АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для описания простой, быстрой и эффективной прионных амплификации метод, метод реального времени дрожат индуцированной преобразования (RT-QuIC).

Аннотация

RT-QuIC техника относится чувствительных в пробирке клеток бесплатно прионы амплификации основана главным образом на в сеяный сворачиванию и агрегации рекомбинантных прионных белков (PrP) субстрата с помощью прионных семена как шаблон для преобразования. RT-QuIC является роман техника высокой пропускной способности, которая аналогична реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обнаружение амилоида фибриллярных роста на основе красителя Тиофлавин Т, которая флуоресцирует на специфическое взаимодействие с богатой белками ᵦ-лист. Таким образом амилоидных формирования могут быть обнаружены в режиме реального времени. Мы попытались разработать надежный неинвазивные скрининг-тест для выявления хронической тратить прионов болезни (CWD) в фекальных экстракт. Здесь мы специально адаптированных RT-QuIC техника раскрыть что PrPSc посева деятельность в фекалиях CWD инфицирован оленей. Первоначально посева деятельность фекальных экстрактов, которые мы подготовили был относительно низким в RT-QuIC, возможно из-за потенциальных ингибиторов пробирного в фекалии. Чтобы улучшить деятельность посева Кала экстрактов и удалить потенциальных ингибиторов пробирного, мы гомогенизированные фекальных проб в буфер, содержащий моющих средств и ингибиторов протеазы. Мы также представили образцы различных методологий сконцентрироватьSc PrP на основе белков осадков с использованием натрия фосфорвольфрамовой кислоты и центробежной силы. Наконец экстракты фекалии были протестированы оптимизированный RT-QuIC которая включала замену субстрата в протоколе улучшить чувствительность обнаружения. Таким образом мы создали протокол для чувствительных обнаружения CWD прионных посева деятельность в фекалиях доклинических и клинических оленей по RT-QuIC, который может быть практическим инструментом для неинвазивной диагностики CWD.

Введение

Прионы заболеваний или трансмиссивные формы губкообразной энцефалопатии (TSE) являются нейродегенеративных расстройств, включая болезни Крейтцфельда - Якоба (CJD) в организме человека, губчатой энцефалопатией (BSE) крупного рогатого скота, почесуха овец и коз и хронической тратить болезнь (CWD) в оленей 1,2. ТГЭ характеризуются отличительной губкообразная внешний вид и потери нейронов в головном мозге. Согласно гипотезе «только белок» прионы главным образом состоят из ОТРSc («Sc» для почесуха) 3, смятых изоформы хост кодировке сотовой прионных белков, ОТРC. PrPSc является результатом преобразования ОТРC в конформации, обогащенный ᵦ-листы 4,5,6 , который может выступать в качестве семян для привязки и преобразования других молекул PrPC . Созданное молекулы PrPSc включены в растущей 7,полимерных8 который разбивается на небольшие олигомеров, что приводит к росту числа инфекционных ядер. PrPSc склонной к агрегации и частично устойчив к протеаз 9,10.

CWD влияет на диких и выращиваемых лося (Cervus canadensis), mule олени (рода hemionus), белохвостый олень (WTD; Виргинский рода), лося (Alces alces) и олень (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Он считается наиболее заразных болезней китовая птичка с горизонтальной передачи cervid взаимодействия и экологической устойчивости инфективности 14,15. В отличие от других прионных заболеваний, где PrPSc накопления и инфективности приурочены к мозгу в ухо они также находятся в периферических тканях и жидкостях организма например слюна, моча и фекалии 16,17, 18.

