Оптическая скрининг Роман бактерий-конкретных зонды на Ex Vivo человека легочной ткани, Конфокальная лазерная Endomicroscopy

Резюме

Этот метод описывает процесс эффективный скрининг для оценки оптических изображений агентов бактерии конкретных внутри ex vivo человека легочной ткани, в расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии для быстрой идентификации малых молекул химические зонд кандидатов с переводимые потенциалом.

Аннотация

Улучшение скорости и точности обнаружения в бактериальные имеет важное значение для пациента стратификации и обеспечить надлежащее использование противомикробных препаратов. Для достижения этой цели, разработка методов диагностики признать бактериальное присутствие в режиме реального времени в момент ухода не требуется. Оптических изображений для прямой идентификации бактерий в пределах узла является привлекательным подход. Несколько попыток химических зонд конструкции и проверки были расследованы, однако никто еще не были успешно переведены на клинике. Здесь мы описываем метод для проверки ex vivo бактерий специфических преобразователей для идентификации бактерий в дистальной легких, отображаемого в расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии (FCFM). Наша модель используется ex vivo человека легочной ткани и клинически утвержденных Конфокальная лазерная endomicroscopy (ДЗ) платформа для экрана Роман бактерии конкретных изображений соединений, тесно имитирует изображений условий, ожидается, что столкнулся с пациентами. Таким образом скрининга соединений, этот метод обеспечивает доверие потенциальных клинических уступчивость.

Введение

Этот метод описывает процесс быстрого скрининга для оценки бактерии конкретных оптических изображений агентов в рамках ex vivo человека легочной ткани, "КЛЕ", с помощью FCFM для быстрой идентификации соединений с потенциальными клинической полезности для визуализации бактерии в дистальной легких в situ.

Существует неотложных глобальных требование рацион антимикробной назначения в эпоху роста резистентности к противомикробным препаратам¹. С этой целью разработки диагностических методов, которые действуют для определения бактериальной инфекции с высокой специфичностью, чувствительность и в режиме реального времени сильно стремились². Существующие методы для подтверждения диагноза пневмоний у больных критически нездоровы, например в рамках интенсивной терапии (палаты интенсивной терапии), часто полагаются на интерпретации неспецифические клинические или радиологических функции наряду с бактериальной культуры техники от атмосферный жидкости/тканей, которые может занять до 3 дней для получения результатов. Кроме того бактериальной культуры от жидкости воплощено в дистальной легких и извлечь подвержен загрязнению от более проксимальном airways³ и часто культура отрицательные вследствие сопутствующего антибактериальной терапии или методов бедных выборки. Кроме того молекулярные методы, такие как полимеразной цепной реакции слишком чувствительны, когда используется на атмосферный жидкости, рискуя перенасыщению больных. Новые диагностические подход является молекулярный оптических изображений, что делает в situ молекулярной патологии тканей возможность; Однако требуется разработка и проверка соединений оптических изображений. Тем не менее прямой визуализации бактерий, через активируемых Оптические зонды потенциально очень мощный метод, чтобы разрешить изучение присутствия и эволюция пневмонии в пациента и, главное, могут использоваться для изучения взаимодействия хост возбудителя в ответ на лечение в реальном времени в.

"КЛЕ" является процедурой расследования в нескольких заболеваний⁴, включая в области гастроэнтерологии⁵,^6,онкологии⁷и для допроса airways и альвеолярного мешки^{8, 9}. Это позволяет точку ухода структурных изображений пораженной ткани, с использованием изображений bundle, который проходит через рабочий канал клинических эндоскопа волокно и форм прямой контакт с поверхности ткани, чтобы быть imaged confocal микроскопии. Однако одно ограничение, которое по-прежнему является необходимость универсального контрастного вещества. Таким образом использование конкретных зонды болезней, например определенных бактериальных агентов, может значительно расширить полезность этой модальности, непосредственно визуализации бактерий на месте предполагаемых инфекции. Оптическая агенты предлагают множество преимуществ перед другими методами, позволяя в реальном времени, с высоким разрешением изображения с диагностический потенциал. Кроме того оптические датчики предлагают перспективы мультиплексирования для допроса нескольких целей, все достигнутые при относительно низких затратах. Количество оптических агенты находятся в стадии разработки для этой цели, однако никто еще не были успешно осуществлены в рамках клиники¹⁰. Мы синтезированных библиотеки малых молекул химические датчики с специфичность к бактерии и разработали быстрого, эффективного трубопровода для оценки функции зонд для обнаружения бактериальной пневмонии на месте¹¹.

Для выявления подходящего щупа кандидатов, пришлось быть выполнены до допроса зонда на ex vivo человека легочной ткани FCFM следующие условия: i) водный растворимость, ii) специфику и избирательности для быстро маркировки клинически соответствующих бактерий, iii) высокое соотношение сигнал шум и iv) стойкость к разложению в легких условиях. Последний был оценен Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF) от больных с острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), который является состоянием, которое характеризуется протеолитические и воспалительных сред в легких в реанимации. Кроме того зонды пришлось иметь подходящую Флюорофор для выявления клинически утвержденных оптических CLE изображений устройства в пределах человеческих легких альвеолярного ткани.

Трубопровод опросить каждого из этих предпосылок был следующим (на каждом этапе, только датчики, которые прошли были перенесены на следующий): (1) был синтезирован библиотека зондов должны расследоваться; (2) Каждый зонд был добавлен в группу живых бактерий для Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) для обеспечения бактериальных маркировки; (3) избирательность бактериальных маркировки над mammalian клеток в совместное культур с первичной нейтрофилов человека была учреждена CLSM; (4) стабильности и успешного маркировки бактерий в присутствии пациента ОРДС BALF определяется CLSM и матрица помощь лазерной десорбции/ионизации-время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии; (5) оптимальная концентрация кандидатов определяется CLSM, обеспечение селективности для бактерий над mammalian клеток была сохранена; (6) кандидатов были образы, FCFM в суспензии и ex vivo человека легких альвеолярного ткани для обеспечения стабильности и что сигнал шум был достаточным для обнаружения. Шаг 6 подробно рассматривается в рамках настоящего Протокола. Ранее сообщалось¹¹была методология для шагов 1-5.

протокол

Все человеческие легочной ткани был получен после обоснованного согласия и исследования был одобрен Региональный комитет по этике.

1. Подготовка биологических образцов

1. Подготовка зонды
   1. Составляют 1 мм Стоковый раствор каждого зонда (например, Флуорексон AM, UBI-3, UBI-10, и т.д.) в стерильных dH₂O, с помощью прекрасный баланс для весить лиофилизированной зонд составные¹¹. Вычислить объем dH₂O для добавления на основе взвешенных массы и молекулярный вес зонда.
2. Подготовка бактериальных культур
   Примечание: Для этого метода, золотистый стафилококк был использован как образцового напряжения. Может быть выбран любой соответствующий бактериальный штамм. Любые коммерческие краситель, помечаемого бактерий с соответствующим возбуждения и спектров выбросов могут выбираться положительно маркировать бактерий.
   1. Выберите одного Колония желаемого бактериальный штамм из свежих Lysogeny бульон (LB) агар пластины с помощью стерильных цикла. Прививать колонии в 10 мл фунтов в 50 мл пластиковых пробирок путем погружения в конец цикла в культуре средств массовой информации. Инкубировать при 37 ° C, 250 rpm для 16 h (или на ночь).
   2. Определите ОД₅₉₅ ночь культуры путем добавления 100 мкл ночь культуры мкл 900 фунтов в кювет 1 мл. Измерить ОД в 595 Нм (с использованием кювета с 1 мл LB как пустой) в спектрофотометре. Умножьте полученное од 10 для получения ОД ночь культуры.
   3. Субкультура ночь культуры. Сделать это путем регулировки оптической плотности в 595 Нм (OD₅₉₅) до 0,1 в 10 мл свежего LB. рассчитать необходимый объем ночь культуры для добавления 10 мл свежих LB для регулировки ОД₅₉₅ до 0,1. Инкубировать культуры при 37 ° C, 250 об/мин, до тех пор, пока культура достигает середины журнала фазы (OD₅₉₅ 0,6 - 0,8), приблизительно 4 ч.
   4. Измерение культуры оптической плотности (шаг 1.2.2) и урожай 1 x 10⁸ колонии, образуя единиц (CFU) (OD₅₉₅ ~ 1-1 x 10⁸ кое/мл) бактериальной культуры в 1,5 мл микропробирок (например, если бактериальная культура является од₅₉₅ 0,6, собирать 1,67 мл). Центрифуга культуры на 10000 x g при комнатной температуре в течение 1 мин до Пелле бактерий. Мыть Пелле дважды в фосфат буфер солевой раствор (PBS), resuspending (закупорить вверх и вниз тщательно) гранулы в 1 мл PBS, центрифугирование как указано выше, отбрасывая супернатанта и повторять. Старайтесь не выбить бактериальных гранул при удалении супернатант. Ресуспензируйте окончательный Пелле в 1 мл PBS.
      Примечание: Подготовьте столько образцы как необходимые для каждой процедуры маркировки. Протокол может быть приостановлен здесь до 1 ч, последовал шаг 1.2.5.1, 1.2.5.2 или 1.2.5.3.
   5. Бактериальные пятнать
      1. Маркировать бактерий с Флуорексон AM, добавьте краситель в конечной концентрации 1 мкм в промывают бактериальной культуры. Инкубируйте культуру для 30 минут при 37 ° C с встряхивания на 300 об/мин. Мыть counterstained бактериальной подвеска в PBS 3 раза центрифугированием как шаг 1.2.4 для удаления избыточного красителя. Ресуспензируйте в 1 мл PBS, разбавляют 100 мкл 1:1 в PBS для получения 200 мкл ОД₅₉₅ AM 0.5 Флуорексон окрашенных бактерий. Протокол может быть приостановлен здесь до 1 ч.
      2. Для обозначения бактерий с тестирования датчиков (например, UBI-3 или UBI-10), разбавляют 100 мкл бактериальной культуры 1:1 в PBS для получения ОД₅₉₅ 0,5 в 200 мкл PBS. Добавьте любой из датчиков до конечной концентрации 10 мкм. инвертировать Микропробирка несколько раз для обеспечения тщательного перемешивания бактерий и зонд.
         Примечание: Изображения должны выполняться сразу после добавления зонд клинические сценарии имитировать.
      3. Подготовить элемент управления неокрашенных бактериальные образцы, разбавляют 100 мкл культуры 1:1 с PBS для получения 200 мкл неокрашенных OD₅₉₅ 0.5 образца.
3. Подготовка ex vivo человека легочной ткани
   Примечание: Образцы ткани легкое человека были получены от пациентов, перенесших хирургическая резекция легких рак. Все ткани, используемые для визуализации был получен из образцов нормальной легочной ткани от раковой опухолью. Образцы были приняты свежие от операционных и хранятся в пробирок или центрифуги трубок-80 ° C до использования.
   1. Непосредственно перед изображений, удалите образец ткани легкое человека из морозильной камеры на сухой лед. При комнатной температуре позволяют ткани, чтобы растопить немного; просто достаточно, чтобы быть нарезанный 1 x 4 мм² секции с помощью скальпеля.
      Примечание: Уровень таяния имеет важное значение; слишком заморожены и ткани не будет нарезать без зазубрин, слишком оттаяла и ткани слишком мягкая для среза.
   2. С помощью щипцов, поместите нарезанный человека легочной ткани в колодцы плиты культуры ткани 96-луночных ясно с плоским дном. Любые неиспользованные человека легочной ткани незамедлительно вернуться в контейнер для хранения и место на сухой лед для транспорта обратно в морозильник-80 ° C.
   3. Добавьте 100 мкл PBS для каждого образца ткани легких с пипеткой. Используйте наконечник пипетки для обеспечения все ткани в PBS (и не застрял на стенках скважины). Ткани будет слегка набухает и может плавать. Оставьте PBS на образце за несколько минут, чтобы позволить любой крови выщелачиваться из ткани в решение. Удалите столько PBS как можно скорее. Ткани могут блокировать конце кончика пипетки; Попробуйте угол размещение плита/подсказка для того чтобы предотвратить это.
   4. Пипетка 100 мкл безупречная, Флуорексон AM помечены или пробник помечены бактерий к каждой хорошо содержащие легочной ткани. Также настроить контроль с легочной ткани и 100 мкл PBS. Эти управления скважин датчики без бактерий могут добавляться для измерения любого увеличения в фоне флуоресценции или активации неспецифических зонда по легочной ткани только. Колодец с легочной ткани и PBS также должны быть включены.

2. Формирование изображений с CLE устройства с FCFM

1. Настройка устройства "КЛЕ"
   Примечание: Подготовьте систему CLE 20 мин до калибровки позволяют лазера, чтобы согреться.
   1. Нажмите клавишу включения/выключения на задней части трансформатора системы и включите компьютер, назначенный. Нажмите кнопку включения/выключения на передней части лазерного сканирования единицы (LSU). Подтвердите появление зеленый свет, указывающий, что устройство включено.
   2. Дважды щелкните на значке "КЛЕ" программного обеспечения. Введите регистрационные данные и ждать LSU для инициализации (10-30 сек).
   3. Для использования новой FCFM изображений волокон установку с прилагаемого компакт-диска является необходимым. Вставьте установочный компакт-диск в CD-привод компьютера и следуйте инструкциям на экране.
   4. Очистите FCFM изображений волокна разъем блока с чистого волокна. Разъему руб на очистки ленты в движение вперед, чтобы удалить грязь пыли. Снимите защитный колпачок желтый из передней части LSU.
   5. Подготовьте LSU хаб, нежно вращающихся Серебряный концентратор против часовой стрелки до упора. Вставьте разъем изображений волокна FCFM в концентратор с плоской стороной соединителя вверх. Держите волокна на месте и вращать Серебряный концентратор по часовой стрелке до щелчка дважды. Выполните подключение путем ротации Серебряный концентратор по часовой стрелке на еще 45°.
      Примечание: Если волокно не распознается, проверьте что изображений волокна FCFM был установлен и подключен в правильной ориентации.
   6. Следуйте указаниям, которые будет всплывающее окно для заполнения FCFM изображений калибровка волокон. Есть 3 шага: (1) FCFM изображений волокна тест (шаги 2.1.7 - 2.1.8), (2) фон приобретения (шаг 2.1.9), (3) волокно обнаружения (шаг 2.1.10).
   7. Нажмите кнопку «Пуск лазера» на экране. Лазер будет центр.
   8. Выберите свежие флаконов (желтый: калибровки; красный: clean; синий: полоскание) от калибровки Кит и следуйте экранным инструкциям: место дистального конца визуализации волокна в желтый пузырек FCFM и наблюдать за рост флуоресценции на мониторе, затем поместить Совет волокна в красную пробирку (без перемешивания). Подождите флюоресценция (как показано на мониторе компьютера) исчезнет. Наконец, промывайте кончик волокна в синего флакона.
      Примечание: Если не исчезают, флюоресценция, очистить тепловизионных волокна FCFM с 8% H₂O₂ и объектив очистки тканей и начать снова. Повторите процесс, пока не будут получены удовлетворительные результаты (качество изображения ясно, и никаких следов от грязи очевидны).
   9. Место FCFM, визуализации волокна в синий пробирку. Нажмите «Пуск лазера» следуют «вычислить» когда это становится вариант.
   10. Место FCFM, визуализации волокна в желтый пузырек. Нажмите «Пуск лазера» следуют «вычислить» когда это становится вариант.
   11. Во время автоматической калибровки, очистить дистального конца визуализации волокна, поместив красный флакон для FCFM > 10 s, следуют синего флакона для > 4 s, как указано в программное обеспечение.
2. Сбор данных с "КЛЕ"
   1. После установки откроется окно для выбора места хранения и префикс файла. Выберите нужную папку для хранения данных и имя префикса соответственно.
   2. Место педали, так что они могут быть легко доступны оператором. Левая педаль: Лазерные вкл/выкл; центр педаль: пауза; правой педали: запись/стоп.
      Примечание: Лазерный контроль также могут быть доступны через экранные элементы управления.
   3. Нажмите кнопку «Пуск» на экране или нажмите левую педаль для включения лазера. Это будет начать приобретение и получать изображения с использованием 100% мощности лазера и частота кадров 12 кадров/сек (параметры по умолчанию).
      Примечание: Для других приложений, эти параметры могут быть изменены на экране, при необходимости, в зависимости от типа образца.
   4. Изображения каждого из образцов бактериальных подвеска.
      1. Вставьте дистального конца волокна FCFM изображений и перемещения волокна медленно через подвеска допросить образца.
      2. Запись видео любой длины (до 10 мин), нажав правой педали или выбрав запись элементы управления на экране, как волокна движется медленно вокруг образца.
      3. Очистите дистального конца волокна FCFM изображений с 8% H₂O₂ и объектив очистки тканей между выборками.
         Примечание: Типичный видео длины 10-30 s являются достаточными для изображений в пробирке .
   5. Изображения каждого из образцов тканей легких.
      1. Вставьте Дистальная FCFM изображений волокна в выборку, обеспечении прямых контактов между конца волокна и ткани. Осторожно двигаться конец изображений волокон вокруг допросить образца.
         Примечание: Подъем в конце волокна от ткани будет удаление ткани от фокальной плоскости; Однако это может использоваться для изображения помечены бактерии, которые не привязаны к ткани.
      2. Запись видео любой длины (до 10 мин), нажав правой педали или выбрав запись элементы управления на экране, как волокна движется медленно вокруг образца.
         Примечание: Как правило, видео длины 30 s являются достаточными для ex vivo изображений на ткани.
      3. Очистите дистального конца волокна FCFM изображений с объективом, очистки тканей и 8% H₂O₂ между выборками.
3. Выключение системы
   1. Выключить лазер, нажав левой педали или нажав кнопку на экране.
   2. Отсоедините FCFM изображений волокна Кле, повернув Серебряный хаб LSU против часовой стрелки до упора. Удалите FCFM изображений волокна от концентратора LSU, осторожно потянув разъему волокна от LSU.
   3. Очистить и продезинфицировать FCFM изображений волокна с 8% H₂O₂ и объектив очистки ткани. Вернуться проксимальный конец FCFM изображений волокна и передней LSU устройства защитные колпаки. Поместите волокно мягко в поле хранилище.
   4. Закройте данные захвата программного обеспечения и копировать любые сохраненные файлы с внешнего устройства USB. Выключите компьютер и отключите устройство LSU, нажав на передней панели ввода/вывода для 3 s до тех пор, пока зеленый свет исчезает.
   5. Распоряжаться человеческой легочной ткани и бактерий в соответствии с местными правилами.

3. анализ данных

1. Открытое программное обеспечение и импортировать файлы для анализа, выбрав соответствующий каталог на компьютере через «Перейти» значок на панель мониторинга программного обеспечения. Кроме того файлы можно перетаскивать и сбросили в панель мониторинга программного обеспечения.
2. Дважды щелкните на каждом видео файл, чтобы открыть их. Видео будет автоматически играть с оптимизированной цвета таблицы подстановки (LUT) и настроить таблицу цветов. Отключите автоматическое интенсивность, масштаб, нажав на кнопку палочка над панелью шкала интенсивности. Эта функция отключена, когда есть не черные тени вокруг кнопки.
   Примечание: Автоматическое интенсивности масштабирования необходимо отключить для предотвращения постоянной контрастности на протяжении каждого видео, что делает невозможным для сравнения и анализа видео из того же набора данных.
3. Выберите желаемой интенсивности, масштабирование, перемещая минимальные и максимальные баров дать лучший контраст. Используйте средство гистограммы при выборе интенсивности, масштабирование для обеспечения максимально широкого динамического диапазона захватывается.
   Примечание: Убедитесь, что динамический диапазон такова, что изображения не насыщен (т.е. ограничить белый области изображения, указывающие насыщения), так что функции низкой интенсивности не пропустили.
4. После того, как был достигнут требуемый масштабирования, щелкните правой кнопкой мыши над кнопкой меню раскрывающемся списке как «По умолчанию (зеленый)». Выберите параметр, чтобы сохранить LUT. Сохраните LUT в нужное место.
5. Друг для друга видео в наборе данных применять же LUT, щелкнув правой кнопкой мыши над «По умолчанию (зеленый)» выпадающего меню и выберите «Нагрузки LUT». Выберите соответствующий файл для применения постоянной интенсивности масштабирования для всех видео в наборе данных.
6. Экспорт обработки видео, нажав на кнопку «кино катушки». Выберите желаемый формат видео, например «для целей представления», который будет производить .mpg файл. Нажмите кнопку «Экспорт» и выберите расположение файла для сохранения видео файла. Снимки отдельные кадры могут быть экспортированы, нажав кнопку «camera». Это позволяет сохранить файл .png, .bmp или .jpg. Выберите файл и нажмите кнопку Сохранить.
   Примечание: Видео затем может быть импортирован в любое программное обеспечение для подготовки презентаций или дальнейшей количественной оценки. Приклеенные этикетку бактерии визуализируются как зеленые «моргать» точки в видео. Структура ткани легких будет очевидным, как приказал флуоресцентные пряди, с альвеолярной пространства, появляются черные.

Результаты

В этом исследовании мы продемонстрировали метод для быстрого скрининга Роман бактерии конкретных зондов в ex vivo человека альвеолярных легких тканей модели инфекции, используя устройство клинически утвержденных Кле.

"КЛЕ" по FCFM хорошо подходит для получения структурной информации в дистальной легких, как этот регион (из-за высокой обилие эластина и коллагена), естественно, весьма флуоресцентные, когда возбужденные с 488 нм лазер⁸. И наоборот альвеолярного пространства не флуоресцировать, и таким образом позволяет высокий контраст между структурой тканей и воздушным пространством быть визуализированы (рис. 1).

Добавление заболевания связанные с зондов или контраст агентов, таких как бактерии конкретных зондов должны позволить функциональная информация о процессах болезни, которые могут быть получены в режиме реального времени. Мы уже описали синтеза и первоначальный в пробирке скрининга библиотеки бактерий-конкретных зонды¹¹; где бактерий специфика, было определено протеолитических стабильности и сохранения в пределах бактериальной мембраны с течением времени. Перспективным бактерии конкретных зонд (UBI-10) была определена в рамках этого исследования, а также один, что показали плохой удержания в бактериальных клеточных мембран (UBI-3). Они были по сравнению с элемент управления коммерческой counterstaining (Флуорексон AM), который был использован для помечены S. aureus.

Незапятнанное, Флуорексон AM, UBI-3 и помечены S. aureus UBI-10 были образы в суспензии, FCFM с 100% 488 нм лазер сила и частота кадров 12 кадров/сек (рис. 2). Там, где были образы немеченого бактерий в PBS, не флуоресцентные сигнал был обнаружению. Это отличается от того, когда были образы помечены бактерий. Там, где бактериальных суспензий с UBI-3 или UBI-10 были образы, FCFM, стало очевидно, что общий фон флуоресценции решения был повышен по сравнению с PBS только элементы управления, это потому, что NBD (зонд Флюорофор) выделяет небольшое количество флуоресценции сигнал в водном растворе, однако, яркие пунктата точки хорошо видны во всем решение, без необходимости мыть шага. Это объясняется увеличением флуоресценции сигнал, излучаемый NDB в полярной окружающей среды например, бактериальной мембраны. Флуорексон AM настолько не активируемых зонд, мыть шаг после бактериальной пятнать был обязан удалить высокой флюоресцентный фон несвязанных зонда в решении. Как UBI-3 и UBI-10 помечены бактерии, помечены Флуорексон утра были обнаружены в растворе FCFM как яркие зеленые точки пунктата. Поскольку данные собираются в видео формате, эти точки, как представляется, «Огонек», как они перемещаются между процессорными ядрами и из фокуса, характерной чертой изображений помечены бактерий этим методом.

Приклеенные этикетку бактерии впоследствии были добавлены небольшие кусочки ex vivo человека легочной ткани и снова imaged на FCFM (рис. 3). Где только неподписанных S. aureus или PBS был добавлен в легочной ткани, только структура autofluorescent ткани легких был обнаружен (рассматривать как яркие зеленые нити коллагена и эластина и темные участки альвеолярных пространства). Для этих условий управления обнаружены не пунктата точек. Аналогично только легких тканей структуры (и не пунктата точек) был визуализирован на состояние легких тканей с S. aureus плюс UBI-3; указав, что этот зонд не сохраняется стабильно в бактериальных клеток мембрана т.е., он был промыть и/или снижается в присутствии родной протеолитических ферментов в ткани легких (как ранее показали¹¹).

Однако яркие пунктата точки были видны в обоих Флуорексон AM помечены положительный контроль S. aureus образца и с наиболее перспективных зонд бактерий конкретного образца (UBI-10) S. aureus . «Мерцающих» точки были видны несмотря на сильный ткани аутофлюоресценция (рис. 3). Таким образом результаты, полученные FCFM были в согласии с в vitro предварительной проверки группа бактерий специфических преобразователей, CLSM и продемонстрировал метод клинически значимых обнаружения для визуализации инфекции в режиме реального времени.

Результаты, представленные здесь продемонстрировать, что соответствующий орган системы для обработки изображений, FCFM из-за его отличительные аутофлюоресценция легких. Яркой отличительной структуры позволяют оператору "КЛЕ" определить, что они находятся в альвеолярной пространстве. Эти регионы, в сочетании с темной альвеолярного воздушные мешки обеспечивают идеальным фоном для визуализации дневно обозначенные бактерий с высокой контрастностью.

Хотя обнаружение бактерий, представленных в рамках этого исследования определяется качественно визуализации яркие пунктата точки, можно подсчитать количество пунктата точек кадра с помощью дополнительного программного обеспечения с целью дальнейшего характеризуют зонд библиотеки.

Рисунок 1: Статическое изображение человеческих легких тканей аутофлюоресценция. Конфокальный лазерный endomicroscopy (ДЗ) изображение ex vivo человека легочной ткани с помощью расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии (FCFM), на 488 нм возбуждения, мощность лазера 100% и 12 кадров в секунду эластина и коллагена весьма флуоресцентные (false окрашен в зеленый цвет), в то время как альвеолярного пространство не является и отображается как черный регионов. Эта цифра была изменена от Акрама и др. ¹¹ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Конфокальная лазерная endomicroscopy (ДЗ) изображение помечены Стафилококк золотистый в суспензии. Расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии (FCFM) был использован для изображения предварительно помечены бактерий, 488 нм возбуждения, мощность лазера 100% и 12 кадров в секунду Приклеенные этикетку бактерий Показать как высоко флуоресцентные пунктата точки (ложные зеленого цвета). Эта цифра была изменена от Акрама и др. ¹¹ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 3: Конфокальная лазерная endomicroscopy (ДЗ) изображение ex vivo человека легочной ткани с метками S. aureus. Расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии (FCFM) был использован для изображения ex vivo человека легочной ткани и помечены S. aureus, 488 нм возбуждения, мощность лазера 100% и 12 кадров/s. Приклеенные этикетку бактерий шоу как высоко флуоресцентные пунктата точек (ложные цвета зеленый) в пределах образца ткани легких при помечены Флуорексон AM или UBI-10. Высокий контраст наблюдается, где бактерии отражаются в альвеолярной пространстве. Эта цифра была изменена от Акрама и др. ¹¹ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.  

Обсуждение

Инфекции нижних дыхательных путей учета вторым наибольшим бременем болезней глобально^12,13и существенное увеличение число инфекций, приписываемых антимикробные резистентных бактерий был сообщил¹⁴. Пневмония остается наиболее распространенная причина госпитализации. В реанимации развитие пневмонии осложняется диагностических неопределенности и связано с чрезвычайно высокой смертности показатель¹⁵. Во время наступления пневмонии бактерии размножаются в альвеолярной пространстве дистальной части легкого, область, которая является относительно стерильные, с минимальными микрофлору в области здравоохранения.

Этот метод описывает относительно поздней стадии ex vivo проверки бактерии конкретных оптических изображений зонды¹¹, но дизайн, синтез, и зонд оценки до начала этот шаг проверки важно, как ранее показанного¹¹ .

"КЛЕ" является формирующейся клинических техника для допроса болезни государства на месте в режиме реального времени. Он предлагает много преимуществ над традиционными методами для расследования предполагаемых легочной патологии, которая может включать биопсии и сбора жидкости промывания. Биопсии инвазивных и может привести к заболеваемости и смертности в вентилируемых пациентов, и собранные промывание жидкость часто бывает загрязнена бактерий из верхних дыхательных путей. "КЛЕ" в обнаружении пневмонии используется однако несколько ограничено из-за плохой наличие совместимых изображений датчики, которые могут предоставить функциональные сведения заболевания, несмотря на многие согласованные усилия¹⁰. Предлагает сочетание ДЗ с оптическим агенты перспективы диагностики пневмонии быстрее и меньше вмешательства по сравнению с текущей стандартной практикой.

В пробоподготовки и установки платформы "КЛЕ" критические шаги к настоящему Протоколу. Получение тканей человека отношение к окончательной клиническое применение также важна, как человека легочной ткани, как продемонстрировано в рамках этого исследования. Это необходимо для использования тканей человека, потому что степень ткани аутофлюоресценция показывает большие различия между видами и поэтому может ввести в заблуждение чувствительность бактерии зонд изображаемого. Кроме того важно получение этики для поиска и использования человеческого легочной ткани. От технического уровня, правильной очистки, вложение изображений волокна в LSU платформа, и калибровки имеет важное значение для хорошего разрешения и последовательной обработки изображений, как обеспечение эквивалентного количества бактерий добавляются для каждого образца ткани легких. Для дальнейшего расширения полезности этого метода для проверки панели датчиков, повторяя процедуру с спектр патогенов, таких как те, вероятно, будет возбудителей пневмонии является необходимым.

Крупнейший ограничением этой методики является, что клинически утвержденных CLE устройство имеет только один лазерный (488 нм). Таким образом в настоящее время, выбор Флюорофор для Конструкция зонда ограничен для использования с этой системой, хотя клинически утвержденных одного цвета, которую устройства существуют с длинами волн возбуждения 660 нм и ближней ИК-области спектра. Весьма желательно иметь второй линии лазерного реализовано в рамках того же устройства, чтобы зонд с спектрально собственный Флюорофор для повышения чувствительности бактерий зонд над уровнем аутофлюоресценция ткани. Хотя двухцветный CLE устройства находятся в стадии разработки, либо они утверждаются не клинически и/или их стоимость значительные¹⁶.

"КЛЕ" в пробирке с использованием патогенных бактерий и ex vivo человека легочной ткани на экране потенциальных зонды ликвидирует разрыв между обычными в vitro методы, такие как проточной цитометрии и CLSM и клинической полезности. Этот шаг предлагает доверие при выборе перспективных соединений для продвижения вперед в сочетании с клинической CLE изображений; и даст указание ли проверенный зонд поддерживает целевую специфику, или демонстрирует любой пробить маркировки, например привязку непосредственно к ткани, или показывает нестабильность с принимающей протеолитических ферментов. Было бы также целесообразно добавить каждый из доступных зондов непосредственно образцы человеческого легочной ткани плюс бактерий, полностью характеризовать скорость зонда привязки и активации в режиме реального времени.

Мы считаем, что наш трубопровод для быстрого скрининга Роман бактерии конкретных зонды оценить их потенциал для обработки изображений в дистальной легких пациентов приведет к гораздо быстрее перевод в клинику. Это главным образом потому, что бактерии конкретных зонд может быть доставлено локально в легких через катетер, вставлен вниз рабочий канал бронхоскоп, означает, что microdose (< 100 мкг) суммы может быть доставлено. Таким образом системные поставки и накопление этого соединения является не является проблемой, как в случае многих других целей инфекции в теле, или с ядерными изображений. Кроме того, обеспечивая изображений зонд в такой небольшой дозы уменьшает риск токсичности связанных осложнений (хотя для перевода потребуется токсичности скрининга). После инстилляции зонда катетер может затем быть заменена FCFM волокна и того же региона легких, допрашивали "КЛЕ", так же, мы провели в этом методе. Изображения должны быть выполнены быстро после установки зонда перед зонд смывает обнаружить концентрации.

Важно также отметить, что Скрининг болезней выявление зонды, эта техника не должна быть ограничена агентов бактериальной изображений, но может также распространяться на проверки датчиков с альтернативных целей, таких как воспаление. Этот подход должен также быть адаптированы для других заболеваний места в тексте, где допустимо изображений через FCFM.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-14 Microfuge	SciQuip	90616	Small benchtop microcentrifuge
96-well plate	Corning	3370	Assay plate
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Commercial fluorescent dye
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Confocal laser endomicroscopy device
Cletop-S	Cletop	14110601	Fibre cleaner
Eppendorf (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	1.5 mL microfuge tube
Eppendorf Research Plus Pipettes	Fisher Scientific	11568663	Micro pipettes
Falcon tube (50 mL)	Scientific Lab Supplies	352070	50 ml centrifugation tube
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - wash media
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system
Incu-Shake midi	Sciquip	SQ-4020	Floor standing shaking incubator
Lysogeny Broth	Sigma Aldrich (Miller)	L3522	LB Growth media for S. aureus
non-standard research AlveoFlex 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Fibred confocal fluorescence microscopy fibre
Quanti Kit 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Calibration kit for the CellVizio 488 system
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Bacterial strain used in this study
Semi-micro spectrophotometry cuvette	Sigma Aldrich	C5416-100EA	For spectrophotometry
Thermomixer comfort	Eppendorf	41102422	Benchtop heater with shaking
UV 1101 Biotech photometer	Biochrom WPA		Spectrophotometer