Method Article
Сетка электроники датчики бесшовно интегрировать и обеспечивать стабильные, долгосрочные, сингл нейрон уровень записи в головном мозге. Этот протокол использует сетки электроники для экспериментов в естественных условиях , включая изготовление сетки электроники, Загрузка в иглы, стереотаксическая инъекции, интерфейс ввода вывода, записи экспериментов и Гистология ткани, содержащие сетки зонды.
Имплантируемые мозга электрофизиологии зонды являются ценными инструментами в нейробиологии из-за их способности к записи нейронной активности с высоким разрешением пространственно-временных с мелкой и глубокой мозга. Препятствуют их использования, однако, механических и структурные несоответствия между зонды и мозг ткани, что часто ведет к micromotion и глиоза с результате сигнал нестабильность в хронический записи экспериментов. В отличие от, после имплантации непревзойдённые возможности раширения сетки электроники через шприц инъекций сетка зонды форме бесшовные, глиоза бесплатный интерфейс с окружающие ткани мозга, что обеспечивает стабильное отслеживание отдельных нейронов на по крайней мере год Шкала времени. Этот протокол детали ключевые шаги в эксперименте нейронных записи обычно мышь с помощью шприца инъекционные сетка электроники, включая изготовление сетки электроники в стандарт на основе фотолитографии процесс возможно во многих университетах, Загрузка сеть электроники в стандартных капиллярного иглы, стереотаксического инъекций в vivo, подключение сетки ввода/вывода для стандартных приборах интерфейсов, сдержанный или свободно перемещающихся записи сессий и гистологической секционирование головного мозга Ткани содержащие сетка электроники. Представитель нейронных записи и гистология данные представлены. Следователи, знакомы с этот протокол будет иметь знания, необходимые для включения сетки электроники в их собственных экспериментов и воспользоваться уникальными возможностями, предоставляемыми долгосрочные стабильные Нейронные взаимодействия, таких исследований старения процессы, развитие мозга и патогенез заболевания мозга.
Разработка инструментов, способных картирования мозга с резолюцией сингл нейрон имеет центральное значение для неврологии и неврологии. Неинвазивный технологии нейронных исследований например, электроэнцефалография (ЭЭГ), Магнитоэнцефалография (Мэг) и функциональная магнитно-резонансная томография (МРТ) оказались ценным для корреляции активности мозга с поведением людей1, 2, но они не хватает пространственно-временных резолюции необходимые для изучения структуры и динамики нейронных сетей на их основных микрометра и миллисекунды весы, соответственно3,4. Некоторые electrocorticography (ЭГ) датчики и оптических изображений методы, с помощью красителей напряжения чувствительных преуспели в записи единичного пики активности в vivo5,6, но обычно они эффективны только вблизи поверхности мозга, ограничивая применимость для исследования мелкой мозга. В противоположность этому, имплантируемые электрические датчики можно измерить электрофизиологии сингл нейрон в свободно перемещающихся животных из практически любого региона мозга без необходимости люминесцентные маркировки, что делает их незаменимым для систем уровня неврологии, особенно как микротехнологий методов от полупроводниковой промышленности подтолкнули канал рассчитывает в сотни и тысячи3,,78,9. В силу эти возможности имплантируемые электрические датчики сделали много важный вклад неврологии и неврологии, включая фундаментальные исследования, обработки информации в зрительной системы10, лечения неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона11и демонстрация мозг машина интерфейсов (ИСУГ) для продвинутых протезирование12,13.