Иммуногистохимия считается золотым стандартом для CWD диагностики для обнаружения PrPSc распределения и губчатые поражения 19,20. ELISA и в более редких случаях, Западная помарка также используются для диагностики CWD. Таким образом текущие диагноз болезни прионных главным образом основывается на выявлении прионов в тканях трупа. Ante-mortem диагноз для CWD доступен, принимая миндалин или биопсии ректо анальный слизистой оболочки связанных лимфоидной ткани (RAMALT); Однако эта процедура является инвазивным и требует захвата животных. Таким образом легко доступных образцов, таких как моча и фекалии, будет использоваться практический способ обнаружения CWD китовая птичка. Однако эти экскременты гавань относительно низкие концентрации прионов ниже предела обнаружения текущих методов диагностики. Следовательно необходима более чувствительной и высокой пропускной способности диагностический инструмент. В vitro преобразования систем, таких как белок, сворачиванию циклических усиления анализа (PMCA) 21, амилоид посева пробирного и реальном времени дрожат индуцированной преобразования (RT-QuIC) пробирного 22,23, 24 являются очень мощными инструментами для использования самостоятельного размножения ОТРSc способность имитировать в vitro процесс преобразования китовая птичка и тем самым усилить присутствие мизерных количествахSc PrP к обнаружению уровней 25 ,26. RT-QuIC метод, однако, использует тот факт, что преобразование продукт, обогащенный в вторичной структуре β-лист конкретно можно привязать Тиофлавин Т (Th-T). Таким образом рекомбинантных ОТР (rPrP) после преобразования в сеяный перерастает в амилоидных фибрилл, которые связывают Th-T и таким образом могут быть обнаружены в реальном времени путем измерения флуоресценции Th-T выражается относительной флуоресценции единиц (РФС) со временем. После того, как мониторинг, РФС может использоваться для оценки относительной посева мероприятия и количественные параметры, такие как лаг-фазы. Лаг-фаза представляет собой время (h) требуется достичь порога, во время которого rPrP преобразования на ранней стадии реакции находится ниже предела обнаружения Th-T флуоресценции. Конец этапа явное отставание, сопутствующие формирования достаточного амилоида ядра (нуклеации/удлинение), происходит, когда Th-T флуоресценции превышает пороговый уровень и становится положительным. Рост амилоида, которую фибриллами могут быть обнаружены в реальном времени и первоначальный PrPSc или заполнения деятельности, содержащихся в образце усиливается сегментации, которая генерирует больше семян. Эти семена в свою очередь вызывают быстрое экспоненциальной фазе роста амилоида волокна.

Потому что этот assay может обнаружить как низко как 1 fg ОТРSc 24, высокая чувствительность квалифицирует эту технику для достижения ante mortem или неинвазивной диагностики путем обнаружения PrPSc в различных периферийных тканей, экскременты или других виды образцов, укрывательство низкий уровень инфекционности. RT-QuIC определенно имеет преимущества перед другими анализов его воспроизводимости, практичности, быстрота (менее 50 h) и низкие расходы по сравнению с bioassays. Это позволяет избежать технические сложности, такие как sonication, используемые в PMCA; Кроме того она выполняется в запечатанные лентой микроплиты, которая минимизирует риск загрязнения аэрозоля каждой скважины. Несколько хорошо формат позволяет анализ образцов до 96 в том же эксперименте. Для противодействия периодические проблемы ложных срабатываний и спонтанное преобразования rPrP в конверсии в vitro анализов осуществление порог (отсечения) в RT-QuIC является очень полезным. Действительно основываясь на результатах отрицательного контроля (средняя РФС негативные примеры + 5 SD 27), базовый создан из которого может осуществляться дискриминация между положительным и отрицательным образцы. Использование четырех репликация для каждого образца таким образом может помочь определить образец как позитивные, когда по меньшей мере 50% реплицирует показывают позитивный сигнал, т.е. крест отсечения 28. Гомологии между семенем и субстрат не требуется в RT-QuIC, как например в предыдущем исследовании, хомячок rPrP был найден, чтобы быть более чувствительным субстрата, по сравнению с гомологичных субстрата в человека PrPвБКЯ семенами и скрепи овец посеян реакции 29. Хомяк овец химерных rPrP было также предложено быть подложке более подходящим чем человека rPrP обнаружить человека вариант CJD прионов 30. Таким образом использование rPrP субстратов из различных видов является очень распространены в этот assay. Этот assay был успешно применен к несколько прионных заболеваний, таких как спорадические CJD 31,,3233, генэтический прионных заболевания 34, BSE 35,,3637, почесуха 23,36и CWD 38,,3940,41, 42. Исследования с использованием обработанных спинномозговой жидкости, цельной крови, слюны и мочи, как семена в RT-QuIC все удалось обнаружить PrPSc 38,,3940,41, 42. для укрепления способности обнаружения в пробах как плазмы крови, которая может содержать ингибиторы амилоида формирования, Orrú и др. (2011) разработала стратегию для удаления потенциальных ингибиторов амилоида формирования расчесывать PrPSc иммунопреципитации (IP) шаг и RT-QuIC, под названием «расширение QuIC» проба (eQuIC). Кроме того замена шаг субстрата работал после ~ 24 h время реакции для того, чтобы улучшить чувствительность. В конечном итоге, как низко как 1 ag ОТРСК было обнаруживаемых eQuIC 30.

