Шприц инъекционные сетки электроники для стабильной хронической грызунов электрофизиологии

Резюме

Сетка электроники датчики бесшовно интегрировать и обеспечивать стабильные, долгосрочные, сингл нейрон уровень записи в головном мозге. Этот протокол использует сетки электроники для экспериментов в естественных условиях , включая изготовление сетки электроники, Загрузка в иглы, стереотаксическая инъекции, интерфейс ввода вывода, записи экспериментов и Гистология ткани, содержащие сетки зонды.

Аннотация

Имплантируемые мозга электрофизиологии зонды являются ценными инструментами в нейробиологии из-за их способности к записи нейронной активности с высоким разрешением пространственно-временных с мелкой и глубокой мозга. Препятствуют их использования, однако, механических и структурные несоответствия между зонды и мозг ткани, что часто ведет к micromotion и глиоза с результате сигнал нестабильность в хронический записи экспериментов. В отличие от, после имплантации непревзойдённые возможности раширения сетки электроники через шприц инъекций сетка зонды форме бесшовные, глиоза бесплатный интерфейс с окружающие ткани мозга, что обеспечивает стабильное отслеживание отдельных нейронов на по крайней мере год Шкала времени. Этот протокол детали ключевые шаги в эксперименте нейронных записи обычно мышь с помощью шприца инъекционные сетка электроники, включая изготовление сетки электроники в стандарт на основе фотолитографии процесс возможно во многих университетах, Загрузка сеть электроники в стандартных капиллярного иглы, стереотаксического инъекций в vivo, подключение сетки ввода/вывода для стандартных приборах интерфейсов, сдержанный или свободно перемещающихся записи сессий и гистологической секционирование головного мозга Ткани содержащие сетка электроники. Представитель нейронных записи и гистология данные представлены. Следователи, знакомы с этот протокол будет иметь знания, необходимые для включения сетки электроники в их собственных экспериментов и воспользоваться уникальными возможностями, предоставляемыми долгосрочные стабильные Нейронные взаимодействия, таких исследований старения процессы, развитие мозга и патогенез заболевания мозга.

Введение

Разработка инструментов, способных картирования мозга с резолюцией сингл нейрон имеет центральное значение для неврологии и неврологии. Неинвазивный технологии нейронных исследований например, электроэнцефалография (ЭЭГ), Магнитоэнцефалография (Мэг) и функциональная магнитно-резонансная томография (МРТ) оказались ценным для корреляции активности мозга с поведением людей^{1, 2}, но они не хватает пространственно-временных резолюции необходимые для изучения структуры и динамики нейронных сетей на их основных микрометра и миллисекунды весы, соответственно^3,4. Некоторые electrocorticography (ЭГ) датчики и оптических изображений методы, с помощью красителей напряжения чувствительных преуспели в записи единичного пики активности в vivo^5,6, но обычно они эффективны только вблизи поверхности мозга, ограничивая применимость для исследования мелкой мозга. В противоположность этому, имплантируемые электрические датчики можно измерить электрофизиологии сингл нейрон в свободно перемещающихся животных из практически любого региона мозга без необходимости люминесцентные маркировки, что делает их незаменимым для систем уровня неврологии, особенно как микротехнологий методов от полупроводниковой промышленности подтолкнули канал рассчитывает в сотни и тысячи^3,,78,9. В силу эти возможности имплантируемые электрические датчики сделали много важный вклад неврологии и неврологии, включая фундаментальные исследования, обработки информации в зрительной системы¹⁰, лечения неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона¹¹и демонстрация мозг машина интерфейсов (ИСУГ) для продвинутых протезирование^12,13.

Тем не менее долговременной нестабильности, проявляется в виде уменьшения всплеска амплитуд и нестабильных сигналов на сроки недель до месяцев^14,15 имеет ограниченную применимость имплантируемые зондов для исследования относительно краткосрочных явления, оставляя вопросы, такие, как старение мозга и развития основном без ответа. Ограничения в долговременной нестабильности являются результатом несоответствия между обычных зондов и ткани мозга в размер, механики и топологии^{14,,1516,17,18}. С точки зрения размера, хотя нейрональных синапсах и somata находятся примерно в несколько десятков нанометров до десятков микрометров в диаметре¹⁹, соответственно, традиционные зонды часто значительно больше, в случае микроэлектродные кремниевых массивах > 4 раза Размер одного нейрона тела клетки^7,8. Относительно большого размера этих датчиков может нарушить естественную структуру и подключения плотной нервной ткани, таким образом способствуя хронической иммунный ответ и нарушается нейронная цепь изучается. С точки зрения механических свойств традиционные датчики значительно жестче, чем чрезвычайно мягких нервной ткани, в которой они вживляются; даже «гибких» зонды из 10-20 мкм толщиной листов полиимида по крайней мере в 100 000 раз жестче, чем мозг ткани^20,21. Это несоответствие в изгибаемая жесткость вызывает движение относительный сдвиг между зондом и мозг ткани, приводит к ненадежной единичного отслеживания во время расширенной записи и вызывая хронический глиоза в месте имплантации. Наконец топологической структуры мозга обычных зондов необязательно исключает тома прочной ткани. Такое несоответствие в топологии разрушает связь нейронных цепей, препятствует естественной трехмерной (3D) interpenetrated распределение нейронов и глиальных клеток кровеносных сосудов в ткани мозга²²и препятствует 3D перевозки сигнальных молекул²³. Вместе эти недостатки обычных зондов сделали их не оправдывают долгосрочный совместимости для клинического применения и продольных неврологии исследований на уровне одного нейрона.

Чтобы преодолеть эти недостатки, мы стремились размыть грань между нервной и электронных систем путем разработки новой парадигмы «ткани как» нейронные зондов, называют сетки электроника^16,21,24. Электронные адреса, размер, механики и топологии выше соответствующих вопросов путем включения (1) структурные особенности же нанометр до микрометра размера масштаба нервной ткани, (2) механические свойства аналогичны ткани мозга, и (3) 3D Сетка Макропористые топологии, что > 90% открытое пространство и таким образом приспосабливает взаимопроникновение нейронов и диффузии молекул через внеклеточных среды. Зонды электроника сетки может быть точно доставлен конкретными мозга через шприц и иглу, минимальный острого повреждения во время имплантации даже в глубоких мозга регионах^21,25. Нейрональных сома и аксоны было показано, чтобы сочетать структуре зонд электроники открыть 3D-сетку в течение недели после инъекции, создавая тем самым бесшовные, глиоза бесплатный интерфейс между записи электроники и окружающих тканей мозга^{21 , 26 , 27}. Эти уникальные особенности позволили сетки электроники датчики стабильно отслеживать пики активности от же отдельных нейронов над шкалы времени по крайней мере год²⁷. Кроме того изготовление сетки электроники на основе фотолитографии (PL) обеспечивает высокую масштабируемость количество электродов, которые могут быть включены, с продемонстрированной канал рассчитывает до 128 электродов на зонд, с помощью простой контакт маска литография ²⁸ и plug-and-play ввода/вывода (I/O) дизайн, который позволяет для быстрого электрического подключения периферийных электроники без специализированного оборудования²⁹.