Тем не менее долговременной нестабильности, проявляется в виде уменьшения всплеска амплитуд и нестабильных сигналов на сроки недель до месяцев14,15 имеет ограниченную применимость имплантируемые зондов для исследования относительно краткосрочных явления, оставляя вопросы, такие, как старение мозга и развития основном без ответа. Ограничения в долговременной нестабильности являются результатом несоответствия между обычных зондов и ткани мозга в размер, механики и топологии14,,1516,17,18. С точки зрения размера, хотя нейрональных синапсах и somata находятся примерно в несколько десятков нанометров до десятков микрометров в диаметре19, соответственно, традиционные зонды часто значительно больше, в случае микроэлектродные кремниевых массивах > 4 раза Размер одного нейрона тела клетки7,8. Относительно большого размера этих датчиков может нарушить естественную структуру и подключения плотной нервной ткани, таким образом способствуя хронической иммунный ответ и нарушается нейронная цепь изучается. С точки зрения механических свойств традиционные датчики значительно жестче, чем чрезвычайно мягких нервной ткани, в которой они вживляются; даже «гибких» зонды из 10-20 мкм толщиной листов полиимида по крайней мере в 100 000 раз жестче, чем мозг ткани20,21. Это несоответствие в изгибаемая жесткость вызывает движение относительный сдвиг между зондом и мозг ткани, приводит к ненадежной единичного отслеживания во время расширенной записи и вызывая хронический глиоза в месте имплантации. Наконец топологической структуры мозга обычных зондов необязательно исключает тома прочной ткани. Такое несоответствие в топологии разрушает связь нейронных цепей, препятствует естественной трехмерной (3D) interpenetrated распределение нейронов и глиальных клеток кровеносных сосудов в ткани мозга22и препятствует 3D перевозки сигнальных молекул23. Вместе эти недостатки обычных зондов сделали их не оправдывают долгосрочный совместимости для клинического применения и продольных неврологии исследований на уровне одного нейрона.
Чтобы преодолеть эти недостатки, мы стремились размыть грань между нервной и электронных систем путем разработки новой парадигмы «ткани как» нейронные зондов, называют сетки электроника16,21,24. Электронные адреса, размер, механики и топологии выше соответствующих вопросов путем включения (1) структурные особенности же нанометр до микрометра размера масштаба нервной ткани, (2) механические свойства аналогичны ткани мозга, и (3) 3D Сетка Макропористые топологии, что > 90% открытое пространство и таким образом приспосабливает взаимопроникновение нейронов и диффузии молекул через внеклеточных среды. Зонды электроника сетки может быть точно доставлен конкретными мозга через шприц и иглу, минимальный острого повреждения во время имплантации даже в глубоких мозга регионах21,25. Нейрональных сома и аксоны было показано, чтобы сочетать структуре зонд электроники открыть 3D-сетку в течение недели после инъекции, создавая тем самым бесшовные, глиоза бесплатный интерфейс между записи электроники и окружающих тканей мозга21 , 26 , 27. Эти уникальные особенности позволили сетки электроники датчики стабильно отслеживать пики активности от же отдельных нейронов над шкалы времени по крайней мере год27. Кроме того изготовление сетки электроники на основе фотолитографии (PL) обеспечивает высокую масштабируемость количество электродов, которые могут быть включены, с продемонстрированной канал рассчитывает до 128 электродов на зонд, с помощью простой контакт маска литография 28 и plug-and-play ввода/вывода (I/O) дизайн, который позволяет для быстрого электрического подключения периферийных электроники без специализированного оборудования29.
Широкий спектр исследований могут извлечь выгоду от включения сетки электроники в протоколы измерений. Большинство intracortical записи экспериментов могут воспользоваться сетки электроники минимально инвазивной имплантации процедуры через шприц инъекции, резкое снижение иммунного ответа, после имплантации, и возможность оставить сетка электроники в ткани во время последующей гистологии и иммуноокрашивания для точного анализа биологической среды вокруг каждого сайта записи. Хронический записи экспериментов в частности будет наследовать значение сетки электроники уникальной способностью отслеживать большое количество отдельных нейронов для месяцев до лет. Эта возможность создает возможности для исследований с одного нейрона резолюции, которые были ранее непрактичным, например продольной старение исследования нейронных цепей, расследований развивающегося мозга, и запросы в патогенезе 16энцефалопатий.
В этом протоколе опишем все ключевые шаги в эксперименте нейронных записи обычно мышь с помощью шприца инъекционные сетки электроники (см. Рисунок 1). Описанные шаги включают в себя изготовление сетки электроники в стандартный процесс, основанный на PL возможно во многих университетах, Загрузка сетки электроники в стандартных капиллярного иглы, стереотаксическая инъекции сетки электроники в естественных условиях, подключение сетки ввода-вывода стандартных приборах интерфейсов, сдержанный или свободно движущихся записи сессий и гистологической секционирование мозговой ткани, содержащие сетки электроники. Некоторые исследователи, с помощью электроники сетки только для гистологии исследования не может требовать электрических интерфейсов и записи, в этом случае они могут пропустить эти шаги. После ознакомления с настоящим Протоколом, следователи должны иметь все знания, необходимые для использования сетки электроники в их собственных экспериментов.