Чтобы очистить фекалии экстрактов и удалить возможные пробирного ингибиторы в фекалиях, фекальных пробах на доклинических и клинических стадиях лося на экспериментальной устные инфекции были гомогенизированные в буфер, содержащий моющих средств и ингибиторов протеазы. Фекалии экстракты далее были представлены различные методологии сконцентрировать PrPSc в образцах используя осадков белок через натрия фосфорвольфрамовой кислоты (NaPTA) осадков. Метод NaPTA осадков, впервые описан Сафар- et al. 43, используется сконцентрировать PrPSc в испытательных образцов. Инкубационный NaPTA с результатами выборки преференциальных осадков ОТРSc , вместо того, чтобы ОТРC. Однако молекулярный механизм до сих пор неясно. Этот шаг также помог сдерживания и предотвращения спонтанного преобразования rPrP, который наблюдается в некоторых случаях. Наконец экстракты фекалии были протестированы оптимизированный RT-QuIC с помощью rPrP (aa 23-231) мыши как субстрат и включая замену субстрата в протоколе улучшить чувствительность обнаружения.

Результаты здесь продемонстрировать, что этот усовершенствованный метод может обнаружить очень низких концентрациях CWD прионов и увеличивает чувствительность обнаружения и специфичность в фекальных пробах, по сравнению с протокол без осадков и субстрата замены NaPTA. Этот метод потенциально могут быть применены в других тканях и жидкостях организма и может быть полезным для CWD наблюдения в диких и плен оленей.