Широкий спектр исследований могут извлечь выгоду от включения сетки электроники в протоколы измерений. Большинство intracortical записи экспериментов могут воспользоваться сетки электроники минимально инвазивной имплантации процедуры через шприц инъекции, резкое снижение иммунного ответа, после имплантации, и возможность оставить сетка электроники в ткани во время последующей гистологии и иммуноокрашивания для точного анализа биологической среды вокруг каждого сайта записи. Хронический записи экспериментов в частности будет наследовать значение сетки электроники уникальной способностью отслеживать большое количество отдельных нейронов для месяцев до лет. Эта возможность создает возможности для исследований с одного нейрона резолюции, которые были ранее непрактичным, например продольной старение исследования нейронных цепей, расследований развивающегося мозга, и запросы в патогенезе ¹⁶энцефалопатий.

В этом протоколе опишем все ключевые шаги в эксперименте нейронных записи обычно мышь с помощью шприца инъекционные сетки электроники (см. Рисунок 1). Описанные шаги включают в себя изготовление сетки электроники в стандартный процесс, основанный на PL возможно во многих университетах, Загрузка сетки электроники в стандартных капиллярного иглы, стереотаксическая инъекции сетки электроники в естественных условиях, подключение сетки ввода-вывода стандартных приборах интерфейсов, сдержанный или свободно движущихся записи сессий и гистологической секционирование мозговой ткани, содержащие сетки электроники. Некоторые исследователи, с помощью электроники сетки только для гистологии исследования не может требовать электрических интерфейсов и записи, в этом случае они могут пропустить эти шаги. После ознакомления с настоящим Протоколом, следователи должны иметь все знания, необходимые для использования сетки электроники в их собственных экспериментов.

протокол

Все процедуры выполняются на позвоночных животных темы были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Гарвардского университета.

1. изготовление сетки электроники

Примечание: Процедура, описанная в этом разделе, предназначен для использования внутри стандартного университета чистой комнате объекта, такие как центр для наноразмерных систем (ЦНС) в Гарвардском университете. Этот фонд, а также аналогичные объекты доступны для внешних пользователей по всему США, например, как часть из национальных нанотехнологии инфраструктуры сети (NNIN) поддержал, Национальный фонд науки (NSF). В этих учреждениях многие из инструментов, оборудования и материалов, описанных в этом разделе предоставляются вместе с доступом к чистой комнате объекта и не требует отдельной покупки.

ВНИМАНИЕ: Многие из химических веществ, используемых при изготовлении сетки электроники являются опасными, включая сопротивляется, CD-26, для удаления PG, Су-8 разработчик и Ni, травления решения. Консультироваться листы данных безопасности материалов (MSDS) для этих химических веществ перед использованием и осуществлять и следовать надлежащие меры безопасности во все времена.

1. Термически испаряются 100 Нм Ni на чистой Si пластин.
   Примечание: Параметры типичный осаждения являются базовый давление 5 x 10^-7 T и скорость 1 – 2 Е/с. Тонкий слой Ni служит жертвенный слой, который будет позже распущен выпустить сетки электроники от пластины.
2. Используйте первый маска PL (PL маска-1) для определения нижней пассивирования слоя сетки электроники с Су-8 негативного фоторезиста (рис. 2A).
   Примечание: PL-Стандартный микротехнологий техника, в которой ультрафиолетового (УФ) свет сиял на маску над фоточувствительные субстрата. Свет либо делает нерастворимые (отрицательные резисты) или растворимые (позитивные резисты) открытые участки на подложке. Маски в программное обеспечение автоматизированного проектирования (САПР) и затем обычно приказал от поставщика. Выравниватель маски используется для выравнивания маски для существующих шаблонов на подложке и подвергать их УФ света. Изготовление сетки электроники требует четыре различных масок (PL маска-1 через PL маска-4). Наши проекты маска доступны по запросу или из ресурсов сайта, meshelectronics.org.
   1. Спин пальто 2000.5 Су-8 негативного фоторезиста на пластины на 4000 rpm для приблизительной толщины Су-8 400 – 500 Нм.
   2. Мягкие выпекать пластин на конфорку за 1 мин при температуре 65 ° C следуют 1 мин на 95 ° C.
   3. Загрузка пластин в маска выравниватель подвергать Су-8 с PL маска-1 соответствует нижнего слоя сетки Су-8. Предоставлять на i линия (волны 365 Нм) в дозе 100 МДж/см².
   4. Пост выпекать пластин на конфорку за 1 мин при 65 ° C, после чего 1 мин на 95 ° C.
   5. Погружайте вафельные в лоток разработчик Су-8. Аккуратно агитируйте решение для 2 мин до тех пор, пока шаблон сетки в Су-8 были полностью разработаны. Промыть в лоток изопропилового спирта на 1 мин и сушить.
   6. Крепко выпекать пластин на конфорку на 180 ° C в течение 1 ч.
      Примечание: Су-8 обычно трудно запеченная между 150 ° C до 250 ° C, после развития. Жесткий испечь anneals любой поверхности трещин, которые могут образовываться в ходе разработки и дальнейшего сшивки Су-8 для обеспечения механической стабильности. Крепко выпечки при 180 ° C для нижнего слоя Су-8 и 190 ° C для топ-Су-8 слой дает хорошие результаты для сетки электроники.
3. Использование PL маска-2 для определения металла соединения и ввода-вывода прокладки (рис. 2B).
   1. Спин пальто LOR3A на пластины на 4000 rpm для приблизительный толщина 300 Нм.
      Примечание: LOR3A является polydimethylglutarimide на основе устоять какой скорости, подрывая во время процедуры последующей металлизации.
   2. Выпекать пластин на конфорку при 180 ° C за 5 мин.
   3. Спин пальто S1805 позитивный фоторезист при 4000 об/мин для приблизительной толщины 500 Нм.
   4. Выпекать пластин на конфорку при 115 ° C за 1 мин.
   5. Загрузите пластин в маску выравниватель для разоблачения, который соединяет S1805 с PL маска-2 соответствует металла и ввода-вывода колодки. Предоставлять в дозе 40 МДж/см²h линия (волны 405 нм).
   6. Погружайте вафельные в лоток CD-26 фоторезиста разработчика. Аккуратно агитируйте решение за 1 мин до тех пор, пока металл приближающую шаблон был полностью разработан. Промыть в лоток для деонизированной воды (DI), за 1 мин и сушить.
   7. Термически испаряются 3 Нм Cr следуют 80 Нм Au.
      Примечание: Базовый давление в большинстве 5 x 10^-7 T и скорость осаждения 1 Å/s обычно дают лучшее качество фильма.
   8. Погрузите вафля в плоский стакан для удаления PG для примерно 3 ч до тех пор, пока металл полностью подрывают, оставляя металл только в нужный соединительный и регионах панель ввода-вывода сетки электроники. Промыть в изопропиловый спирт и сушить.
4. Для определения Pt электродов (рис. 2 c) используйте PL маска-3.
   1. Повторите шаги 1.3.1 через 1.3.4.
   2. Загрузите пластин в маску выравниватель подвергать S1805 с PL маска-3 соответствует Pt электродов. Разоблачить h линии дозе 40 МДж/см².
   3. Погружайте вафельные в лоток CD-26 фоторезиста разработчика. Аккуратно агитируйте решение за 1 мин до тех пор, пока шаблон Pt электроды были полностью разработаны. Промыть в лоток ди за 1 мин и сушить.
   4. Использование испарителя пучка электронов для депозита 3 Нм Cr следуют 50 Нм Pt.
      Примечание: Параметры типичный осаждения являются базовым давление 5 x 10^-7 T и скорость 2 Å / s.
   5. Погрузите вафля в плоский стакан для удаления PG для примерно 3 ч до тех пор, пока металл полностью подрывают, оставляя Pt только на участках желаемого электрода сетки электроники. Промыть в изопропиловый спирт и сушить.
5. PL маска-4 используется для определения верхней пассивирования слоя сетки электроники с Су-8 негативного фоторезиста (Рисунок 2D).
   1. Повторите шаги 1.2.1 через 1.2.5, за исключением подвергая с PL маска-4 соответствует верхней пассивирующего слоя сетки Су-8.
   2. Крепко выпекать пластин на конфорку на 190 ° С в течение 1 ч.
      Примечание: Эта температура-10 ° C выше, чем для жесткого выпекать нижней Су-8 (шаг 1.2.6). Это повышенная температура слегка перекомпоновке нижней Су-8, заставляя его слияния с верхним слоем Су-8 и таким образом образуют единую, постоянно структуры Су-8.
6. Сеть электроники являются теперь закончить (Рисунок 2E и рис. 3); Освободите их от Si пластин, растворяя Ni жертвенного слоя.
   1. Лечить пластин с кислородной плазмы на 50 Вт на 1 мин. Это окисляет Су-8 поверхности, что делает его гидрофильные и позволяя сетки легко быть приостановлено в водном растворе.
   2. В плоский стакан, объединить соляной кислоте, хлориду и ди в объемном соотношении 1:1:20, соответственно, чтобы сделать раствор Ni etchant.
   3. Погрузите вафля в плоский стакан Ni протравливающего решение для примерно 3 ч до тех пор, пока электроника сетка полностью были освобождены от Si пластин.
   4. Используете пипетку Pasteur для передачи выпустила сетки, которую электроники датчики с Ni etchant к 100 мл стакан ди. Передать сетки электроника свежие стакан ди по крайней мере 3 раза для полоскания.
   5. Для передачи электроника сетки на 70% / 30% этанола/воды решение для дезинфекции используйте пипетки Пастера, а затем использовать пипетку для передачи сетки электроники в стерильной водой для ополаскивания.
      Примечание: После стерилизации, электроника сетки могут быть переданы другим решениям для функционализации. Например для содействия клеточной адгезии, электроника сетки могут быть переданы водный раствор поли D-Лизин (1 мг/мл) за 24 ч.
   6. Использование пипетки Пастера передать сетки электроники датчики в стакан 100 мл стерильного 1 x фосфата буфер солевой раствор (PBS) до инъекции в естественных условиях.

2. Загрузка сетки электроники в иглы

1. Пипетка держателя как купил открыт для потока на обоих концах. Печать конце напротив круговой винт крепления с эпоксидной, так что нет никакой утечки во время впрыска (рис. 4A). Пусть эпоксидной затвердеть прежде.
2. Вставьте держатель Пипетки стеклянные капиллярные иглы. Закрепите его на месте с помощью круговой стягивающий винт и машина конуса (рис. 4В). 400 мкм внутренний диаметр (внешний диаметр 650 мкм) стекла капиллярного иглы был использован для этого протокола. Другие материалы капиллярного иглы (например., металл) и диаметров могут быть использованы, но может потребовать внесения изменений в дизайн сетки электроники для обеспечения injectability.
   Примечание: Капиллярные иглы от 150 мкм до 1,17 мм внутренний диаметр (250 мкм до 1,5 мм Наружный диаметр) были использованы в нашей лаборатории. Инъекции через небольшие иглы может поощряться, сделав угол пересечения между поперечной и продольной Су-8 сетка элементов более острый, уменьшение ширины элементов сетки Су-8, используя тоньше Су-8 и с помощью грубее (т.е., более крупные ячейки) сетка структуру. Фотошаблонов для сетей, предназначенных для мелких капиллярных иглы доступны по запросу или из ресурсов сайта, meshelectronics.org. Также доступны коммерчески стеклянные капиллярные иглы с внутренним диаметром 400 мкм и наружный диаметр 550 мкм. Эти сокращения острого ткани ущерб от инъекций при сохранении совместимости с сетки, требующих внутренний диаметр 400 мкм, но они не были использованы для исследований, описанных здесь.
3. Прикрепите шприц 1 мл на выходе стороне держателя пипетку с помощью 2 — 4 см длины капиллярной трубки.
4. Вставьте иглу капиллярного стекла в 100-мл стакан PBS, содержащих электроника сетки. Поместите конец иглы вблизи колодки ввода-вывода сетки электроники датчика и вручную отозвать шприц нарисовать сетку электроника зонд в иглу (рис. 5 и дополнительного видео 1).
   Примечание: Колодки ввода-вывода, стволовых объединению региона, и сетка устройство региона легко идентифицировать по невооруженным глазом, когда сетка электроники датчики подвешены в растворе. Это позволяет однозначно загрузки сетки электроники в иглы с правильной ориентации.
5. Соединительными поршень шприца в то время как все еще погружен в солевой раствор для регулировки позиции сетки электроники в течение иглы.
   Примечание: Идеальное позиционирование-регионе непревзойдённые возможности раширения сетки устройство рядом с конца иглы максимально. Эта конфигурация минимизирует объем жидкости, которые будут вводиться в мозг гарантируя что сначала вводят регионе устройства и прокладки ввода-вывода последнего.
6. Аккуратно отсоедините капиллярной трубки от розетки стороне держателя пипеткой. Отсоедините его медленно, чтобы избежать создания всасывания силой, которая может изменить позицию сетки электроники в течение иглы.