Все процедуры выполняются на позвоночных животных темы были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Гарвардского университета.
1. изготовление сетки электроники
Примечание: Процедура, описанная в этом разделе, предназначен для использования внутри стандартного университета чистой комнате объекта, такие как центр для наноразмерных систем (ЦНС) в Гарвардском университете. Этот фонд, а также аналогичные объекты доступны для внешних пользователей по всему США, например, как часть из национальных нанотехнологии инфраструктуры сети (NNIN) поддержал, Национальный фонд науки (NSF). В этих учреждениях многие из инструментов, оборудования и материалов, описанных в этом разделе предоставляются вместе с доступом к чистой комнате объекта и не требует отдельной покупки.
ВНИМАНИЕ: Многие из химических веществ, используемых при изготовлении сетки электроники являются опасными, включая сопротивляется, CD-26, для удаления PG, Су-8 разработчик и Ni, травления решения. Консультироваться листы данных безопасности материалов (MSDS) для этих химических веществ перед использованием и осуществлять и следовать надлежащие меры безопасности во все времена.
2. Загрузка сетки электроники в иглы
3. Стереотаксическая инъекции сетки электроники в живой мыши мозга
Примечание: Мышей были под наркозом внутрибрюшинной инъекцией смесью кетамина и 1 мг/кг dexdomitor 75 мг/кг. Степень анестезии была проверена с помощью метода щепотку ног до начала операции. Температура тела сохранялся, поместив указатель мыши на 37 ° C гомойотермных одеяло под наркозом. Стерильную методику был реализован для хирургии, включая но не ограничиваясь автоклавирования все металлические хирургические инструменты, за 1 ч до использования, используя стерилизованное перчатки, используя стерилизатор горячей шарик всей операции, поддержании стерильных поля вокруг хирургической сайта, дезинфекции пластиковых инструментов с 70% этанол и депилируемое волосистой части головы с йодофора до разрез был нацелен кожи. Для выживания операций, после завершения операции мазь antiobiotic был применен вокруг раны, и мышь была возвращена в клетку, с 37 ° C, грелку. Мышь не остались без присмотра, до тех пор, пока они достаточно сознание для поддержания грудной recumbency. Мышей были даны бупренорфин анальгезии через внутрибрюшинной инъекции в дозе 0,05 мг/кг массы тела каждые 12 ч до 72 ч после операции. Мышей были изолированы от других животных, после операции. Мышей были умерщвлены через либо внутрибрюшинного введения Пентобарбитал в дозе 270 мг/кг массы тела или через transcardial перфузии (см. шаг 6.1). Следователи может относиться к Гейгер, и др. 30, Кирби, и др. 31и Gage, и др. 32 для подробной информации о грызунах стереотаксической хирургии.
4. входные/выходные интерфейсы
Примечание: на данный момент, сетка электроники зонд был вставлен из желаемого отправной точкой в головном мозге по выбранной траектории. Иглы были отозваны и чуть выше краниотомии с сеткой, который соединяет электроника охватывающих от мозга иглы и ввода/вывода колодки все еще внутри иглу (Рисунок 7B). Этот раздел использует печатная плата (PCB; Рисунок 7, рис. 8) для интерфейса к зонду электроники сетки. PCB соединяет соединитель ZIF разъемом стандартной 32-канальный усилитель через изолирующие подложки, становит руководитель этап для нейронных записи экспериментов. PCB настраивается для размещения различных головы этап конфигурации. Наш дизайн файлы доступны по запросу или из ресурсов веб-сайта, meshelectronics.org и может быть использована для покупки ПХД недорого от поставщиков услуг производство и монтаж PCB.