протокол

1. RT-QuIC используя фекалии

  1. , Подготовка cervid Кала извлекает
    1. сделать фекальных огневки, добавив 1 g фекального материала до 10 мл Кала экстракт буфера (фосфат натрия 20 мм, pH 7.1, 130 мм NaCl, 0,05% 20 анимации, 1 мм PMSF и 1 x дополняют ингибиторы протеазы, ЭДТА бесплатно) дать окончательный концентрации 10% (w/v). Гомогенизация буфер могут быть подготовлены до использования и температуре -20 ° с.
    2. Homogenize фекальные пеллеты (1 g) и буфер (10 мл) в трубы (например, gentleMACS M трубки) с помощью диссоциатором с заданной программы от производителя для белков за 1 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг два-три раза до фекальных проб полностью гомогенизированный в буфере,.
    3. Прокладка трубки с парафина и поместите их на качающейся платформе или роторные шейкер для 1 ч инкубации при комнатной температуре.
    4. Центрифуга трубы на 18,000 g x 5 мин при комнатной температуре.
    5. Сбор supernatants, которые содержат белок извлекает и аликвота их в 1,5 мл пробирок. Аликвоты может храниться при температуре-80 ° C для дальнейшего применения.
  2. Sc концентрация ОТР в фекалиях экстракты
    Примечание: для того, чтобы сконцентрировать CWD прионы в образцах фекалий экстракт, повышая чувствительность обнаружения по RT-QuIC, добавляется шаг осадков белок к протоколу.
    1. NaPTA осадков метод
    2. Добавить 250 мкл 10% (w/v) N-лаурил sarcosinate (sarkosyl) по 1 мл фекальных белка экстракт дать окончательный концентрации sarkosyl 2% (v/v).
    3. Уплотнение трубы, которые содержат образцы с парафина и инкубировать при 37 ° C за 30 мин под постоянной тряски при 1400 об/мин в thermomixer и.
    4. Отрегулировать смесь фекальных белков экстракта и sarkosyl с Стоковый раствор, содержащие 10% (w/v) натрия фосфорвольфрамовой кислоты и 170 мм хлорида магния, рН 7,4 для получения конечной концентрации 0,3% (w/v) натрия фосфорвольфрамовой кислоты в пробах.
    5. Проинкубируйте образцы при 37 ° C 2 h с постоянной тряски на 400 об/мин.
    6. Центрифугуйте образцы на 14 ° C на 30 мин в 15 800 x g. тщательно удалить supernatants.
    7. Мыть гранулы, resuspending их в буфере мыть (10 мм трис-Cl, pH 7.5, 100 мм NaCl, 0,5% Тритон-X 100, ЭДТА 10 мм, 0,5% натрия Дезоксихолат (w/v) и 0,1% sarkosyl (w/v)).
    8. Центрифугуйте образцы на 14 ° C на 15 мин на 15800 x g. тщательно удалить supernatants.
    9. Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл (Выдержка 1/10 первоначального объема Кала белка) RT-QuIC буфера для разведения.
      Примечание: RT-QuIC буфером для разбавления проб (фосфат натрия 20 мм, pH 6.9, 130 мм NaCl, 0.1% SDS (w/v) и 1 X N2 дополнение) готовится до использования. Суммарный объем 10 мл фильтруется через фильтр 0.2 мкм acrodisc шприц, с помощью шприца и затем хранятся при температуре-20 ° C до использования.
    10. Хранить образцы NaPTA лечение при-20 ° C до их использования в RT-QuIC assay.
  3. RT-QuIC Пробирная
    1. готовить свежие 10 мм Th-T Стоковый раствор (0,032 g Th-T в 10 мл двойной дистиллированной H 2 O).
    2. Сделать разведение 1:10 Стоковый раствор в двойной дистиллированной H 2 O сделать окончательный концентрации Th-T 1 мм фильтр, он через шприц acrodisc 0,2 мкм фильтр, с помощью шприца Th-т.
    3. Размораживание мыши рекомбинантных ОТР (rPrP, АА 23-231) субстрата (10 мкг/мл на RT-QuIC реакции) температуре -80 ° C на ДВС.
    4. Нагрузка 500 мкл rPrP субстрата в то время в 100 кДа размер исключение фильтра пробирок и центрифуги в 14.000 x g 5 мин при комнатной температуре (одна трубка/фильтр может использоваться в два раза).
    5. Передачи eluted субстрата в стерильных 1,5 мл трубку и держать его при температуре 4 ° C до использования.
    6. Оттепель RT-QuIC буфером для разбавления проб, температуре -20 ° с.
    7. Сделать разведения семян (экстракт фекальных белка) в RT-QuIC буфером для разбавления проб:
      Неразбавленный образец: настойку фекальных белка неразбавленный
      разбавленным 2 x 10 -1
      разбавленным 2 x 10 -2
      разбавленным 2 x 10 -3
    8. подготовить акций решения для RT-QuIC реакционной смеси:
      фосфат амортизированное saline ( PBS): 5 X
      NaCl: 2 М складе раствор NaCl, подготовленный в двойной дистиллированной H 2 O.
      ЭДТА: 100 мм раствор ЭДТА, подготовленный в двойной дистиллированной H 2 O.
    9. До использования всех решений (шаг 1.3.8), фильтр каждое решение отдельно через фильтр 0.2 мкм acrodisc шприц, с помощью шприца и держать их стерильной при комнатной температуре.
    10. Подготовить общий объем RT-QuIC реакционной смеси согласно количество выборок (98 тома µL реакции на сэмпл и четыре реплицирует на сэмпл) использоваться плюс 10% от этого объема, чтобы убедиться в том иметь достаточное количество смеси для всех реакций.
      1. Использования 15 мл подготовить RT-QuIC реакционную смесь (фосфат натрия 20 мм, pH 6.9, 300 мм NaCl, 1 ЭДТА, 10 мкм Th-T, 10 мкг/мл rPrP субстрат и двойной дистиллированной воды для регулировки rPrP конечная концентрация в реакции) с использованием акций соль utions.
      2. Смешайте все решения хорошо закупорить вверх и вниз с помощью пипетки с наконечником фильтра. Как можно больше избегать использования вихря.
      3. Вылейте смесь в 50 мл одноразовые дозирования водохранилище.
      4. Использовать многоканальные пипетки для загрузки 98 мкл RT-QuIC реакционной смеси в каждой скважине 96-луночных оптических днище.
    11. Добавить к каждому RT-QuIC реакции 2 мкл неразбавленным или десятикратного серийно разреженных фекальных белков экстракта. Тестирование каждого образца в четыре реплицирует.
      Примечание: В каждом эксперименте, серийных разведений фекальных пробах (начиная от неразбавленном до 2 x 10 -3) CWD-отрицательных и проверенных CWD-инфицированных животных используются как негативные и позитивные элементы, соответственно.
    12. Уплотнение пластины с уплотнительной ленты до инкубации в тарелку читателя при 42 ° C для 25 h с повторных циклов 1 мин двойной орбитальных встряхивания (700 об/мин) и 1 мин отдыха на протяжении всего инкубационного.
    13. Определение флюоресценции измерения параметров:
      Возбуждения: 450 Нм
      выбросов: 480 Нм
      дно читать, количество вспышек: 20
      ручной выгоды: 1000 (зависит от машины)
      время интеграции: 20 МКС
    14. удалить пластину от пластины читателя в конце 25 ч.
    15. Спина вниз пластину на 3000 x g на 3 мин избежать потенциального загрязнения между скважинами.
    16. Удалить уплотнение из пластину.
    17. Подготовить новую пластину 96-луночных, добавив 90 мкл RT-QuIC реакционной смеси, содержащие свежий субстрат и свежие флуоресценции красителя Th-T, как описано в разделе 1.3.1 для 1.3.6.
    18. Хорошо пластины передачи 10 мкл от каждой скважины первой пластины для недавно подготовленных 96.
    19. Уплотнение новой пластинкой и продолжить RT-QuIC assay для дополнительных 50 h следующие шаги, описанные в шаге 1.3.13. Этот дополнительный шаг 50 h сделает общее время реакции 75 ч.
      Примечание: Все процедуры RT-QuIC пробирного сделали по биобезопасности кабинета.
    20. Сбора данных.
      1. Чтения и документ Th-T сигнала флуоресценции каждой скважины каждые 15 минут
      2. Собирать данные всего циклов, с использованием программного обеспечения для анализа данных и передачи в электронную таблицу с в среднем quadruplicate реакций.
      3. Участок средние данные. Оси x соответствует время реакции RT-QuIC (h) и оси y соответствует относительной флуоресценции единиц (РФС). Каждая кривая соответствует к размыванию известный образец.
      4. В каждом эксперименте, демаркации порог путем расчета высокие средние значения отрицательного контроля плюс 5 стандартных отклонений, как описано в текущем опубликована литература 41.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Все реплики, которые пересекли определенный порог считаются положительными. Если по крайней мере два из четырех реплицирует переступить порог, образец затем считаются положительными.

2. Очистки рекомбинантных прионных белков (rPrP)

  1. рост бактерий фондовых и выражение rPrP
    Примечание: штамм Escherichia coli (E. coli) Rosetta (DE3) преобразована с кодировкой вектор ПЭТ-24 мышь ОТР (остатки 23-231) был использован для подготовки rPrP.
      ,
    1. Оттепель глицерин запас Rosetta (DE3) преобразована с ПЭТ-24 mPrP(23-231) на ДВС.
    2. Полоса фунтов (Лурия Бертани) плиты с конечной концентрации канамицин 50 мкг/мл и инкубировать на ночь в инкубаторе 37 ° C. Убедитесь, что пластины вверх дном, чтобы избежать конденсации влажности в твердых средах, содержащих бактерии. Подготовьте две пластины, чтобы убедиться в том иметь рост по крайней мере один из двух пластин в.
    3. Подготовить 1 Л LB и автоклав его, чтобы сделать стерильной.
    4. Дополнения 1 Л стерильных LB СМИ с 1 мл канамицин (50 мг/мл) и 1 мл Хлорамфеникол (34 мг/мл).
    5. Выбрать один колонии каждой пластины с помощью одноразовых прививка цикла для инокуляции 3 мл LB носитель, содержащий канамицин и хлорамфеникола.
    6. Место мини культур в инкубаторе при 37 ° C с постоянной тряски на 225 rpm для 5-6 ч.
    7. Добавить мини культур с остальной частью оригинального 1 л LB СМИ вместе с Экспресс аутоиндукции системы 1 для индукции экспрессии белков.
    8. Место культуры в колбе 2 Л, или больше, в инкубаторе при 37 ° C с постоянной тряски на 200 rpm для 20-24 ч.
    9. Разделить 4 x 250 мл пробирок культуры 1 Л.
    10. Спина вниз пробирки, содержащие культуры на 3750 g x 20 мин при комнатной температуре.
    11. Удалить супернатант и собирать бактериальных окатышей в 50 мл пробирок, а затем заморозить их на-80 ° C до дальнейшей обработки. Результате гранулы весил 3-4 g для хорошего белка урожая.
  2. Подготовка Включение тела
    1. оттепель замороженных Пелле (3-4 g) при 37 ° C на несколько минут.
    2. Заморозить гранулы еще один раз за 10 мин при температуре-80 ° C и размораживать снова. Повторите этот шаг, замораживания и оттаивания еще два раза.
    3. Ресуспензируйте бактериальных Пелле в 1 X лизис реагента (например картинку Master Mix), тщательно закупорить. Использование 5 мл реагента для 1 g бактериальных Пелле. Убедитесь, что полностью гомогенизации смеси.
    4. Инкубировать огневки на рокер для 20 мин при комнатной температуре.
    5. Центрифуга огневки на 16000 x g 20 мин при комнатной температуре.
    6. Отбросить supernatants, тщательно поливая его выкл.
    7. Гомогенизировать окатышей в том же объеме 1 X лизис реагент, используемый в предыдущем шаге.
    8. Инкубировать огневки 15 мин на рокер при комнатной температуре.
    9. Добавить достаточный объем 1:10 (0.1 x) лизис реагент для получения всего огневки объемом 40 мл. Микс от инверсии чтобы убедиться, что хорошо гомогенизировать.
    10. Центрифуга огневки на 7900 g x 15 мин на 4 ° C.
    11. Отбросить супернатанта, тщательно поливая его.
    12. Ресуспензируйте гранулы в 40 мл 0.1 x лизис реагент.
    13. Центрифуга огневки на 16000 x g 15 мин на 4 ° C.
    14. Тщательно удалить супернатант, поливая его и хранить гранулы, содержащие включения органов при-20 ° C до дальнейшей обработки.
  3. Очищение протеина
    1. оттаивания включение органы при комнатной температуре.
    2. Распускать органы талой включение в 14 мл 8 M гуанидина HCl (38 g Гуанидин гидрохлорид в 0,1 М Напо 4 рН 8.0 и заполнить подвеска с H 2 O до 50 мл; не регулируйте рН на окончательное решение) чтобы солюбилизировать протеины последнего.
    3. Не забудьте однородный, хорошо закупорить вверх и вниз.
    4. Инкубировать lysate на рокер при комнатной температуре за 50 мин.
    5. Подготовить 18 g Ni-НТА смолы бусины (18 g для бактериальных гранул 3-4 g); промойте их в 100 мл воды с помощью вакуума и топ фильтр бутылка 100 мл 0,22 мкм.
      1. Место 18 g Ni-НТА смолы бусины в 50 мл трубки и добавить достаточный объем денатурации буфер (100 мм фосфат натрия, 10 мм трис, рН 8,0, 6 M Гуанидин гидрохлорид, рН 8), чтобы сделать окончательный объем до 50 мл.
      2. Сбалансировать бусины в буфере денатурируя 50 мин на рокер при комнатной температуре.
    6. Центрифуга включение тела lysate на 16000 x g 5 мин для удаления нерастворимых мусора.
    7. Добавить супернатант в уравновешенной бусины и отбросить гранулы.
    8. Поставить смесь на рокер для 40 мин при комнатной температуре, чтобы разрешить связывание с белками для Ni-НТА смолы.
      Примечание: Никель хелатной бусины используются для очистки PrP ее сродства никеля. Гистидин богатые N-терминальный региона ОТР оказывает близость к nickel(II), который позволяет белка для привязки к никель ионов без каких-либо его тег.
    9. Мыть ПСОК с водой, чтобы очистить обе линии (A и B).
    10. Запуск денатурируя буфера (100 мм фосфат натрия, 10 мм трис, рН 8,0, 6 M Гуанидин гидрохлорид, рН 8) через обе линии (A и B) для премьер системы (столбец еще не прилагается).
    11. Загрузить смолы на столбец. Убедитесь в том свести к минимуму воздушных пузырьков.
    12. Придают столбце ПСОК и запустить линейный градиент от денатурации буфера A 100% и 0% складывая буфера B (фосфат натрия 100 мм, 10 мм трис, рН 8,0) сначала денатурации буфера 0% и 100% складывая буфера к концу. Этот постепенный переход выполняется на скорости потока 0,75 мл/мин 240 мин и необходим для надлежащего складные ОТР.
      Примечание: Во время процесса очистки хроматографического денатурированного ОТР является сначала медленно сложил на смолу, применяя линейный градиент складывая буфера для замены денатурируя буфера. Этот шаг также удаляет гуанидина HCl chaotropic.
    13. Убедитесь, что 100% складывая буфера продолжает течь через колонку для дополнительных 30 мин на 0,75 мл/мин
      14. Линия
    14. промыть водой, после чего буфера (Динатрийфосфат 100 мм, 10 мм трис, 500 мм имидазола, pH 5,8) обход столбец. Это будет очистить денатурируя буфера, которая была заменена теперь Элюирующий буфер в системе AKTA.
    15. Elute белка в 2 мл/мин, запустив линейный градиент для 40 мин от 100% складывая буфера B и 0% Элюирующий буфер A сначала до 0% складывая буфер и 100% Элюирующий буфер.
      Примечание: Высокая концентрация имидазола в Элюирующий буфер будут соревноваться ОТР ' s привязку к nickel(II). Основной белок пик должны начать элюировать около 1/3 пути через градиент.
      1. Смотреть Хроматограмма для ОД 280 Нм увеличить.
    16. Собирать только пробирки, содержащие белок в центре большой пик.
      Примечание: Eluted фракции 2 мл собираются в 15 мл пробирок.
    17. Развести белок, содержащийся в трубы сразу с около 1/3 объема (1 мл) буфера диализа (фосфат натрия 10 мм, pH 5.8).
    18. Сразу же место трубы на ДВС.
    19. Бассейн eluted белок, содержащийся в пробирках.
    20. Бедных белка в диализе кассеты (молекулярный вес производства 10 кДа).
    21. Положил кассеты в буфере (3,6 Л) предварительно охлажденные диализа втечение 2 ч при температуре 4 ° C, а затем передавать кассеты в буфер свежие диализа (3,6 Л) для ночлега. Сделать уверен, что буфер диализа находится под постоянным агитации.
    22. Фильтр белка после диализа через фильтр 0.2 мкм acrodisc шприц, с помощью шприца.
    23. Измерения концентрации белка, с помощью комплекта assay протеина BCA.
    24. Концентрат или разбавления, при необходимости отрегулировать концентрацию белка до 0,3 мг/мл.
      Примечание: Подтвердить чистоту SDS-PAGE и Кумасси синий пятнать.
    25. 1 мл аликвоты белка в microcentrifuge трубы и сразу же хранить при температуре-80 ° C до дальнейшего использования, как описано в протоколе RT-QuIC.

Результаты

CWD фекальных экстрактов, подготовленный на 10% (w/v) смогли семян RT-QuIC реакции, но чувствительность обнаружения была низкой 27. С помощью определенного буфера для фекалий гомогенизации был критический шаг, чтобы избежать высокой фоновой флуоресценции в RT-QuIC ре...

Обсуждение

RT-QuIC ранее работал для выявления CWD прионов мочи и фекальных экстракты устно зараженных белохвостый олень и оленя мула 38. Система, показанной в этой рукописи является адаптированы методом RT-QuIC assay. Дополнительные меры были включены в «классических» RT-QuIC assay для улучшения обн...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарны д-р Байрон Caughey (низ скалистые горы лаборатории) для профессиональной подготовки и плазмид бактериальной выражение ОТР cervid. SG поддерживается программой Канада исследований кафедры. Мы признаем, финансирование для этого исследования SG от Альберта прионных научно-исследовательский институт генома Канады и Альберта сельского и лесного хозяйства через геномом Альберта и университета Калгари в поддержку этой деятельности. Мы признаем исследовательский грант от Фонда Ганн Маргарет животных исследований.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Acrodisc seringe filtersPALL4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter UnitMilliporeUCF901024
BD 10 ml seringeVWRCA75846-842
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
Corning bottle-top vacuum filtersSigma-Aldrich431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE4884
gentleMACS M TubeMiltenyi Biotec130-093-236
Guanidine hydrochlorideSigma-AldrichG4505
ImidazoleSigma-AldrichI5513
IsopropanolSigma-AldrichI9516
Kanamycin sulfateSigma-Aldrich60615
Luria-Bertani (LB) brothThermoFisher Scientific12780029
Magnesium chlorideSigma-AldrichM9272
N2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)Sigma-AldrichML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100KPALLOD100C34
Nunc sealing tapesThermoFisher Scientific232702
Parafilm MVWR52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626
Protease inhibitor tabletRoche4693159001
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Calbiochem7910-OP
sodium phosphateSigma-Aldrich342483
Sodium phosphate dibasic anhydrousSigma-AldrichS9763
Sodium phosphate monobasic monohydrateSigma-AldrichS9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)Sigma-Aldrich496626
Thioflavin TSigma-AldrichT3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)Sigma-AldrichT6066
Triton-100Calbiochem9410-OP
Tween 20Sigma-AldrichP7949
NameCompanyCatalog NumberComments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master MixNogagen71456-4
Ni-NTA superflowQiagen1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)Life TechnoligiesP5493
UltraPure Distilled WaterInvitrogen10977015
NameCompanyCatalog NumberComments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1Novagen71300-4
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLCGE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 CentrifugeBeckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate readerBMG Labtech
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
NameCompanyCatalog NumberComments
Sofware
MARS Data AnalysisBMG Labtech
GraphPad Prism6GraphPad software

Ссылки

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

127RT QuIC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены