Количественная оценка подвижности эндосомы и лизосом в культивируемых нейронах с помощью флуоресцентных зондов

Резюме

Исследование переноса мембран имеет решающее значение для понимания функций нейронов. Здесь мы вводим метод количественного определения везикулярной подвижности в нейронах. Это удобный метод, который может быть адаптирован к количественной оценке переноса мембраны в нервной системе.

Аннотация

В мозге системы переноса мембран играют важную роль в регулировании нейронных функций, таких как морфология нейронов, синаптичная пластичность, выживаемость и глиальные коммуникации. На сегодняшний день в многочисленных исследованиях сообщается, что дефекты в этих системах вызывают различные нейрональные заболевания. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе динамики везикулы, может дать важные указания, которые могли бы помочь в лечении нескольких нейрональных нарушений. Здесь мы описываем метод количественной оценки везикулярных подвижностей, таких как дистанция подвижности и скорость движения, используя программный плагин для платформы ImageJ. Чтобы получить изображения для количественной оценки, мы пометили нейронные структуры эндосомно-лизосомы с EGFP-меченными везикулярными маркерными белками и наблюдали движение везикул с помощью микроскопии с интервалом времени. Этот метод очень полезен и упрощает измерение подвижности везикул в нейритах, таких как аксоны и дендриты, а также в соме как нейронов, так и глиальных клеток. FurthermoRe, этот метод может быть применен к другим клеточным линиям, таким как фибробласты и эндотелиальные клетки. Такой подход мог бы стать ценным прогрессом в нашем понимании переноса мембран.

Введение

Точный контроль за оборотом эндосомных лизосом необходим для регуляции функции нейронов. Примечательно, что динамические движения этих везикул являются ключевым фактором, регулирующим морфологию, развитие и выживаемость нейронов. Дефекты в этой системе вызывают тяжелые нейрональные нарушения ^{1 , 2} . Молекулярные механизмы, связывающие перенос везикул с заболеваниями нейронов, считаются сложными, и несколько групп пытались изучить эту актуальность. Например, сообщалось, что нарушенная подвижность концевых эндосом значительно связана с болезнью Ниманна-Пика С ³ , наследственным нейродегенеративным расстройством, вызванным дефектами лизосомы. Другим примером является мутация в лизосомальном канале Ca ²⁺ , trpml 1, который нарушает лизосомальную подвижность, приводя к лизосомальным заболеваниям ^{4 , 5 , 6} . Наша группа сообщила, что дисрегуляция оборота PtdIns (3,5) P ₂ подавляет эндосому и подвижность лизосом в нейронах, что приводит к увеличению уязвимости к стрессовому ответу ^7,8 . Метаболическая регуляция PtdIns (3,5) P ₂ , которая главным образом локализуется на поздних эндосомах и лизосомах, играет важную роль в широком спектре клеточных функций, включая торможение пузырьков и процессы деления слиянием-делением ^{9 , 10} . Так как нарушение PtdIns (3,5) P ₂ вызывает тяжелую нейродегенерацию ^{11 , 12} , аберрантная регуляция подвижности эндосом-лизосом может быть ключевым фактором для понимания патогенеза нейродегенерации. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе везикулярной подвижности, может, таким образом, давать многообещающие подсказки, которые могут углубить наше undeВыявление нескольких нейрональных нарушений.

В этой статье мы представляем ценный метод для количественной оценки везикулярной подвижности в нейронах с использованием пакета бесплатного программного обеспечения под названием «Ручное отслеживание». Целью было разработать метод быстрого количественного анализа подвижности везикул. Эта количественная оценка направлена ​​с использованием стандартного подхода при нажатии на опорную точку в каждом кадре видеоролика с замедленным воспроизведением. Использование программного обеспечения для ручного отслеживания делает этот подход довольно простым и имеет широкую функциональность, в отличие от других приложений. Кроме того, этот подход также применим к другим клеткам, таким как глиальные клетки. Хотя этот метод примитивен, его можно применять для различных анализов, в том числе в отношении подвижности клеток и морфологических изменений. Например, после определения опорной точки по последовательности изображений информация о положениях опорных точек и времени в каждой позиции может быть извлечена из последовательных изображений, используя анализ данных и мягкую обработку изображенийпосуда. В совокупности этот метод прост, но эффективен и способствует повышению эффективности исследований, основанных на переносе мембран, таких как исследование функции эндосомы-лизосомы.

протокол

Все процедуры на животных были проведены с согласия Комитета по уходу и использованию животных Университета Цукуба (IACUC).

1. Препарирование

1. Чтобы подготовить эмбриональный день 13-14 ICR или C57BL / 6 эмбрионы, усыпить беременных мышей путем вывиха шейки матки. Удалите матку и положите ее в чашку Петри с сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS). Хорошо промыть, чтобы удалить кровь.
2. Используя щипцы, перенесите матку в новую чашку Петри с 70% этанолом для стерилизации.
3. Перенесите матку на новую чашку Петри с HBSS. Удалите плоды из матки с помощью стерилизованных рассекающих щипцов и хирургических ножниц.
4. Обезглавить плоды с помощью хирургических ножниц. Поместите их в новую чашку Петри с HBSS.
5. Удалите кожу и череп и вытащите мозги с помощью стерилизованных рассекающих щипцов. Поместите их в чашку Петри с HBSS.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Начиная с этого шага, лучше всего провести процедуру на чистомскамейка.
6. Удалите мозговые оболочки с помощью стерилизованных рассекающих щипцов под стерео микроскопом. С помощью щипцов отрезают базальные ганглии, гиппокамп и мозжечок. Используя щипцы с изогнутыми наконечниками, перенесите коры на новую чашку Петри с HBSS.
7. Соберите все кортики, используя одноразовые пипетки или 25 мл пипетки. Поместите их в 15 мл пробирку, а затем удалите HBSS с помощью пипетки.
8. Добавьте 3 мл раствора кортикального фермента церебрального в трубку, содержащую кору. Поместите эту пробирку в водяную баню и инкубируйте при 37 ° С в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Подготовьте церебральный кортикальный фермент культуры, состоящий из фосфатно-буферного соляного раствора (PBS) с 0,25% трипсина и 1 мМ ЭДТА. Стерилизуют с помощью фильтра 0,22 мкм.
9. Добавьте еще 3 мл раствора коры головного мозга в пробирку с корой и инкубируйте при 37 ° С на водяной бане еще 5 минут.
10. Удалите раствор ферментного раствора коры головного мозга с помощью 5 мл пипетки и добавьте 5 мл ДульбеCoded's Modified Eagle Medium (DMEM), содержащая 10% фетальную бычью сыворотку (FBS).
11. Диссоциируйте кору, осторожно пипетируя вверх и вниз, используя пипетку объемом 5 мл со стерильным кончиком P1000. Снова пипетируйте с помощью пипетки объемом 5 мл с наконечником P200.
12. Нанесите сито с нейлоновой ячейкой 40 мкм на пробирку объемом 50 мл и отфильтруйте суспензию для удаления мусора.
13. Центрифугируют при 420 xg в течение 5 мин при комнатной температуре и затем удаляют среду DMEM.
14. Добавьте 5 мл культуральной среды коры головного мозга и осторожно ресуспендируйте клеточный осадок.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Подготовьте культуральную среду для головного мозга, состоящую из основной среды нейронов, дополненной 1x добавками B-27, 2 мМ L-глутамином и 100 ед / мл стрептомицином пенициллина.
15. Подсчитайте клетки, используя гемоцитометр, и отрегулируйте концентрацию клеток (по желанию), используя культуральную среду головного мозга.
16. Планшетах 3,0 × 10 ⁶ кортикальных нейронов в 2,0 мл на стеклянные чашки с покрытием 35 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Перед нанесением покрытия нанесите слой35 мм стеклянные чашки с 0,1 мг / мл гидробромида поли-D-лизина (PDL) или 0,01% поли-L-орнитина (PLO). Инкубировать в течение 3 ч - O / N при 37 ° C и промыть PBS не менее 3 раз.

2. Переносимость подвижных изображений

1. Подготовьте плазмиды, которые будут маркировать каждый тип везикулы. Например, для ранних эндосом используют EGFP-Rab5 для ранних эндосом, EGFP-Rab7 для поздних эндосом, LAMP-EGFP для лизосом и EGFP-LC3 для аутофагосом 8,13.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Эти плазмиды доступны по запросу tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Обычно 3-5 дней in vitro (DIV) нейронов могут быть трансфецированы этими плазмидами с использованием трансфекционных реагентов.
2. Смешайте 4,0 мкг плазмид с 200 мкл бессывороточной среды с помощью пипетирования. В отдельной пробирке разбавьте 8 мкл трансфекционного реагента (см. Таблицу материалов ) в 200 мкл бессывороточной среды. Инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Смешайте раствор плазмиды и раствор трансгенного регента на этапе 2.2 с помощью пипетки. Инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре.
4. Добавьте бессывороточную среду и 400 мкл раствора плазмиды со стадии 2.3 к каждой чашке со стеклянным дном. Инкубируйте нейроны при 37 ° С в инкубаторе с 5% СО _{2 в} течение 30 мин. Замените среду 2 мл церебральной кортикальной питательной среды. Инкубируйте нейроны при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO _{2 в} течение 1-2 дней.
5. После 1 - 2 г трансфекции выберите трансфецированные клетки для получения изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Преждевременные нейроны менее 7 DIV имеют тенденцию проявлять подвижность подвижных везикул. Выберите нейроны, которые умеренно экспрессируют зонд флуоресценции, потому что четкие изображения не могут быть получены, когда выбран высоковыражающийся нейрон. Кроме того, выберите типичную нейронную форму, такую ​​как пирамидальные нейроны, которые имеют длинные аксоны и сложные дендриты, для облегчения идентификации аксона и дендритов (см . Рис. 1A).
6. Получение изображения с использованием системы замедленной съемки:
   Для получения изображения используйте флуоресцентный микроскоп, оборудованный камерой с зарядовым соединением (CCD) с объективом 40X Plan Apo 0.95NA или 100X Plan Apo VC NA1.4. Контролировать температуру при 37 ° C с помощью инкубационной системы. Приобретайте изображения нейронов в одном кадре / 5 с в течение 100 с, контролируемых программным обеспечением для получения изображений. В качестве альтернативы, можно получать изображения с более короткими интервалами и в течение более длительных периодов времени, например, в одном кадре за 2 с в течение 300-секундного периода.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для получения последовательных изображений доступно множество приложений, многие из которых подходят для этого метода. Поэтому не рекомендуется использовать какое-либо конкретное приложение; Скорее, каждый исследователь должен использовать любое приложение.

3. Анализ изображений

1. Откройте все последовательные изображения в программном обеспечении ImageJ с помощью функции Manual Tracking ¹⁴ .
   ПРИМЕЧАНИЕ. На сегодняшний день ручное отслеживание было выполнено с использованием wiDely, используемых в экспериментах по отслеживанию ^{15 , 16 , 17 , 18 , 19} . Ручное отслеживание было разработано доктором Фабрисом Корделиером. Подробные письменные инструкции доступны онлайн ²⁰ . Для анализа качество данных изображения улучшается с достаточным количеством изображений. Рекомендуется использовать более 20 изображений.
2. Чтобы объединить последовательные изображения, выберите <Изображение> → <Стеки> → <Изображения для стека>. Нажмите <ОК>.
3. Выберите <Плагины> → <Ручное отслеживание>; Появится окно отслеживания.
4. Установите флажок <Показать параметры?> И определите параметры отслеживания в разделе параметров.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Можно задать несколько параметров, включая временной интервал, калибровку x / y, калибровку z, размер квадрата поиска для центра, Размер точки, ширина строки и размер шрифта. В этом упрощенном анализе были определены как временной интервал, так и калибровка х / у. В других экспериментальных условиях может потребоваться определить и другие параметры. Используются следующие параметры: <Временной интервал> - 5 с, а калибровка - 0.26642 мкм для объектива 40X Plan Apo 0.95NA или 0.10657 мкм для 100X Plan Apo VC NA1.4 объектив.
5. После того, как параметры определены, нажмите <Добавить трек>, чтобы начать новый трек.
6. После определения представляющих интерес везикул ( например, пузырьки, обозначенные синими и красными стрелками на рис. 1А (правая панель)), щелкните по центру сигналов в последовательных изображениях, чтобы записать координаты xy. Результаты записанных координат xy, расстояния и скорости отображаются в новом окне.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В случае лизосом большие яркие флуоресцентные сигналы ( например, рис.Ure 1A (правая панель), оранжевая стрелка) часто наблюдаются в нейронах. Поскольку эти сигналы иногда проявляют либо накопленные везикулы, либо патологические варикозности, эти сигналы следует избегать для количественной оценки моторики.
7. Повторите шаг 3.6, чтобы собрать координаты xy везикул со всех последовательных изображений; Каждое изображение автоматически переходит к следующему изображению после выбора опорной точки.
8. Экспортируйте эти данные в новую таблицу ( например, электронную таблицу). Используйте соответствующее программное обеспечение для создания подходящего графика (см. Таблицу материалов ).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы проанализировать данные, выберите столбец <Расстояние>, суммируйте все значения этого столбца и покажите расстояние подвижности в виде гистограммы, как на рисунке 1B . Кроме того, повторите этот шаг, вычислите среднее значение общего расстояния подвижности и покажите как гистограмму, как на рисунке 1C . Программное обеспечение для создания гистограммы и данных осциллограмм показано вТаблица материалов.

Результаты

Этот анализ был разработан для измерения динамики везикулы в культуре in vitro . Этот анализ был использован для определения подвижности везикул, связанной с морфологией и выживаемостью нейронов. На фигурах 1А и В показаны репрезента?...

Обсуждение

Этот протокол вводит процедуру количественного определения везикулярной подвижности. В первичных нейронах эндосомы и лизосомы имеют тенденцию демонстрировать высокую подвижность в более молодых нейронах (4-6 DIV). Учитывая, что нейроны должны доставлять некоторые компоненты к передни?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	Serum free medium
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Thermo Fisher	14170112
Penicilin Streptmycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
B-27 Supplements	Thermo Fisher	17504044
2.5% Trypsine	Thermo Fisher	15090046
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma	P7280
Poly-L-Ornithine (PLO)	Sigma	P4957
Nylon cell strainer	Corning	431750
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027	Transfection reagent
Polyethyleneimine "Max" (PEI)	polysciences	24765	Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.
BIOREVO BZ-9000	Keyence	NA
Incubation system INUG2-K13	Tokay Hit	NA
GraphPad Prism version 6.0	GraphPad Software	NA
Excel version 15	Microsoft	NA
ImageJ verion 1.47	NA	NA