3. Стереотаксическая инъекции сетки электроники в живой мыши мозга

Примечание: Мышей были под наркозом внутрибрюшинной инъекцией смесью кетамина и 1 мг/кг dexdomitor 75 мг/кг. Степень анестезии была проверена с помощью метода щепотку ног до начала операции. Температура тела сохранялся, поместив указатель мыши на 37 ° C гомойотермных одеяло под наркозом. Стерильную методику был реализован для хирургии, включая но не ограничиваясь автоклавирования все металлические хирургические инструменты, за 1 ч до использования, используя стерилизованное перчатки, используя стерилизатор горячей шарик всей операции, поддержании стерильных поля вокруг хирургической сайта, дезинфекции пластиковых инструментов с 70% этанол и депилируемое волосистой части головы с йодофора до разрез был нацелен кожи. Для выживания операций, после завершения операции мазь antiobiotic был применен вокруг раны, и мышь была возвращена в клетку, с 37 ° C, грелку. Мышь не остались без присмотра, до тех пор, пока они достаточно сознание для поддержания грудной recumbency. Мышей были даны бупренорфин анальгезии через внутрибрюшинной инъекции в дозе 0,05 мг/кг массы тела каждые 12 ч до 72 ч после операции. Мышей были изолированы от других животных, после операции. Мышей были умерщвлены через либо внутрибрюшинного введения Пентобарбитал в дозе 270 мг/кг массы тела или через transcardial перфузии (см. шаг 6.1). Следователи может относиться к Гейгер, и др. ³⁰, Кирби, и др. ³¹и Gage, и др. ³² для подробной информации о грызунах стереотаксической хирургии.

1. Анестезировать мыши и исправить ее в стереотаксической рамы.
2. Применить глазные смазки к мыши глаза для предотвращения сухости под наркозом.
3. Используйте стоматологические дрели и Стереотаксическая рама для открытия краниотомии координатами желаемого на черепе. Откройте второй краниотомии от укола для вставки винт заземления из нержавеющей стали или проволоки.
4. Исправьте зажимной субстрат для черепа с стоматологического цемента. Вырежьте примерно 1 мм широкий разрыв в субстрат для повышения надежности складывающиеся шаг позже в процедуре.
   Примечание: Плоский гибкий кабель (FFC) сократить хорошо работает «L»-формы (рис. 7A), хотя многие материалы будут работать до тех пор, как они правильной толщины для 32-канальный нулевой вставки (ZIF) разъем (предназначены для 0,18 ± 0,05 мм толщиной кабелей).
5. Смонтируйте держатель пипетку с иглой, содержащие сетки электроники на стереотаксического раме с помощью правый конец зажима (рис. 4 c и рис. 6А).
6. Придаем выходе стороне держателя Пипетка 5 мл шприц, закреплены в шприц с помощью насоса (рис. 6 d) приблизительно 0,5 – 1 м Длина капиллярной трубки.
   Примечание: Убедитесь, что есть никаких пузырей в капиллярной трубке перед подключением его к держателю пипеткой. Пузыри могут прервать поток во время инъекции и предотвратить гладкой, контролируемые поставки сетки электроники.
7. Используйте Стереотаксическая рама позиционировать кончик иглы в необходимом месте начиная в головном мозге.
   Примечание: Зонды электроники сетки, используемые здесь спроектированы с записи электроды распространиться длиной ОК. 2 мм и с первым электродом расположен ОК. 0,5 мм от края начала сетки электроники (левый край в Рисунок 3А). По этой причине стереотаксического координаты должны выбираться таким образом, что начальное расположение составляет 0,5 мм глубже, чем мозг области интереса. Распространение и расположение электродов записи в пределах сетки электроники может быть выбрано свободно во время процесса проектирования маски и должен быть выбран, чтобы электроды записи охватывают мозга регион(ы) интерес как они вводят вдоль их стереотаксического траектории.
8. Установите камеру (Рисунок 6B) для отображения в верхней части сетки электроника зонд в стеклянных иглу. Некоторое программное обеспечение позволяет пользователю рисовать линии на экране, чтобы пометить в исходное положение сетки электроники.
9. Инициировать процесс, установив шприцевый насос для низкой скорости и нажав Пуск. 10 мл/ч это типичный начальную скорость потока для 400 мкм внутренний диаметр капилляра иглы. Постепенно увеличивать скорость потока, если сетка электроники зонд не двигаться внутри иглу.
   Примечание: Важно свести к минимуму объем жидкости вводят в мозг, как это может повредить ткани, окружающие место инъекции. Наилучшие результаты достигаются с объемами впрыска менее 25 мкл на 1 мм длины введенного сетки. Идеальные значения составляют меньше половины этого объема; в нашей лаборатории мы вводим обычно 10 – 50 мкл за длиной 4 мм вводят сетки.
10. Как сетка электроники зонд начинает перемещаться в пределах иглы, используйте Стереотаксическая рама отозвать иглы с той же скоростью, с которой время вводится зонд электроники сетки, используя отмеченные исходное положение сетки электроники в качестве руководства.
    Примечание: Эта процедура, называется в поле зрения (FoV) инъекционного метода²⁵, позволяет для точной доставки сетка электроники целевых мозга регионе без комкая или дислокации. Часто можно уменьшить скорость потока после того, как зонд электроники сетка начинается перемещение внутри иглу. В нашей лаборатории для преодоления статического трения между сеткой и стены капилляра иглы часто необходимы расхода 20-30 мл/ч, но скорость затем можно уменьшить до 10 мл/ч после инъекции процесс был начат. Скорости потока и объемов закачки обычно меньше для меньшего диаметра капилляров иглы.
11. По-прежнему течет засоленных и втягивания иглы, до тех пор, пока игла покинувшую черепа. Остановите поток шприцевой насос.

4. входные/выходные интерфейсы

Примечание: на данный момент, сетка электроники зонд был вставлен из желаемого отправной точкой в головном мозге по выбранной траектории. Иглы были отозваны и чуть выше краниотомии с сеткой, который соединяет электроника охватывающих от мозга иглы и ввода/вывода колодки все еще внутри иглу (Рисунок 7B). Этот раздел использует печатная плата (PCB; Рисунок 7, рис. 8) для интерфейса к зонду электроники сетки. PCB соединяет соединитель ZIF разъемом стандартной 32-канальный усилитель через изолирующие подложки, становит руководитель этап для нейронных записи экспериментов. PCB настраивается для размещения различных головы этап конфигурации. Наш дизайн файлы доступны по запросу или из ресурсов веб-сайта, meshelectronics.org и может быть использована для покупки ПХД недорого от поставщиков услуг производство и монтаж PCB.

1. Используйте Стереотаксическая рама тщательно направлять иглы к ФСГ зажима субстрата и через разрыв, пропуская раствор с шприцевый насос для создания временной резерв в электронике сетки соединения (рис. 7 c).
2. После того, как игла находится выше зажима субстрата и через разрыв, возобновите поток быстрыми темпами для извлечения электроника сетки ввода-вывода колодки на зажимной подложку (рис. 7 d).
3. С помощью пинцета и пипетки ди, согните ввода-вывода колодки ОК. 90° угол как недалеко от первого ввода-вывода pad максимально.
   Примечание: Изгиба необходимо позволить колодки вставляется в разъем ZIF на ПХД на последующем шаге. Разъем ZIF является точно такой же ширины, как 32 прокладки ввода/вывода зонда электроники сетки, поэтому несовершенны 90° изгиб или изгиб не происходит прямо перед первым pad ввода-вывода, приведет в том отрезать ввода-вывода колодки (левой колодки в рис. 7е).
4. После ввода-вывода колодки выровняны, развернул и под углом 90° к стеблю сетки, сухой их в месте с аккуратно течет сжатого воздуха.
   Примечание: Сетка, электроника зонды с менее чем 32 каналов можно сопряжена для с Правлением же 32-канальный интерфейс. Например наши лаборатории часто использует 16-канальный сетки, которую электроники датчики с 32-канальный ПХД. Это обеспечивает дополнительное пространство в разъеме ZIF, облегчая взаимодействие, и дополнительные каналы неконтактные легко идентифицируются как разомкнутыми цепями с помощью импеданс, тестирование во время записи сессий.
5. Вырежьте зажимной субстрата на прямой край приблизительно 0,5 – 1 мм от края колодки ввода-вывода. Также отрезать лишние части зажимной субстрата, который будет препятствовать вставки в разъем ZIF ПХД установлен 32-канальный (Рисунок 7F).
6. Вставьте разъем ZIF на печатной плате ввода/вывода колодки и закройте защелку (Рисунок 7G). Использование измерения электроника измерить сопротивление между каналами и земли винт для подтверждения успешного сопряжения. Если значения импеданса слишком высоки, фиксатор разъема ZIF, отрегулировать вставки и повторного тестирования до подтверждения успешного подключения.
7. Обложка разъем ZIF и подвергаются сетки электроника межсоединений с стоматологического цемента для защиты. Флип КСП на разрыв в субстрат и исправить ПХД с цементом на мыши черепа (Рисунок 7 H).
   Примечание: Изгиб ФСГ в разрыв снижает механические штамм, который иногда может привести к поломке сетки, который соединяет электроники.
8. Разрешить цемент твердеть, превращая КСП в надежный, компактный головы сцена для взаимодействия в ходе последующих сессий (Рисунок 7I).

5. нейронные записи экспериментов

1. Поместите курсор мыши в tailveiner или другие фиксатор³³. Вставьте стандартный усилитель предусилитель ПХД на голову этап ПХД. Используйте отдельный кабель для заземления ссылка винт.
2. Для сдержанной записей Оставьте мышь в фиксатор. Запись данных с использованием системы сбора данных для периода желаемого времени (рис. 8A).
3. Для свободно перемещающихся записи, отпустите кнопку мыши от фиксатор после вставки предусилитель ПХД и ссылка винт заземления. Запись для нужной длины с помощью системы сбора данных, в то время как мышь ведет себя свободно времени (Рисунок 8B).
4. В конце сессии записи поместите мышь обратно в фиксатор, при необходимости. Выньте провод заземления и предусилитель, затем отпустите кнопку мыши, вернуться к своей клетке и вернуть его в объекте животных до следующей сессии записи.

6. гистологические секционирование, окраски и обработки изображений

1. Подождите до желаемого времени впрыск, затем анестезировать мышь и transcardially perfuse с формальдегидом. Удаление, замораживание и cryosection мозг ломтиками толщиной 10 мкм. Подробный протокол по иммуногистохимия и cryosectioning грызунов мозговой ткани можно найти в Evilsizor, и др. ³⁴.
   Примечание: Мозговой ткани, содержащие сетки электроники можно фиксированной и секционного нормально, даже несмотря на то, что внутри остались мониторинга электроники. Это уникальная возможность по сравнению с обычными нейронных зонды, которые должны быть удалены перед секционирование и поэтому могут изменять ткани или сделать его трудно анализировать интерфейс зонда ткани.
2. Промойте разделов ткани замороженного мозга 3 раза в ПБС.
3. Заблокируйте разделы в раствор 0,3% Тритон X-100 и 5% козьего сыворотки в однократном ПБС. Пусть сидят за 1 ч при комнатной температуре.
4. Инкубируйте секции с решением первичных антител. Основное антитело решения, используемые здесь были кролик анти NeuN (разбавления 1: 200), мышь анти Neurofilament (разбавления 1: 400) и крыса анти СВМС (разбавления 1: 500) с 0,3% Тритон X-100 и 3% козьего сыворотки. Инкубируйте на ночь при 4 ° C.
5. Промывайте в разделах 9 раз всего 40 мин с ПБС.
6. Инкубируйте секции мозга с решением вторичных антител. Вторичное антитело решения, используемые здесь были Alexa Fluor 488 коза анти кролик (разбавления 1: 200), Alexa Fluor 568 коза анти мыши (разбавления 1: 200) и Alexa Fluor 647 коза анти крыса (разбавления 1: 200). Инкубируйте в разделах 1 ч при комнатной температуре.
7. Промывайте в разделах 9 раз всего 30 мин с ПБС.
8. Смонтируйте разделы на слайдах стекла с coverslips с помощью antifade mountant. Оставьте слайды в темноте для по крайней мере за 24 часа до изображений.
9. Изображения слайдов с помощью конфокального микроскопа с помощью 488 нм, 561 Нм и 633 нм лазеры как источники возбуждения для Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 и Alexa Fluor 647, соответственно. Используйте дифференциальной помехи контраст (DIC) для изображения сетки электроники на же микроскоп для последующего наложения изображений и анализа.

Результаты

Результаты будут меняться в зависимости от видов животных в исследовании, целевых мозга регионе, время, прошедшее после инъекции, количество острой ущерб, причиненный во время инъекции и успех операции ввода-вывода, сопряжения процедуры, среди прочих факторов. Единичного пики активности может не появиться до 1 дня до 1 недели после инъекции и Спайк амплитуд может меняться до 4 – 6 недель (в случае 150 мкм внутренний диаметр иглы). На рисунке 9 показано репрезентативных электрофизиологических данных от 32-канальный сетки электроника зонд вводят в гиппокампе и первичная соматосенсорная кора взрослого мужчины C57BL/6J мыши. Приблизительно 300 мкВ амплитуды местных потенциалов поля (LFPs) были записаны на все 32 каналов и единичного пики активности был записан на 26 каналов. LFPs и изолированных шипы оставался аналогичные между 2 и 4 месяцев, предлагая очень стабильный интерфейс между записи электроники и нейронов за этот период длительного времени. На рисунке 10 показано, представитель результаты гистологических секционирование и иммуноокрашивания мозговой ткани, содержащие сетки электроника 1 год после инъекции. Пятнать для NeuN, маркера для нейронных somata и neurofilament, маркер для нервные аксоны, раскрывает практически нет потери плотности ткани в месте инъекции, подразумевая бесшовные взаимодействия между электроники и мозг ткани сетка. Пятнать для СВМС (маркер для астроциты) далее показывает вблизи фоновый уровень астроциты вокруг сетки электроника, указав, что его присутствие вызывает мало хронический иммунный ответ.

Рисунок 1: шаги в шприц инъекционные сетка электроника эксперимент. Этот протокол описывает все ключевые шаги в типичной грызунов нейронных запись эксперимента с использованием сетки электроники. Эксперименты обычно влечет за собой, в порядке осуществления, (1) изготовление сетки электроники, (2) Загрузка сетки электроники в капиллярной иглы, (3) стереотаксического инъекций в мозг, (4) электрического ввода-вывода, взаимодействие сетки сетка электроники Электроника, (5) записи сдержанный или свободно движущихся и (6) сетка/ткани секционирование и пятнать для гистологии. В некоторых исследованиях может потребоваться только гистология данных, в этом случае можно пропустить шаги (4) и (5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: схема, изображающие порядок изготовления электроники plug-and-play сетки в регионе непревзойдённые возможности раширения устройства (верхняя строка), стволовых приближающую региона (средний ряд) и ввода/вывода региона (Нижняя строка). (A) с PL маска-1 для определения нижней пассивирования слой каждого зонда электроника plug-and-play сетки узором Су-8 негативного фоторезиста (красный). Кучность (B) с PL маска-2, термическое испарение и металлические старт определяют Au соединения и ввода-вывода колодки (золото). (C) патронирования маска-3 PL, испарением электронным пучком и металлические старт определить Pt электродов (синий). (D) с PL маска-4 для определения верхнего пассивирующего слоя узором Су-8 негативного фоторезиста (красный). Отверстия в Су-8 остаются на каждый электрод Pt и панель ввода-вывода. (E) A завершена сетки электроника зонд с указанием местоположений, расширена в верхней, средний и нижней строки пунктирной коробки. Photomask дизайн файлы доступны по запросу от авторов или от ресурсов сайта, meshelectronics.org. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: фотографии и изображения оптический микроскоп plug-and-play сетка электроника. (A) плиткой изображения оптический микроскоп шприц инъекционные сетки электроника зонда с вывода plug-and-play. Зонд был образ после завершения изготовления шаги на рисунке 2 , но до выхода из субстрата Ni покрытием. Пунктирной коробки соответствуют слева направо к разделам непревзойдённые возможности раширения устройства региона, стволовых и ввода-вывода региона усиливается в C, D и Е, соответственно. Шкалы бар = 1 mm. (B) фотография 3 дюймовый Si пластин, содержащий 20 завершена сетки электроники датчики. Шкалы бар = 20 mm. (C) оптический микроскоп изображение 20 мкм диаметром Pt записи электродов в регионе непревзойдённые возможности раширения устройства. Шкалы бар = 100 µm. (D) оптический микроскоп изображение высокой плотности Au межсоединений в регионе стволовых. Каждый соединительный Au электрически изолированы и соединяет один электрод Pt площадку одной операции ввода-вывода. Шкалы бар = 100 µm. (E) оптический микроскоп изображение прокладки ввода-вывода. Каждая панель состоит из Складная сетка региона и непрерывной тонкопленочных области, расположен на стволе. Non проведение Су-8 ленты Соедините части колодки вместе, чтобы помочь сохранить выравнивание сетки. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Ассамблея аппарата для проведения капиллярного иглы во время инъекции. (A) фотография компонентов аппарата. Компоненты включают в себя (1) иголку стеклянные капиллярные, (2 держатель пипетки, (3 круговой винт крепления держателя пипетки и шайбу (4 конуса для держателя пипеткой. Пункты (2) через (4) поставляется с пипеткой держателя. Стрелка показывает на выходе из пипетки держатель, который необходимо быть склеены закрытые с эпоксидной. (B) фотография владельца пипетки после сборки и вставки стеклянные капиллярные иглы. Добавлен эпоксидной смолы видна на верхнем выходе держателя пипетки (отмечен стрелкой) и капиллярной трубки соединяет держателя пипетки к шприцу (не показан). (C) фотография держателя пипетки и капиллярной иглы после привязанность к Стереотаксическая рама с струбциной правый конец. Масштаб гистограммы являются 1 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Загрузка сетки электроники в стеклянных иголок. (A) схематическая иллюстрация процедуры загрузки для электроники plug-and-play сетки. Стеклянный иглу позиционируется в конце ввода/вывода зонда электроника сетки пока она приостановлена в растворе. Поршень шприца втягивается затем вручную рисовать в зонд электроники сетки. Идеальное позиционирование-регионе непревзойдённые возможности раширения устройство только внутри конца иглы. Фотографии (B), (A) соответствующие зонда электроники сетки загружаются в стеклянных иглу. Масштаб баров = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: схема станции стереотаксической хирургии. Моторизованных Стереотаксическая рама (A) с прилагаемый пипеткой держатель используется для позиционирования иглы в желаемой мозга регионе. Положение иглы и электроники загружены сетки контролируются с объектива и придает камеры (B) и отображаются на компьютере (C). Шприцевой насос (D) потоки точные объемы физиологического раствора через иглу, позволяя для точной, контролируемых инъекции сетки электроники в регионе желаемого мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: ввода-вывода Plug-and-play, процедура сопряжения. (A) FFC зажима субстрат обеспечивается с стоматологического цемента, прилегающих к краниотомии. (B) Plug-and-play сетки электроника stereotaxically вводят в регионе желаемого мозг с помощью метода ПЗ. (C) игла, с ввода-вывода колодки сетки электроника зонд до сих пор внутри, перемещен над ФСГ зажима субстрата. (D) поток возобновляется через иглу извлечь прокладки ввода-вывода на ФСГ зажима субстрата. (E) операций ввода-вывода подушечки изогнутых 90 ° относительно ствола, развернули проведение стороной вверх и сушат в месте. (F) ФСГ субстрат обрезается с ножницами прямолинейных ОК. 0,5 мм от края колодки ввода-вывода. Вырезать избыточное субстрат прочь, чтобы разрешить вставку в разъем ZIF 32-канальный. (G) операций ввода-вывода колодки вставляются в разъем ZIF 32-канальный, установленный на пользовательских ПХД. Разъем ZIF является запертом закрытой сделать контакт с колодками ввода-вывода. Цементированный (H) Защелка закрыта, PCB переворачивается на череп, и PCB фиксируется на месте с стоматологического цемента. (я) PCB образует компактный headstage с разъемом стандарта усилитель для легко взаимодействие во время записи сессий. Масштаб баров = 1 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: сдержанные и свободно движущихся записей. (A) фотография мужчины C57BL/6J мыши в фиксатор во время сеанса записи. 32-канальный предусилитель ПХД были вставлены в разъем Стандартный усилитель. (B) фотография же мышь с 32-канальный предусилитель ПХД во время свободно движущихся запись эксперимента. Масштаб баров = 1 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9: результаты представитель нейронных записи. (A) представитель LFP тепловые карты от 32-канальный сетка электроники датчики, вводят в гиппокампе мыши и соматосенсорной коры. Данные были записаны в то время как мыши свободно изучить его клетку на 2 месяца (вверху) и впрыск 4 месяца (внизу). Амплитуда LFP цветом согласно панель цвета справа. ВЧ-отфильтрованных следы (черный) пики активности накладываются на спектрограмме для каждого из 32 каналов. (B) шипы изолированные после сортировки данных на диаграмме в (A). Единичного пики активности был обнаружен на 26 каналов 32 впрыск 2 месяца (вверху) и 4 месяца впрыск (внизу). Номера выше каждый кластер шипы соответствуют номерам каналов в (A). Эта цифра была изменена от Фу, и др. ²⁸. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 10: результаты представитель Гистология. (A) схема, иллюстрирующая ориентацию сетки электроники в течение горизонтальный (средняя группа) и сагиттальной (Нижняя панель) срезы мозга. (B) флуоресценции Микроскоп изображение фрагмента 10 мкм толщина коры мозга один год после введения зонда электроника 16-канальный сетки. Срез был immunostained для NeuN (зеленый). (C) же срез мозга immunostained для neurofilament (красный). (D) же immunostained срез мозга для СВМС (голубой). (E) A составное изображение (b) – (D) показаны электроника/ткани сетка интерфейс с метками NeuN (зеленый), neurofilament (красный), СВМС (голубой) и сетка электроника (синий). Масштаб баров = 100 мкм. Эта цифра была изменена от Фу и др. ²⁷. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные видео 1: повторил погрузки и инъекции сетки электроники в раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Все этапы изготовления и использования сетки электроники являются важными, но некоторые имеют особенно важное значение. Прежде чем отпустить сетки электроники от их пластин, важно для окисления поверхности сделать сетки легко приостановлено в водном растворе (шаг 1.6.1). Если этот шаг пропускается, сетки обычно плавают на поверхности воды, что делает их трудно загрузить в иглы, и если они могут быть загружены, они часто придерживаться стороны стекла иглы, требующих больших объемов (> 100 мкл) для инъекций. Отказ для окисления поверхности до выпуска, поэтому, обычно означает, что нельзя использовать сетки и изготовления должны быть повторно выполняется с самого начала. Еще один важный шаг изгиб сетки электроники «остановить» ~ 90 ° во время ввода-вывода, взаимодействие (шаг 4.3). Если угол меньше 90°, то все 32 колодки ввода-вывода не помещается в разъем ZIF; Некоторые должны будут быть отрезаны конца, чтобы разрешить вставку, сокращение числа подключенных электродов. Процесс также должно быть сделано мягко для предотвращения ствола от взлома.

Дизайн сетки электроники можно настроить для различных приложений, изменив фотошаблонов и используя ту же процедуру изготовления, изложенные на рисунке 2. Например в то время как зонды электроники сетки, используемый для записи данных на рисунке 9 были разработаны для иметь 32 запись электродов охватывают мыши гиппокампа и первичной соматосенсорной коры, размещение электродов внутри непревзойдённые возможности раширения сетки может быть выбранный целевой практически любого регион(ы) мозга, или больше электродов для стимуляции могут быть включены²⁷. Та же процедура структуры и изготовление простой сетки, сохраняются, но размещение электродов и дизайн корректируются для удовлетворения потребностей исследования. Следователи следует использовать осторожно, однако и всегда проверить, что изменение конструкции могут быть легко введены через предполагаемой иглы. Небольшие изменения для гибки механики и электроники сетки может иметь существенные последствия для injectability. Одним из таких примеров является что 45° угла между продольной и поперечной Су-8 ленты дает зонд электроника сетки, которые могут быть введены в соответствии, но под углом в 90° приводит в одном, что мнет и забивает иглы²¹.

Измерение импеданса электродов записи полезен для устранения неполадок. 20-мкм диаметр круговой Pt электрод должен иметь импеданс величины около 1 MΩ когда измеряется на частоте 1 кГц в естественных условиях или в 1 x PBS²⁹. Импеданс значительно больше, чем это предполагает, что электрод является не подвергаются, как может случиться, если она загрязнена с остатками фоторезиста или не электрически подключен. Последний может произойти, если, например, пыль на фото маска во время ком, который соединяет результаты в разрыв в АС, или если один из колодки сетки ввода-вывода не связался по контактов разъема ZIF во время интерфейс ввода/вывода. Импеданс величины примерно половину ожидаемое значение свидетельствует о том, что канал может быть замкнуты в соседнюю, создавая цепи два электрода импедансов параллельно друг другу. Измеренное сопротивление значения действуют как руководство во время устранения неполадок; в сочетании с оптической микроскопии сетки электроники зондов, источник проблемы можно обычно выявлены и исправлены соответственно в следующий изготовления запустить или попытка интерфейс ввода/вывода.

Использование сетки шприц инъекционные электроники для острой исследования ограничен в том, что обычно единичного пики активности не наблюдается до 1 недели поста инъекций²⁷, хотя недавняя работа (Неизданное) показывает, что эта проблема легко преодолеть. Ключевыми факторами, определяющими времени, необходимого для видеть пики активности mesh дизайн, объем жидкости вводят в мозг наряду с сеткой электроники и диаметр иглы, используемые для инъекций, как они влияют на степень повреждения тканей во время инъекции и скорость исцеления. Объемы большие инъекции может потребоваться, если сетка электроника не относиться с кислородной плазмы до выхода в Ni etchant; то есть если сетка не гидрофильные, он может придерживаться стекла иглы. Иногда сетки имеют дефекты, которые приводят к изгибу механики, которые делают их трудно внедрить. Во время загрузки сетки электроники, важно проверить, что сетки движутся легко и плавно в пределах иглы (как показано в дополнительных видео 1). Если нет, то должны использоваться различные сетки электронный зонд. Лучшие результаты для бесшовных Нейронные взаимодействия будет достигаться с идеальной инъекции тома 10-50 мкл на введенный сетка длиной 4 мм. Более недавние результаты с тонкой сетки электроники датчики вводят или меньшего диаметра капилляров иглы (как малые, как внутренний диаметр 150 мкм, диаметр 250 мкм) показывают, что единое целое пики могут наблюдаться от вскоре после инъекции (острый измерения) через более длительное время. Маска дизайн файлы для этих тонкой структуры сетки доступны по запросу или из ресурсов веб-сайта, meshelectronics.org. Мы оценить общую доходность наших в vivo сетки инъекции процедур с использованием иглы (наружный диаметр 650 мкм) внутренний диаметр 400 мкм составляет около 70%, хотя урожай ближе к 80 – 90% нашей более поздние работы с 150 мкм внутренний диаметр (250 мкм наружный диаметр ) иглы. Наиболее распространенные причины неудачи являются (1) что сетка не вводите гладко, что приводит к отек мозга с неожиданно большим инъекции томов в мозг, (2) сетка обрыва во время ручной манипуляции требуется ввода-вывода, интерфейсы, процедуры и (3) кровотечение из повреждения кровеносных сосудов во время инъекции. Повреждение кровеносных сосудов во время инъекций встречается редко (причиной менее 10% сбоев) и может быть сокращен еще с помощью изображений руководствоваться хирургии. Мы также отмечаем, что повреждение кровеносных сосудов является общее ограничение всех процедур с участием проникновения в ткани мозга, включая инъекции вирусных частиц для transfection, имплантацией жесткой мозга зондов и инъекции сетки электроники.

Сетка электроники датчики способны стабильно записи и отслеживать же отдельных нейронов на по крайней мере месяца в год сроков и вызывают почти нет хронической иммунного ответа, как показано на рисунке 9 и Рисунок 10, соответственно. Это представляет собой значительное преимущество по сравнению с Конвенцией глубиной электродов, которые часто страдают от снижения Спайк амплитуд, нестабильных сигналов и хронического воспаления в течение долгосрочного записи экспериментов^{14, 15}. Кроме того, электроника сетки имеют то преимущество, что они могут быть оставлены в тканях при резании гистологические, окрашивание, и изображений, в отличие от обычных зондов, которые являются слишком жесткими и поэтому должны быть удалены перед гистологии анализ. Следовательно сетка электроники позволяют уникальную возможность использования Иммуногистохимический анализ именно изучение клеточной среды вокруг каждого сайта записи.

Протокол представил здесь открывается вверх захватывающие новые возможности в неврологии. Метод доставки минимально инвазивных и бесшовной интеграции сетки электроники с ткани мозга минимизирует нарушения нейронных цепей и избегает хронический иммунный ответ, который выиграет большинство видов хронической нейронных записи экспериментов. Способность сетки Электроника для записи и отслеживания же единого нейронов для длительных периодов времени будет особенно интерес для следователей, стремясь соотнести миллисекунды шкала пики активности с месяц годичного процессы, такие как старение, Патогенез заболевания мозга, или мозга развития^16,18. Кроме того, существуют значительные возможности для расширения и настройки этот протокол, например добавление активной электроники голову PCB-сцену, чтобы реализовать функциональность как цифровое мультиплексирование^8,35, Беспроводные коммуникации в^35,,3637и обработки³⁵, совместное инъекций стволовых клеток или полимеры с сетки электроники для помощи в ткани регенерации^{18,38, сигналов 39}и включение нанопроволоки транзисторы field - effect (NW-FETs) в mesh электроники весьма локализованные и многофункциональный мозга зонды^{24,29,40,41 ,42}.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motorized stereotaxic frame	World Precision Instruments	MTM-3	For mouse stereotaxic surgery
512-channel recording controller	Intan Technologies	C3004	A component of the neural recording system
RHD2132 amplifier board	Intan Technologies	C3314	A component of the neural recording system
RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable	Intan Technologies	C3213	A component of the neural recording system
Mouse restrainer	Braintree Scientific	TV-150 STD	Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.
Si wafers	Nova Electronic Materials		3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats & 6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides.
Photomasks (chrome on soda lime glass)	Advance Reproductions		Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.
AutoCAD software	Autodesk Inc.		Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.
Thermal evaporator	Sharon Vacuum		Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 2000.5 negative photoresist	MicroChem Corp.		Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.
MA6 mask aligner	Karl Suss Microtec AG		Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 developer	MicroChem Corp.		Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.
LOR3A lift-off resist	MicroChem Corp.		Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes
Shipley 1805 positive photoresist	Microposit, The Dow Chemical Company		Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics
MF-CD-26 positive photoresist developer	Microposit, The Dow Chemical Company		To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.
Spin coater	Reynolds Tech		For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.
PJ plasma surface treatment system	AST Products, Inc.		Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Electron beam evaporator	Denton Vacuum		For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.
Remover PG	MicroChem Corp.		Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off
Ferric chloride solution	MG Chemicals	415-1L	A component of Ni etching solution
36% hydrochloric acid solution	Kanto Corp.		A component of Ni etching solution
Glass capillary needles	Drummond Scientific Co.		Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.
Micropipette holder U-type	Molecular Devices, LLC	1-HL-U	Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection
1 mL syringe	NORM-JECT®, Henke Sass Wolf		Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles
Polyethylene intrademic catheter tubing	Becton Dickinson and Company		Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm
5 mL syringe	Becton Dickinson and Company		Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo
Eyepiece camera	Thorlabs Inc.	DCC1240C	Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras	Thorlabs Inc.		Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics
EXL-M40 dental drill	Osada	3144-830	For drilling the craniotomy
0.9 mm drill burr	Fine Science Tools	19007-09	For drilling the craniotomy
Hot bead sterilizer 14 cm	Fine Science Tools	18000-50	Used to sterlize surgical instruments
CM1950 cryosectioning instrument	Leica Microsystems		Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.
0.3% Triton x-100	Life Technologies		Used for histology
5% goat serum	Life Technologies		Used for histology
3% goat serum	Life Technologies		Used for histology
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab177487	Used for histology
Mouse anti-Neurofilament	Abcam	ab8135	Used for histology
Rat anti-GFAP	Thermo Fisher Scientific Inc.	PA516291	Used for histology
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific Inc.	P36930	Used for histology
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich Corp.	P6407-5MG	Molecular weight = 70-150 kDA
Right-angle end clamp	Thorlabs Inc.	RA180/M	Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame
Printed circuit board (PCB)	Advanced Circuits		Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org
32-channel standard amplifier connector	Omnetics Connector Corp.	A79024-001	Component assembled onto the PCB
32-channel flat flexible cable (FFC)	Molex, LLC	152660339	Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector
32-channel zero insertion force (ZIF) connector	Hirose Electric Co., LTD	FH12A-32S-0.5SH(55)	Component assembled onto the PCB