5. нейронные записи экспериментов
6. гистологические секционирование, окраски и обработки изображений
Результаты будут меняться в зависимости от видов животных в исследовании, целевых мозга регионе, время, прошедшее после инъекции, количество острой ущерб, причиненный во время инъекции и успех операции ввода-вывода, сопряжения процедуры, среди прочих факторов. Единичного пики активности может не появиться до 1 дня до 1 недели после инъекции и Спайк амплитуд может меняться до 4 – 6 недель (в случае 150 мкм внутренний диаметр иглы). На рисунке 9 показано репрезентативных электрофизиологических данных от 32-канальный сетки электроника зонд вводят в гиппокампе и первичная соматосенсорная кора взрослого мужчины C57BL/6J мыши. Приблизительно 300 мкВ амплитуды местных потенциалов поля (LFPs) были записаны на все 32 каналов и единичного пики активности был записан на 26 каналов. LFPs и изолированных шипы оставался аналогичные между 2 и 4 месяцев, предлагая очень стабильный интерфейс между записи электроники и нейронов за этот период длительного времени. На рисунке 10 показано, представитель результаты гистологических секционирование и иммуноокрашивания мозговой ткани, содержащие сетки электроника 1 год после инъекции. Пятнать для NeuN, маркера для нейронных somata и neurofilament, маркер для нервные аксоны, раскрывает практически нет потери плотности ткани в месте инъекции, подразумевая бесшовные взаимодействия между электроники и мозг ткани сетка. Пятнать для СВМС (маркер для астроциты) далее показывает вблизи фоновый уровень астроциты вокруг сетки электроника, указав, что его присутствие вызывает мало хронический иммунный ответ.
Рисунок 1: шаги в шприц инъекционные сетка электроника эксперимент. Этот протокол описывает все ключевые шаги в типичной грызунов нейронных запись эксперимента с использованием сетки электроники. Эксперименты обычно влечет за собой, в порядке осуществления, (1) изготовление сетки электроники, (2) Загрузка сетки электроники в капиллярной иглы, (3) стереотаксического инъекций в мозг, (4) электрического ввода-вывода, взаимодействие сетки сетка электроники Электроника, (5) записи сдержанный или свободно движущихся и (6) сетка/ткани секционирование и пятнать для гистологии. В некоторых исследованиях может потребоваться только гистология данных, в этом случае можно пропустить шаги (4) и (5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема, изображающие порядок изготовления электроники plug-and-play сетки в регионе непревзойдённые возможности раширения устройства (верхняя строка), стволовых приближающую региона (средний ряд) и ввода/вывода региона (Нижняя строка). (A) с PL маска-1 для определения нижней пассивирования слой каждого зонда электроника plug-and-play сетки узором Су-8 негативного фоторезиста (красный). Кучность (B) с PL маска-2, термическое испарение и металлические старт определяют Au соединения и ввода-вывода колодки (золото). (C) патронирования маска-3 PL, испарением электронным пучком и металлические старт определить Pt электродов (синий). (D) с PL маска-4 для определения верхнего пассивирующего слоя узором Су-8 негативного фоторезиста (красный). Отверстия в Су-8 остаются на каждый электрод Pt и панель ввода-вывода. (E) A завершена сетки электроника зонд с указанием местоположений, расширена в верхней, средний и нижней строки пунктирной коробки. Photomask дизайн файлы доступны по запросу от авторов или от ресурсов сайта, meshelectronics.org. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: фотографии и изображения оптический микроскоп plug-and-play сетка электроника. (A) плиткой изображения оптический микроскоп шприц инъекционные сетки электроника зонда с вывода plug-and-play. Зонд был образ после завершения изготовления шаги на рисунке 2 , но до выхода из субстрата Ni покрытием. Пунктирной коробки соответствуют слева направо к разделам непревзойдённые возможности раширения устройства региона, стволовых и ввода-вывода региона усиливается в C, D и Е, соответственно. Шкалы бар = 1 mm. (B) фотография 3 дюймовый Si пластин, содержащий 20 завершена сетки электроники датчики. Шкалы бар = 20 mm. (C) оптический микроскоп изображение 20 мкм диаметром Pt записи электродов в регионе непревзойдённые возможности раширения устройства. Шкалы бар = 100 µm. (D) оптический микроскоп изображение высокой плотности Au межсоединений в регионе стволовых. Каждый соединительный Au электрически изолированы и соединяет один электрод Pt площадку одной операции ввода-вывода. Шкалы бар = 100 µm. (E) оптический микроскоп изображение прокладки ввода-вывода. Каждая панель состоит из Складная сетка региона и непрерывной тонкопленочных области, расположен на стволе. Non проведение Су-8 ленты Соедините части колодки вместе, чтобы помочь сохранить выравнивание сетки. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Ассамблея аппарата для проведения капиллярного иглы во время инъекции. (A) фотография компонентов аппарата. Компоненты включают в себя (1) иголку стеклянные капиллярные, (2 держатель пипетки, (3 круговой винт крепления держателя пипетки и шайбу (4 конуса для держателя пипеткой. Пункты (2) через (4) поставляется с пипеткой держателя. Стрелка показывает на выходе из пипетки держатель, который необходимо быть склеены закрытые с эпоксидной. (B) фотография владельца пипетки после сборки и вставки стеклянные капиллярные иглы. Добавлен эпоксидной смолы видна на верхнем выходе держателя пипетки (отмечен стрелкой) и капиллярной трубки соединяет держателя пипетки к шприцу (не показан). (C) фотография держателя пипетки и капиллярной иглы после привязанность к Стереотаксическая рама с струбциной правый конец. Масштаб гистограммы являются 1 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Загрузка сетки электроники в стеклянных иголок. (A) схематическая иллюстрация процедуры загрузки для электроники plug-and-play сетки. Стеклянный иглу позиционируется в конце ввода/вывода зонда электроника сетки пока она приостановлена в растворе. Поршень шприца втягивается затем вручную рисовать в зонд электроники сетки. Идеальное позиционирование-регионе непревзойдённые возможности раширения устройство только внутри конца иглы. Фотографии (B), (A) соответствующие зонда электроники сетки загружаются в стеклянных иглу. Масштаб баров = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: схема станции стереотаксической хирургии. Моторизованных Стереотаксическая рама (A) с прилагаемый пипеткой держатель используется для позиционирования иглы в желаемой мозга регионе. Положение иглы и электроники загружены сетки контролируются с объектива и придает камеры (B) и отображаются на компьютере (C). Шприцевой насос (D) потоки точные объемы физиологического раствора через иглу, позволяя для точной, контролируемых инъекции сетки электроники в регионе желаемого мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: ввода-вывода Plug-and-play, процедура сопряжения. (A) FFC зажима субстрат обеспечивается с стоматологического цемента, прилегающих к краниотомии. (B) Plug-and-play сетки электроника stereotaxically вводят в регионе желаемого мозг с помощью метода ПЗ. (C) игла, с ввода-вывода колодки сетки электроника зонд до сих пор внутри, перемещен над ФСГ зажима субстрата. (D) поток возобновляется через иглу извлечь прокладки ввода-вывода на ФСГ зажима субстрата. (E) операций ввода-вывода подушечки изогнутых 90 ° относительно ствола, развернули проведение стороной вверх и сушат в месте. (F) ФСГ субстрат обрезается с ножницами прямолинейных ОК. 0,5 мм от края колодки ввода-вывода. Вырезать избыточное субстрат прочь, чтобы разрешить вставку в разъем ZIF 32-канальный. (G) операций ввода-вывода колодки вставляются в разъем ZIF 32-канальный, установленный на пользовательских ПХД. Разъем ZIF является запертом закрытой сделать контакт с колодками ввода-вывода. Цементированный (H) Защелка закрыта, PCB переворачивается на череп, и PCB фиксируется на месте с стоматологического цемента. (я) PCB образует компактный headstage с разъемом стандарта усилитель для легко взаимодействие во время записи сессий. Масштаб баров = 1 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: сдержанные и свободно движущихся записей. (A) фотография мужчины C57BL/6J мыши в фиксатор во время сеанса записи. 32-канальный предусилитель ПХД были вставлены в разъем Стандартный усилитель. (B) фотография же мышь с 32-канальный предусилитель ПХД во время свободно движущихся запись эксперимента. Масштаб баров = 1 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: результаты представитель нейронных записи. (A) представитель LFP тепловые карты от 32-канальный сетка электроники датчики, вводят в гиппокампе мыши и соматосенсорной коры. Данные были записаны в то время как мыши свободно изучить его клетку на 2 месяца (вверху) и впрыск 4 месяца (внизу). Амплитуда LFP цветом согласно панель цвета справа. ВЧ-отфильтрованных следы (черный) пики активности накладываются на спектрограмме для каждого из 32 каналов. (B) шипы изолированные после сортировки данных на диаграмме в (A). Единичного пики активности был обнаружен на 26 каналов 32 впрыск 2 месяца (вверху) и 4 месяца впрыск (внизу). Номера выше каждый кластер шипы соответствуют номерам каналов в (A). Эта цифра была изменена от Фу, и др. 28. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: результаты представитель Гистология. (A) схема, иллюстрирующая ориентацию сетки электроники в течение горизонтальный (средняя группа) и сагиттальной (Нижняя панель) срезы мозга. (B) флуоресценции Микроскоп изображение фрагмента 10 мкм толщина коры мозга один год после введения зонда электроника 16-канальный сетки. Срез был immunostained для NeuN (зеленый). (C) же срез мозга immunostained для neurofilament (красный). (D) же immunostained срез мозга для СВМС (голубой). (E) A составное изображение (b) – (D) показаны электроника/ткани сетка интерфейс с метками NeuN (зеленый), neurofilament (красный), СВМС (голубой) и сетка электроника (синий). Масштаб баров = 100 мкм. Эта цифра была изменена от Фу и др. 27. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные видео 1: повторил погрузки и инъекции сетки электроники в раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Все этапы изготовления и использования сетки электроники являются важными, но некоторые имеют особенно важное значение. Прежде чем отпустить сетки электроники от их пластин, важно для окисления поверхности сделать сетки легко приостановлено в водном растворе (шаг 1.6.1). Если этот шаг пропускается, сетки обычно плавают на поверхности воды, что делает их трудно загрузить в иглы, и если они могут быть загружены, они часто придерживаться стороны стекла иглы, требующих больших объемов (> 100 мкл) для инъекций. Отказ для окисления поверхности до выпуска, поэтому, обычно означает, что нельзя использовать сетки и изготовления должны быть повторно выполняется с самого начала. Еще один важный шаг изгиб сетки электроники «остановить» ~ 90 ° во время ввода-вывода, взаимодействие (шаг 4.3). Если угол меньше 90°, то все 32 колодки ввода-вывода не помещается в разъем ZIF; Некоторые должны будут быть отрезаны конца, чтобы разрешить вставку, сокращение числа подключенных электродов. Процесс также должно быть сделано мягко для предотвращения ствола от взлома.
Дизайн сетки электроники можно настроить для различных приложений, изменив фотошаблонов и используя ту же процедуру изготовления, изложенные на рисунке 2. Например в то время как зонды электроники сетки, используемый для записи данных на рисунке 9 были разработаны для иметь 32 запись электродов охватывают мыши гиппокампа и первичной соматосенсорной коры, размещение электродов внутри непревзойдённые возможности раширения сетки может быть выбранный целевой практически любого регион(ы) мозга, или больше электродов для стимуляции могут быть включены27. Та же процедура структуры и изготовление простой сетки, сохраняются, но размещение электродов и дизайн корректируются для удовлетворения потребностей исследования. Следователи следует использовать осторожно, однако и всегда проверить, что изменение конструкции могут быть легко введены через предполагаемой иглы. Небольшие изменения для гибки механики и электроники сетки может иметь существенные последствия для injectability. Одним из таких примеров является что 45° угла между продольной и поперечной Су-8 ленты дает зонд электроника сетки, которые могут быть введены в соответствии, но под углом в 90° приводит в одном, что мнет и забивает иглы21.
Измерение импеданса электродов записи полезен для устранения неполадок. 20-мкм диаметр круговой Pt электрод должен иметь импеданс величины около 1 MΩ когда измеряется на частоте 1 кГц в естественных условиях или в 1 x PBS29. Импеданс значительно больше, чем это предполагает, что электрод является не подвергаются, как может случиться, если она загрязнена с остатками фоторезиста или не электрически подключен. Последний может произойти, если, например, пыль на фото маска во время ком, который соединяет результаты в разрыв в АС, или если один из колодки сетки ввода-вывода не связался по контактов разъема ZIF во время интерфейс ввода/вывода. Импеданс величины примерно половину ожидаемое значение свидетельствует о том, что канал может быть замкнуты в соседнюю, создавая цепи два электрода импедансов параллельно друг другу. Измеренное сопротивление значения действуют как руководство во время устранения неполадок; в сочетании с оптической микроскопии сетки электроники зондов, источник проблемы можно обычно выявлены и исправлены соответственно в следующий изготовления запустить или попытка интерфейс ввода/вывода.
Использование сетки шприц инъекционные электроники для острой исследования ограничен в том, что обычно единичного пики активности не наблюдается до 1 недели поста инъекций27, хотя недавняя работа (Неизданное) показывает, что эта проблема легко преодолеть. Ключевыми факторами, определяющими времени, необходимого для видеть пики активности mesh дизайн, объем жидкости вводят в мозг наряду с сеткой электроники и диаметр иглы, используемые для инъекций, как они влияют на степень повреждения тканей во время инъекции и скорость исцеления. Объемы большие инъекции может потребоваться, если сетка электроника не относиться с кислородной плазмы до выхода в Ni etchant; то есть если сетка не гидрофильные, он может придерживаться стекла иглы. Иногда сетки имеют дефекты, которые приводят к изгибу механики, которые делают их трудно внедрить. Во время загрузки сетки электроники, важно проверить, что сетки движутся легко и плавно в пределах иглы (как показано в дополнительных видео 1). Если нет, то должны использоваться различные сетки электронный зонд. Лучшие результаты для бесшовных Нейронные взаимодействия будет достигаться с идеальной инъекции тома 10-50 мкл на введенный сетка длиной 4 мм. Более недавние результаты с тонкой сетки электроники датчики вводят или меньшего диаметра капилляров иглы (как малые, как внутренний диаметр 150 мкм, диаметр 250 мкм) показывают, что единое целое пики могут наблюдаться от вскоре после инъекции (острый измерения) через более длительное время. Маска дизайн файлы для этих тонкой структуры сетки доступны по запросу или из ресурсов веб-сайта, meshelectronics.org. Мы оценить общую доходность наших в vivo сетки инъекции процедур с использованием иглы (наружный диаметр 650 мкм) внутренний диаметр 400 мкм составляет около 70%, хотя урожай ближе к 80 – 90% нашей более поздние работы с 150 мкм внутренний диаметр (250 мкм наружный диаметр ) иглы. Наиболее распространенные причины неудачи являются (1) что сетка не вводите гладко, что приводит к отек мозга с неожиданно большим инъекции томов в мозг, (2) сетка обрыва во время ручной манипуляции требуется ввода-вывода, интерфейсы, процедуры и (3) кровотечение из повреждения кровеносных сосудов во время инъекции. Повреждение кровеносных сосудов во время инъекций встречается редко (причиной менее 10% сбоев) и может быть сокращен еще с помощью изображений руководствоваться хирургии. Мы также отмечаем, что повреждение кровеносных сосудов является общее ограничение всех процедур с участием проникновения в ткани мозга, включая инъекции вирусных частиц для transfection, имплантацией жесткой мозга зондов и инъекции сетки электроники.
Сетка электроники датчики способны стабильно записи и отслеживать же отдельных нейронов на по крайней мере месяца в год сроков и вызывают почти нет хронической иммунного ответа, как показано на рисунке 9 и Рисунок 10, соответственно. Это представляет собой значительное преимущество по сравнению с Конвенцией глубиной электродов, которые часто страдают от снижения Спайк амплитуд, нестабильных сигналов и хронического воспаления в течение долгосрочного записи экспериментов14, 15. Кроме того, электроника сетки имеют то преимущество, что они могут быть оставлены в тканях при резании гистологические, окрашивание, и изображений, в отличие от обычных зондов, которые являются слишком жесткими и поэтому должны быть удалены перед гистологии анализ. Следовательно сетка электроники позволяют уникальную возможность использования Иммуногистохимический анализ именно изучение клеточной среды вокруг каждого сайта записи.
Протокол представил здесь открывается вверх захватывающие новые возможности в неврологии. Метод доставки минимально инвазивных и бесшовной интеграции сетки электроники с ткани мозга минимизирует нарушения нейронных цепей и избегает хронический иммунный ответ, который выиграет большинство видов хронической нейронных записи экспериментов. Способность сетки Электроника для записи и отслеживания же единого нейронов для длительных периодов времени будет особенно интерес для следователей, стремясь соотнести миллисекунды шкала пики активности с месяц годичного процессы, такие как старение, Патогенез заболевания мозга, или мозга развития16,18. Кроме того, существуют значительные возможности для расширения и настройки этот протокол, например добавление активной электроники голову PCB-сцену, чтобы реализовать функциональность как цифровое мультиплексирование8,35, Беспроводные коммуникации в35,,3637и обработки35, совместное инъекций стволовых клеток или полимеры с сетки электроники для помощи в ткани регенерации18,38, сигналов 39и включение нанопроволоки транзисторы field - effect (NW-FETs) в mesh электроники весьма локализованные и многофункциональный мозга зонды24,29,40,41 ,42.
Авторы не имеют ничего сообщать.
C.M.L. признает поддержку этой работы военно-воздушных сил управлением научных исследований (FA9550-14-1-0136), Гарвардского университета естественных наук и инженерных ускоритель премии и национальных институтов здравоохранения режиссера Pioneer Award ( 1DP1EB025835-01). T.G.S. отмечает поддержку министерством обороны (DoD) через программу национальной обороны науки и инженерных выпускников стипендий (NDSEG). Г.Х. признает стипендии от Американской ассоциации сердца (16POST27250219) и путь к независимости Award (родитель K99/R00) от национального института по проблемам старения национальных институтов здоровья. Эта работа была выполнена частично в Гарвардском университете центр для наноразмерных систем (ЦНС), членом из национального нанотехнологии скоординированной инфраструктуры сети (NNCI), который поддерживается Национальный научный фонд под NSF ECCS премии № 1541959.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Motorized stereotaxic frame | World Precision Instruments | MTM-3 | For mouse stereotaxic surgery |
512-channel recording controller | Intan Technologies | C3004 | A component of the neural recording system |
RHD2132 amplifier board | Intan Technologies | C3314 | A component of the neural recording system |
RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable | Intan Technologies | C3213 | A component of the neural recording system |
Mouse restrainer | Braintree Scientific | TV-150 STD | Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions. |
Si wafers | Nova Electronic Materials | 3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats & 6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides. | |
Photomasks (chrome on soda lime glass) | Advance Reproductions | Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site. | |
AutoCAD software | Autodesk Inc. | Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. | |
Thermal evaporator | Sharon Vacuum | Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool. | |
SU-8 2000.5 negative photoresist | MicroChem Corp. | Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics. | |
MA6 mask aligner | Karl Suss Microtec AG | Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
SU-8 developer | MicroChem Corp. | Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light. | |
LOR3A lift-off resist | MicroChem Corp. | Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes | |
Shipley 1805 positive photoresist | Microposit, The Dow Chemical Company | Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics | |
MF-CD-26 positive photoresist developer | Microposit, The Dow Chemical Company | To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical. | |
Spin coater | Reynolds Tech | For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters. | |
PJ plasma surface treatment system | AST Products, Inc. | Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
Electron beam evaporator | Denton Vacuum | For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool. | |
Remover PG | MicroChem Corp. | Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off | |
Ferric chloride solution | MG Chemicals | 415-1L | A component of Ni etching solution |
36% hydrochloric acid solution | Kanto Corp. | A component of Ni etching solution | |
Glass capillary needles | Drummond Scientific Co. | Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available. | |
Micropipette holder U-type | Molecular Devices, LLC | 1-HL-U | Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection |
1 mL syringe | NORM-JECT®, Henke Sass Wolf | Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles | |
Polyethylene intrademic catheter tubing | Becton Dickinson and Company | Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm | |
5 mL syringe | Becton Dickinson and Company | Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo | |
Eyepiece camera | Thorlabs Inc. | DCC1240C | Used to view mesh electronics within capillary needles during injection |
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras | Thorlabs Inc. | Used to view mesh electronics within capillary needles during injection | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics |
EXL-M40 dental drill | Osada | 3144-830 | For drilling the craniotomy |
0.9 mm drill burr | Fine Science Tools | 19007-09 | For drilling the craniotomy |
Hot bead sterilizer 14 cm | Fine Science Tools | 18000-50 | Used to sterlize surgical instruments |
CM1950 cryosectioning instrument | Leica Microsystems | Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility. | |
0.3% Triton x-100 | Life Technologies | Used for histology | |
5% goat serum | Life Technologies | Used for histology | |
3% goat serum | Life Technologies | Used for histology | |
Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab177487 | Used for histology |
Mouse anti-Neurofilament | Abcam | ab8135 | Used for histology |
Rat anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific Inc. | PA516291 | Used for histology |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific Inc. | P36930 | Used for histology |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich Corp. | P6407-5MG | Molecular weight = 70-150 kDA |
Right-angle end clamp | Thorlabs Inc. | RA180/M | Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame |
Printed circuit board (PCB) | Advanced Circuits | Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org | |
32-channel standard amplifier connector | Omnetics Connector Corp. | A79024-001 | Component assembled onto the PCB |
32-channel flat flexible cable (FFC) | Molex, LLC | 152660339 | Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector |
32-channel zero insertion force (ZIF) connector | Hirose Electric Co., LTD | FH12A-32S-0.5SH(55) | Component assembled onto the PCB |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены