아니며, 따라서, 통로는 소화관을 통해 통과 시간을 측정한다.레이블이 덱스 트란은 물고기 음식에 통합되었다.
2. 멸균 된 1.7 ㎖의 튜브에 멸균 증류수 360 μL 젤라틴 52 밀리그램 (13 % 용액)을 첨가하고 배치 튜브를 60 ° C 열 블록 젤라틴하고, 녹을 때까지 완전히 용해시킨다.
   1. 박격포와 유 봉 및 생선 기름의 20 μL와 함께 관이 분말 40 mg의 추가를 사용하여 미세 분말로 분쇄 금붕어 음식 부스러기. 혼합 한 후, FITC - 덱스 트란의 1.6 mg을 추가합니다.
3. μL 실험실 벤치에 파라 필름에 방울 (20)에 뜨거운 액체 혼합물을 분배하고,이를 신속하게 시원하고 공고히 할 수 있습니다. 그들은 너무 열심히 물고기를 먹을 수되기 전에 상품은 최대 4 일 동안 저장 될 수있다. 스토어는 가습 방울을 유지하는 밀봉 된 플라스틱 용기 내부에 멸균 물에 부유 배양 접시의 반 상 파라 필름을 배치하여 냉장고에 삭제합니다.
4. 그냥 공급하기 전에, 분기 면도날을 사용하여 섹션으로 떨어진다. Styro에 물고기를 적응공급없이 개별적으로 2 일간 거품 컵 (참고 : 노출되지 않은 제어 물고기가 사용되었다). 물고기와 컵에 음식의 사방을 배치하고 각 먹는 음식의 얼마나 많은 조각이 30 분 동안 물고기를 관찰합니다.
5. 모니터링 기간을 시작 딥 그물을 사용하여 APW의 80 mL의 컵에 개별적으로 물고기를 전송합니다. 모든 2 시간은 부드럽게 손으로 APW 소용돌이, 다음 4 ° C에서 레이블 1.7 ML의 튜브에 1 mL의 샘플 및 저장을. 36 시간 동안 샘플을 가져 가라.
6. 분석 종료 후 동시에 모든 샘플의 형광 분광 광도계로 기록 형광. 큐벳으로 전체 1 ML의 샘플을 배치하고 520 nm에서 495 nm에서 여기 및 방출을 사용하여 측정 된 형광을 기록한다.

결과

항생제 노출 ¹³ 생선 호스트 효과를 연구하기 위해 사용 된 실험 시스템의 전체 개략도는도 1a에 나타낸 물고기으로부터 피부 (도 1b) 및 장 (도 1C) microbiomes를 추출하기위한 기술을 포함한다. 이전 데이터는 전체 피부 배양 수는 초기 치료에 drops 동안, 그것은 3 일 후 수준으로 처리 사전에 반환 된 것을 알 수 있기 때?...

토론

일부 문제는 약물이 물고기 조직에서 고갈 될 항생제 치료 후 깨끗한 APW의 휴식 기간이 필요합니다. 나머지 기간은 스킵 경우 항생제 존재는 분석이 세균에 대한 노출을 수반 특히 결과를 혼동 할 수있다. 것 항생제 노광시 호스트 예비 실험 모니터링 마이크로 바이 조성물 (16S 프로파일 또는 총 유전체) 인구 밀도 (qPCR을 통해 16S 정량)의 미생물의 수의 큰 변화없이 변경된 마이크로 바이 조성물의...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
Sodium Nitrate	Sigma Aldrich	S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran	ThermoFisher Scientific	D1823
Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets	Calbiochem	6500-OP	tablets dissolve in water to make PBS